Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma

Riepilogo

Questo documento introduce il metodo per sviluppare, caratterizzare e tracciare in tempo reale le metastasi tumorali nel modello di neuroblastoma zebrafish, in particolare nella linea transgenica zebrafish con sovraespressione di MYCN e LMO1, che sviluppa metastasi spontaneamente.

Abstract

Il pesce zebra è emerso come un importante modello animale per studiare le malattie umane, in particolare il cancro. Insieme alle robuste tecnologie transgeniche e di editing del genoma applicate nella modellazione del pesce zebra, la facilità di manutenzione, la produttività ad alto rendimento e la potente imaging dal vivo rendono il pesce zebra un prezioso sistema modello per studiare metastasi e basi cellulari e molecolari alla base di questo processo in vivo. Il primo modello di metastasi del neuroblastoma del pesce zebra (NB) è stato sviluppato sovraesprimendo due oncogeni, MYCN e LMO1, sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). MyCN e LMO1 co-sovraespressi hanno portato alla riduzione della latenza e all'aumento della penetranza della neuroblastomagenesi, nonché all'accelerazione delle metastasi a distanza delle cellule tumorali. Questo nuovo modello ribadisce in modo affidabile molte caratteristiche chiave della NB metastatica umana, incluso il coinvolgimento di alterazioni genetiche clinicamente rilevanti e associate a metastasi; sviluppo naturale e spontaneo di metastasi in vivo; e siti conservati di metastasi. Pertanto, il modello zebrafish possiede vantaggi unici per sezionare il complesso processo di metastasi tumorali in vivo.

Introduzione

Zebrafish è stato ampiamente utilizzato e applicato a diverse aree di ricerca, in particolare nel cancro. Questo modello offre molti vantaggi, come la sua riproduzione robusta, la manutenzione economica e la visualizzazione versatile della crescita tumorale e delle metastasi, che rendono il pesce zebra un potente strumento per studiare e studiare le basi cellulari e molecolari della tumorigenesi e delle metastasi. Nuove tecniche per la mappatura del genoma su larga scala, la transgenesi, la sovraespressione o il knockout dei geni, il trapianto di cellule e gli schermi chimici hanno aumentato immensamente la potenza del modello di pesce ^zebra1. Negli ultimi anni, molte linee di zebrafish sono state sviluppate per studiare la tumorigenesi e le metastasi di una varietà di tumori umani, tra cui, ma non solo, leucemia, melanoma, rabdomiosarcoma e carcinoma epatocellulare2,3,4,5. Inoltre, il primo modello di neuroblastoma (NB) di zebrafish è stato generato sovraesprimendo MYCN, un oncogene, nel sistema nervoso simpatico periferico (PSNS) sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). Con questo modello, è stato ulteriormente dimostrato che l'ALK attivato può sinergizzare con MYCN per accelerare l'insorgenza del tumore e aumentare la penetranza tumorale in ^vivo6.

NB deriva dal lignaggio simpatico-surrenale delle cellule della cresta neurale ed è un tumore altamente metastatico nei ^bambini7. È responsabile del 10% dei decessi correlati al cancro ^pediatrico8. Ampiamente metastatizzato alla diagnosi, l'NB può essere presentato clinicamente come tumori che hanno origine principalmente lungo la catena dei gangli simpatici e del midollo surrenale di ^PSNS9,10. L'amplificazione di MYCN è comunemente associata a scarsi esiti nei pazienti ^nb11,12. Inoltre, LMO1 è stato identificato come un gene critico di suscettibilità NB nei casi ad alto ^rischio13,14. Gli studi hanno scoperto che la coespressione transgenica di MYCN e LMO1 nel PSNS del modello zebrafish non solo promuove l'insorgenza precoce di NB, ma induce anche metastasi diffuse ai tessuti e agli organi che sono simili ai siti comunemente osservati nei pazienti con ^NB13 ad alto rischio. Molto recentemente, un altro fenotipo metastatico di NB è stato osservato anche in un nuovo modello di zebrafish di NB, in cui sia MYCN che Lin28B, che codificano per una proteina legante l'RNA, sono sovraespressi sotto controllo del promotore dβh16.

L'approccio transgenico stabile nel pesce zebra è spesso usato per studiare se la sovraespressione di un gene di interesse potrebbe contribuire al normale sviluppo e alla patogenesi della ^{malattia14,15}. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per dimostrare l'importanza di più geni e percorsi per la tumorigenesi NB6,16,17,18,19,20. Questo articolo introdurrà come è stata creata la linea transgenica del pesce che sovraesprime sia MYCN che LMO1 nel PSNS e come è stato dimostrato che la cooperazione di questi due oncogeni accelera l'insorgenza della tumorigenesi NB e delle metastasi13. In primo luogo, la linea transgenica che sovraesprime EGFP-MYCN sotto controllo del promotore dβh (linea MYCN designata) è stata sviluppata iniettando il costrutto dβh-EGFP-MYCN in uno stadio unicellulare di embrioni AB wild-type (WT), come precedentemente ^{descritto6,17}. Una linea transgenica separata che sovraesprime LMO1 nel PSNS (linea LMO1 designata) è stata sviluppata coniettando due costrutti di DNA, dβh-LMO1 e dβh-mCherry, in embrioni WT allo stadio di una ^cellula13. È stato precedentemente dimostrato che i costrutti a doppio DNA coiniettati possono essere cointerificati nel genoma del pesce; pertanto, LMO1 e mCherry sono coespressi nelle cellule PSNS degli animali transgenici. Una volta che gli embrioni F0 iniettati hanno raggiunto la maturità sessuale, sono stati poi superati con pesci WT per l'identificazione di pesci positivi con integrazione transgenica( s). In breve, la prole F1 è stata sottoposta per la prima volta a screening al microscopio fluorescente per l'espressione di mCherry nelle cellule PSNS. L'integrazione germinale di LMO1 nei pesci mCherry-positivi è stata ulteriormente confermata dalla PCR genomica e dal sequenziamento. Dopo aver identificato con successo ciascuna linea transgenica, la progenie di pesci transgenici eterozigoti MYCN e LMO1 è stata incrociata per generare una linea di pesce composta che esprime sia MYCN che LMO1 (designata MYCN; Linea LMO1). MYCN portante tumorale; I pesci LMO1 sono stati monitorati al microscopio fluorescente due volte alla settimana per l'evidenza di tumori metastatici nelle regioni distanti dal sito primario, regione della ghiandola interrenale (IRG, zebrafish equivalente della ghiandola surrenale umana)¹³. Confermare le metastasi dei tumori in MYCN; Sono state applicate analisi LMO1 per pesci, istologiche e immunoistochimiche.

Protocollo

Tutti i metodi di ricerca che utilizzano il pesce zebra e la cura / manutenzione degli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della Mayo Clinic.

1. Preparazione e microiniezione di costrutti transgenici per lo sviluppo della linea LMO1 transgenica zebrafish con sovraespressione in PSNS

1. Per sviluppare il clone di ingresso LMO1-pDONR221 , amplificare la regione codificante di LMO1 umano dal cDNA ottenuto dalla linea cellulare umana utilizzando la PCR.
   1. Effettuare una reazione da 25 μL come descritto qui: 2,5 μL di 10x Taq Reaction Buffer standard, 0,125 μL di Taq DNA Polimerasi, 0,5 μL di 10 mM dNTPs, 2 μL di modello cDNA, 0,5 μL di primer LMO1 ATTB1 in avanti da 10 μM, 0,5 μL di primer LMO1 ATTB2 inverso da 10 μM e 18,875 μL di acqua.
      NOTA: Utilizzare il primer LMO1 ATTB1 in avanti: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' e primer LMO1 ATTB2 inverso: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
   2. Amplificare utilizzando il seguente programma: 1 ciclo di 94 °C, 2 min; seguiti da 30 cicli di (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min) e 72 °C, 7 min.
2. Clonare il prodotto LMO1 PCR nel vettore donatore gateway pDONR221 mediante reazione di ricombinasi ^BP6,13 (frammento PCR + vettore donatore = clone entry-level).
   1. Per una reazione di 10 μL, mescolare 1 μL di prodotto LMO1 PCR purificato (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221 vettore donatore e 6 μL di tampone TE (pH 8,0) con 2 μL di miscela enzimatica BP, incubare per 1 ora a 25 °C e trasformare in E. coli competente TOP10 utilizzando il protocollo del produttore.
   2. Successivamente, distribuire 50-200 μL dal flaconcino di trasformazione su una piastra di agar Luria Brodo (LB) contenente 50 μg/mL di kanamicina e incubare a 37 °C durante la notte.
   3. Selezionare i cloni inoculando una singola colonia in 2-5 mL di LB con 50 μg/mL di kanamicina e coltivando durante la notte (16-18 h) a 37 °C.
   4. Utilizzare 2 mL di coltura batterica durante la notte per l'isolamento del plasmide secondo il protocollo del produttore. Per verificare il plasmide LMO1, inviare il campione di plasmide per il sequenziamento con primer M13-F (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
3. Per generare un clone di ingresso dβh-pDONRP4-P1R, ottenere il prodotto dβh ^PCR6,13 amplificando la regione promotoreria da 5,2 kb utilizzando il clone BAC CH211-270H11 come modello per preparare una reazione da 20 μL come precedentemente descritto nel passaggio 1.1.1. Utilizzare i seguenti parametri del programma PCR: 94 °C, 2 min; 10 cicli di 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 30 cicli di 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min; 68 °C, 4 min (con primer in avanti 5'GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
   CCCCTTTTTAGG-3' e primer inverso 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTG
   TCGTCTTTTGA-3').
   NOTA: a causa dei lunghi modelli di DNA in questo passaggio, garantire l'utilizzo di un sistema PCR appropriato per un'amplificazione PCR accurata.
4. Clonare il prodotto dβh PCR nel vettore donatore gateway pDONRP4-P1R mediante reazione di ricombinasi ^BP6,13 (frammento PCR + vettore donatore = clone entry-level).
   1. Miscelare 1 μL di prodotto dβh PCR purificato (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) di vettore donatore pDONRP4-P1R e 6 μL di tampone TE (pH 8,0) con 2 μL di miscela enzimatica BP in una reazione totale di 10 μL, incubare per 1 ora a 25 °C.
   2. Trasforma in TOP10 competente E. coli secondo il protocollo del produttore. Isolare il plasmide come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.4 e verificare il plasmide sequenziando con primer M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') e M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
5. Generare il costrutto di espressione dβh:LMO1 .
   1. Combinare 1 μL di ciascun clone di entrata (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 e p3E-polyA11) (20 fmole ciascuno), 1 μL (60 ng/μL) di vettore di destinazione modificato con siti di riconoscimento I-SceI e 4 μL di tampone TE (pH 8,0) contenente 2 μL della miscela enzimatica LR ricombinasi. Incubare questa miscela per 1 ora a 25 °C.
   2. Seguendo il protocollo del produttore, trasformare i batteri in TOP10 E. coli chimicamente competente. Isolare il plasmide come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.4 e verificare il plasmide mediante sequenziamento con primer DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') e LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3').
6. Generare un costrutto di DNA dβh:mCherry con un sistema gateway combinando cloni di ingresso di un promotore dβh da 5,2 kb, pME-mCherry e p3E-polyA nel vettore di destinazione modificato contenente siti di riconoscimento I-SceI come menzionato in precedenza nel passaggio 1.5.16. Isolare il plasmide come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.4 e verificare il plasmide mediante sequenziamento con primer DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
7. Linearizzare il costrutto del DNA dβh:LMO1 e il costrutto del DNA dβh:mCherry (con un rapporto 3:1, rispettivamente) in un totale di un volume di reazione di 15 μL con 1 μL di enzima I-SceI (5 U/μL) e 0,75 μL di tampone (10x), e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 4 ore o durante la notte. Assicurarsi che la concentrazione di DNA non superi i 750 ng in reazione.
8. Il giorno successivo e dopo la linearizzazione dei costrutti, aggiungere 0,5 μL di enzima I-SceI fresco (5 U / μL) e 0,5 μL di rosso fenolo allo 0,5% in 5 μL di miscela di DNA totale dal precedente stadio di 1,7. Microiniettare la soluzione totale (di 50-80 pg di DNA linearizzato) in embrioni AB wild-type a stadio monocellulare (e fino a 500 embrioni) utilizzando ago di micropipetta di vetro di 1,0 mm di diametro come descritto in ^precedenza17. Conservare la miscela di DNA rimanente a -20 °C per iniezioni future.

2. Esaminare e verificare la linea transgenica di pesce LMO1 per la trasmissione germinale di LMO1 e mCherry

1. A 3-4 giorni dopo la fecondazione (dpf), anestetizzare gli embrioni iniettati con lo 0,02% di tricaina e sottoporli a screening per l'espressione fluorescente di mCherry, che si presenta ovunque in tutto il corpo del pesce a causa della transgenesi a mosaico. Trasferire embrioni mCherry-positivi in una capsula di Petri con acqua fresca all'uovo e allevare embrioni fino alla maturità sessuale in conformità con il libro ^zebrafish21.
   NOTA: Aspettatevi che il rapporto tra pesci positivi vari a seconda della competenza e dell'esperienza del personale di ricerca. Ad esempio, i dilettanti principianti possono avere un basso tasso di integrazione del 10%, rispetto a un esperto di ≥50%.
2. Per determinare il pesce fondatore con transgeni dβh:LMO1 e dβh:mCherry integrati nelle cellule germinali, incrociare singole coppie di pesci f0 f0 f0 iniettati positivi alla fase precedente (2.1) con pesci WT AB. Esaminare la generazione F1 per gli embrioni mCherry-positivi a 3-4 dpf.
3. Per confermare che il pesce mCherry-positivo trasporta il transgene LMO1 , isolare il gDNA dal singolo embrione F1 mCherry-positivo utilizzando il tampone di estrazione gDNA, che contiene: 12,5 μL di 4x tampone di lisi (500 μL di 1 M Tris con pH di 8,4, 2,5 mL di cloruro di potassio 1 M e 47 mL di acqua purificata), 35 μL di acqua purificata, e 2,5 μL di proteinasi K a 10 mg/mL. Incubare il campione per 16 ore a 55 °C, seguito da 10 minuti a 98 °C.
4. Utilizzare il gDNA estratto (2 μL) come modello per la PCR di genotipizzazione con primer: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' e LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3', e il seguente programma PCR: 1 ciclo di 94 °C, 10 min; 35 cicli di (94 °C per 30 s, 60 °C per 30 s; 68 °C, 30 s); e 68 °C per 7 min. Confermare il frammento amplificato di 182 bp mediante sequenziamento.
5. Dopo la conferma del genotipo, aumentare i restanti embrioni F1 mCherry-positivi alla maturità in conformità con le linee guida standard del libro ^zebrafish21. Clip delle pinne e genotipizzazione a 2-3 mesi di età utilizzando i passaggi 2.3-2.4 del protocollo di cui sopra per confermare ulteriormente l'integrazione del transgene LMO1 nel pesce.
   NOTA: Il pesce F1 LMO1-positivo sarà il pesce transgenico stabile [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (designato come linea LMO1 ).
6. Alleva F1 LMO1 pesci transgenici stabili con pesci WT e ripeti se necessario per propagare questa linea.

3. Outcross di linee transgeniche LMO1 e MYCN per creare un modello metastatico

1. Una volta generata la linea di zebrafish transgenico LMO1, incrociarsi con la linea ^MYCN6,17 per sviluppare una linea di pesce transgenica eterozigote sovraesprimendo sia MYCN che LMO1.
2. A 1 dpf, ordinare la progenie di outcross per l'espressione EGFP con microscopio a fluorescenza stereoscopica, che si presenta come punti EGFP-positivi nella regione del cervello posteriore.
   NOTA: In alternativa, se non tutti gli embrioni sono ordinati per MYCN a 1 dpf, aumentare gli embrioni all'età adulta e al genotipo tagliando le pinne e utilizzando le linee guida precedentemente indicate dai passaggi 2.3-2.4 per l'isolamento del gDNA e la genotipizzazione PCR, con primer: MYCN-F (5'-ATT CAC CAC CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3', e il seguente programma con Taq polimerasi standard: 1 ciclo di 94 °C per 3 min, 35 cicli di (94 °C per 30 s, 60 °C per 30 s e 68 °C per 3 min) e 68 °C per 7 min con amplicon size prevista di 145 bp.
3. Dopo la cernita per EGFP a 1 dpf, isolare gli embrioni sottoposti a screening in piastre di Petri separate ed etichettare le piastre come: MYCN+ (EGFP-positivo) o MYCN- (EGFP-negativo).
4. A 3-4 dpf, visualizzare e ordinare gli embrioni di entrambi i gruppi (fase 3.3) per l'espressione di LMO1 con un microscopio a fluorescenza stereoscopica. Cerca l'espressione della proteina fluorescente rossa come macchie sia nel ganglio cervicale superiore che nelle cellule neuronali dopaminergiche non PSNS nella regione della testa, specialmente nel midollo allungato del cervello ^{posteriore6,13}.
   NOTA: Screening per mCherry / LMO1 prima che gli embrioni raggiungano 5 dpf, perché le vesciche natatorie piene d'aria si sviluppano completamente per allora e causeranno il galleggiamento degli embrioni, con conseguente difficile messa a fuoco microscopica delle cellule PSNS durante il processo di selezione.
5. Una volta completata la cernita, isolare i pesci selezionati in quattro gruppi di genotipi diversi ed etichettare come di seguito. Allevare il pesce selezionato in condizioni identiche secondo i protocolli standard del libro ^zebrafish21.
   1. Solo MYCN (EGFP-positivo),
   2. Solo LMO1 (mCherry-positivo),
   3. MYCN; LMO1 (EGFP e mCherry doppio positivo),
   4. WT (EGFP e mCherry doppio negativo).

4. Visualizzazione del carico tumorale nelle linee transgeniche di zebrafish

1. A 4 settimane dopo la fecondazione (wpf), anestetizzare i pesci ordinati dal passo 3.5 con lo 0,02% di tricaina in una capsula di Petri.
2. Visualizza i tumori con un microscopio a fluorescenza stereoscopica capovolgendo delicatamente il pesce con una spatola metallica su entrambi i lati laterali per visualizzare il tumore. Aspettatevi che i tumori si presentino come singole masse EGFP-, singole mCherry- o doppie EGFP-e-mCherry-positive che derivano dalla regione della ghiandola interrenale (vicino alla testa e al rene).
   NOTA: È possibile che l'esordio iniziale del tumore sia tipicamente presentato con una massa positiva alla fluorescenza più luminosa e più grande su un lato della ghiandola interrenale, motivo per cui è fondamentale visualizzare entrambi i lati del pesce per evitare la mancata insorgenza precoce del tumore.
3. Dopo l'identificazione del possibile pesce portatore di tumore, isolare il pesce in un acquario separato con etichette appropriate, che include la data di nascita, la data in cui il tumore è stato sottoposto a screening e il genotipo.
4. A 6 wpf, ripetere i passaggi precedenti 4.1-4.3 per sottoporre nuovamente a screening i pesci portatori di tumore e i pesci non tumorali per confermare la presenza di tumori per i pesci portatori di tumore precedentemente sottoposti a screening o identificare nuovi possibili pesci portatori di tumore, rispettivamente. Cerca dimensioni sostenute o aumentate della massa positiva alla fluorescenza nei pesci portatori di tumore confermati.
5. Dopo aver identificato i pesci portatori di tumore, monitorarli due volte alla settimana per l'evidenza della migrazione delle cellule tumorali, che si presenta come minuscole masse tumorali EGFP e / o mCherry-positive lontane dal sito primario di tumorgenesi (regione della ghiandola interrenale). Isolare questi pesci in vasche separate secondo necessità ed etichettare in modo appropriato per indicare possibili metastasi.
6. Per confermare ulteriormente le metastasi, continuare a monitorare questi pesci regolarmente (ogni due settimane) fino a quando le masse tumorali lontane positive alla fluorescenza mostrano chiaramente maggiori dimensioni, indicando la crescita dei tumori nei siti metastatici.

5. Lavorazione dei tessuti e sezionamento di paraffina di pesci portatori di tumore

NOTA: Eseguire questa fase per caratterizzare i tumori primari e/o metastatici sviluppati spontaneamente in MYCN e MYCN; LMO1 pesce transgenico.

1. Dopo l'identificazione e la verifica del pesce portatore di tumore, sacrificare il pesce dal passo 4.6 in una capsula di Petri immergendo il pesce nello 0,02% di tricaina per anestetizzare prima e poi aumentando il dosaggio di tricaina fino a quando il pesce non respira più. Taglia il pesce in due pezzi, con un pezzo contenente la testa e una parte della sezione centrale del corpo (incluso il tumore) e un altro pezzo con il resto della sezione centrale e della coda del pesce.
2. Fissare entrambe le sezioni di pesce con il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente su un bilanciere. Per migliorare l'efficienza di fissazione, sostituire il tampone con PFA fresco al 4% per aumentare la penetranza negli organi interni in modo efficace e rapido. Lasciare il pesce con tampone di fissaggio fresco su un bilanciere a 4 °C durante la notte o per 48 ore.
   ATTENZIONE: il PFA è tossico. Poiché le procedure precauzionali e il corretto smaltimento del reagente dipendono dalle normative del tuo istituto, cerca linee guida adeguate prima di utilizzare e smaltire il reagente.
3. Prima della lavorazione, posizionare i campioni in una soluzione di decalcificante rapido al 100% per 15-20 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi di utilizzare un contenitore non metallico e di controllare i campioni durante l'incubazione per evitare una decalcificazione eccessiva. Se il tessuto campione appare fortemente degradato, mettere il campione in acqua o a 4 °C per rallentare il processo di decalcificazione.
4. Una volta fissato e decalcificato, lavare i campioni di pesce con acqua corrente del rubinetto per 1 ora e metterlo in cassette del processore. Se c'è più di un campione, separare ciascuno nella propria cassetta.
5. Disidratare e preparare il tessuto per l'incorporamento della paraffina posizionando cassette con pesce nel trasformatore di tessuti in cui i campioni sono immersi in varie soluzioni, rispettivamente, come segue: 70% di etanolo (60 min, 40 °C), 85% di etanolo (50 min, 40 °C), 95% di etanolo (40 min, 40 °C) due volte, 100% di etanolo (30 min, 40 °C), un'altra soluzione fresca di etanolo al 100% (50 min, 40 °C) due volte, xilene (30 min, 40 °C), un'altra soluzione fresca di xilene (50 min, 40 °C), un altro xilene fresco (50 min, 45 °C), paraffina (30 min, 45 °C), paraffina (20 min, 58 °C) tre volte.
6. Dopo che il tessuto è stato elaborato, scaricare la cassetta o le cassette dalla macchina del processore mantenendo l'organizzazione di ciascuna cassetta e assicurandosi di evitare di mescolare i campioni di pesce.
7. Scegli lo stampo di dimensioni appropriate in base alle dimensioni del pesce, assicurandoti che lo stampo si adatti all'intera cassetta con il campione di pesce. Coprire il fondo dello stampo con paraffina liquida a 60 °C.
8. Posizionare immediatamente la cassetta con il pesce sopra lo stampo (assicurandosi che il pesce sia posato sul lato laterale piatto per le sezioni sagittali) con paraffina liquida e terminare il riempimento con paraffina nella parte superiore dello stampo per incorporare completamente il pesce.
9. Posizionare lo stampo completato sulla piastra fredda del microtomo di sezionamento fino a quando la paraffina non è indurita.
10. Una volta che il blocco di paraffina è duro, che può essere giudicato osservando visivamente una maggiore opacità e un tocco deciso al blocco, rimuovere delicatamente il blocco dallo stampo. Raschiare con cura qualsiasi paraffina in eccesso dai lati della cassetta.
11. Sezionare il blocco di pesce incorporato in paraffina sagittalmente a 4 micron sul microtomo e far galleggiare le sezioni su un bagno d'acqua calda a 40 °C contenente acqua distillata.
12. Trasferire con attenzione le sezioni su vetrini caricati positivamente e cuocere in forno a 60 °C per 30 minuti prima della colorazione prima di procedere alle fasi 6, 7 o 8.

6. Colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) di sezioni di paraffina per la revisione della patologia

1. Posizionare le diapositive contenenti sezioni di paraffina dal passaggio 5.12 in un supporto per diapositive. All'interno di una cappa chimica, deparaffinizzare con xilene 3 volte, 5 minuti ciascuna. Scartare la soluzione dopo ogni utilizzo.
2. Reidratare le sezioni con etanolo al 100% per 3 minuti e ripetere due volte con etanolo fresco al 100%. Sostituire il 100% di etanolo con il 95% di etanolo per 3 minuti e poi l'80% di etanolo per 3 minuti.
3. Risciacquare le sezioni con acqua distillata per 5 min. Mentre le sezioni vengono lavate in acqua, assicurarsi di rimuovere le particelle ossidate dall'ematossilina filtrando o scremando la superficie dell'ematossilina con una salvietta priva di lanugine.
4. Asciugare l'acqua in eccesso dal supporto dello scivolo con salviette di grado professionale prive di lanugine e vetrini di colorazione in ematossilina al 50% (diluizione 1: 1 con acqua distillata) per 2-5 minuti a seconda delle preferenze di colorazione desiderate e del deterioramento del reagente. Scartare l'ematossilina quando il colore della soluzione cambia da prugna a blu / marrone o quando il tempo di colorazione diventa eccessivo. Risciacquare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 20 minuti.
5. Decolorare le sezioni in etanolo acido all'1% (3,3 ml di acido cloridrico con 50 ml di etanolo al 70%) immergendo rapidamente i vetrini più volte. Le diapositive possono essere immerse fino a 3 s, ma più a lungo le diapositive sono immerse, più leggere diventano le sezioni.
6. Risciacquare i vetrini in acqua di rubinetto due volte per 1 minuto ciascuno e una volta con acqua deionizzata. Come opzione, gli scivoli possono essere lasciati durante la notte in questa fase, immergendosi nell'acqua.
7. Immergere le sezioni in soluzione di carbonato di litio all'1,36% (47 g di carbonato di litio, 3500 ml di acqua) per 3 s. Assicurati di non incubare eccessivamente le sezioni poiché più lungo è il tempo in soluzione di carbonato di litio, più è probabile che il tessuto galleggi.
8. Risciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per 5 minuti e asciugare l'acqua in eccesso dal supporto dello scivolo con salviette di grado professionale prive di lanugine.
9. Controbattere i vetrini in eosina pronta all'uso al 100% per 15-30 s e disidratare immediatamente con etanolo al 95% due volte per 5 minuti ciascuno. Sostituire con etanolo al 100% due volte per 5 minuti ciascuna, scartando le soluzioni dopo ogni utilizzo.
10. Cancellare le sezioni in xilene per 15 minuti e ripetere due volte per 3 volte in totale. Opzionalmente, gli scivoli possono essere lasciati in xilene durante la notte a temperatura ambiente per eliminare meglio l'acqua in eccesso.
11. Lasciare asciugare all'aria le diapositive nella cappa dei fumi chimici e quindi montare una slitta di copertura utilizzando il mezzo di montaggio per sigillare il campione di tessuto.
12. Visualizza e visualizza le sezioni di tessuto colorato al microscopio. Esaminare attentamente i tumori nel sito primario (la regione della ghiandola interrenale nel rene della testa) e le metastasi sporadiche a distanza in altri tessuti e organi del pesce. Invia vetrini macchiati per le sezioni di tessuto per essere esaminati dai patologi. Sulla base delle caratteristiche patologiche simili del modello ittico al neuroblastoma umano, aspettatevi i tumori che sono sorti solo in MYCN-only o MYCN; Il pesce LMO1 deve essere diagnosticato per la prima volta come neuroblastoma dai patologi.

7. Analisi immunoistochimica (IHC) con anticorpi contro il marcatore NB e i transgeni sovraespressi per confermare ulteriormente la diffusione del tumore e la loro proprietà di lignaggio simpatico-surrenale

1. Colorazione con sistema di colorazione completamente automatico
   1. Per confrontare meglio il risultato IHC con quello della colorazione H&E, selezionare le diapositive adiacenti dal passaggio 5.12 per la colorazione IHC.
      NOTA: Sebbene un sistema di colorazione automatizzato consenta risultati più rapidi e meno laboriosi, un protocollo manuale per la colorazione IHC può essere utilizzato in assenza di tale facendo riferimento ai passaggi della sottosezione 7.2.
   2. Diluire l'anticorpo primario contro la tirosina idrossilasi (TH) (1:500), un marcatore di neuroblastoma, in base alla concentrazione desiderata e alla quantità totale necessaria con il corrispondente diluente anticorpale primario del sistema automatizzato.
      NOTA: le concentrazioni ottimali di anticorpi possono variare a seconda degli anticorpi e dei tessuti.
   3. Poiché il sistema automatizzato utilizza il recupero dell'antigene indotto dal calore a bordo con la soluzione di recupero dell'epitopo per 20 minuti e il corrispondente reagente di rilevamento del sistema, assicurarsi che i parametri per la macchina siano impostati come: Blocco della perossidasi, 5 min; Anticorpo primario con concentrazione desiderata, 15 min; anticorpo secondario biotinilato anti-coniglio IgG (1:500), 8 min; Streptavidina HRP, 8 min; substrato misto DAB intenso, 5 min; e Hematoxylin, 5 min.
   4. Una volta impostate le impostazioni, posizionare il vassoio degli anticorpi nella macchina. Impostare le diapositive creando un nuovo caso, che etichetterà le diapositive. La macchina è ora caricata e pronta per l'uso (deceratura, colorazione e controcolorazione).
   5. Una volta che i vetrini sono stati decerati, macchiati e controcolorati utilizzando la macchina automatizzata, disidratare i vetrini in gradienti di etanolo del 70%, 95% e 100% per 5 minuti ciascuno. Immergere nuovamente le diapositive delle sezioni in etanolo fresco al 100% per 5 minuti.
   6. Pulire le sezioni in xilene per 5 minuti, due volte o lasciare scivoli in xilene durante la notte per eliminare meglio l'acqua in eccesso.
   7. Lasciare asciugare all'aria le guide nella cappa chimica e quindi montare una slitta di copertura utilizzando un mezzo di montaggio. Visualizza e visualizza le sezioni di tessuto colorato con la microscopia.
   8. Per confermare con fermezza le metastasi nel modello di pesce, confrontare i vetrini colorati con anticorpi contro il marcatore del neuroblastoma dal passaggio 7 a quelli colorati da H & E dal passaggio 6.
      NOTA: Aspettatevi di vedere una colorazione positiva per il marcatore del neuroblastoma, TH, in tutte le cellule tumorali identificate dalla colorazione H & E. Inoltre non si prevede alcuna colorazione positiva per TH nei tessuti adiacenti in cui i tumori metastatici sono stati identificati in LMO1; Pesce MYCN . Assicurati di selezionare pesci di controllo WT e MYCN di età simile a MYCN; LMO1 pesca per questa analisi per escludere la possibilità che i tumori metastatici siano tumori primari multifocali.
2. Colorazione manuale senza sistema di colorazione IHC automatizzato
   1. Dopo che le diapositive sono state cotte, selezionare le diapositive adiacenti dal passaggio 5.12 per consentire un migliore confronto tra la colorazione H & E e IHC per deparaffinizzare. All'interno di una cappa chimica, deceratare e reidratare i vetrini con xilene utilizzando rispettivamente i precedenti passaggi 6.1 e 6.2.
   2. Dopo la deparaffinazione e la reidratazione, immergere i vetrini in una soluzione endogena che blocca il perossido (1x PBS contenente 0,1% di sodio azide e 0,3% di perossido di idrogeno) per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini in 1x PBS fresco per 3 minuti e ripetere due volte per un totale di 3 volte.
      ATTENZIONE: L'azide di sodio è acutamente tossico. Assicurati di praticare procedure precauzionali e il corretto smaltimento del reagente a seconda delle normative del tuo istituto.
   3. Recuperare l'antigene incubando vetrini in soluzione con proteinasi K (1:500 in 1x PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le diapositive 3 volte con 1x PBS per 3 minuti ciascuna.
   4. Blocca le diapositive incubando con siero di capra al 5% in 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente su bilanciere. Lavare le diapositive con 1x PBS fresco due volte per 3 minuti ciascuna.
   5. Aggiungere 4 gocce di soluzione bloccante avidina direttamente sul vetrino e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i vetrini con 1x PBS fresco due volte per 3 minuti ciascuno, aggiungere 4 gocce di soluzione bloccante di biotina e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
   6. Dopo aver bloccato i vetrini, incubare nell'anticorpo primario della tirosina idrossilasi (TH) (1:500) per 45-60 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
      NOTA: Colorazione con anticorpi aggiuntivi contro i transgeni e altri marcatori rilevanti per affrontare la fisiologia e l'attività del tumore primario e di altri siti metastatici. Le concentrazioni ottimali di anticorpi possono variare a seconda degli anticorpi e dei tessuti.
   7. Lavare le diapositive con 1x PBS fresco per 3 minuti, ripetendo due volte per un totale di 3 volte.
   8. Incubare vetrini in anticorpi secondari di anticorpo secondario IgG anti-coniglio biotinilato (1:500) diluito in soluzione bloccante per 45-60 minuti a temperatura ambiente. Ripetere la precedente fase di lavaggio 7.2.7.
   9. Aggiungere Avidina coniugata HRP (1:300 in 1x PBS) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare le diapositive 3 volte con 1x PBS fresco per 5 minuti ciascuna.
   10. Preparare la soluzione di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (2,5 ml di acqua distillata, 1 goccia di tampone del kit, 1 goccia di perossido di idrogeno e 2 gocce di DAB dal kit) e posizionare le gocce di DAB direttamente sui vetrini vicino a un microscopio. Dopo aver aggiunto DAB, osservare la reazione di cambiamento di colore sui vetrini al microscopio. Una volta raggiunta l'intensità di colorazione desiderata, interrompere la reazione posizionando le sezioni di scorrimento in acqua distillata fredda.
   11. Controbattere i vetrini con ematossilina fresca al 50% immergendo o immergendo i campioni per alcuni brevi secondi e rimettendoli in acqua distillata. Ripeti come desiderato, ma normalmente, una volta dovrebbe essere sufficiente poiché le sezioni di tessuto sono sottili.
   12. Disidratare i campioni di tessuto su vetrini in gradiente alcolico come descritto in precedenza nel passaggio 7.1.5 e continuare attraverso i passaggi rimanenti (con l'ultimo passaggio come 7.1.8) per completare l'analisi IHC.

8. Colorazione rossa picrosirius dei vetrini di paraffina per l'accumulo di collagene nei tumori come studio del meccanismo

1. Ripetere i passaggi 6.1-6.3 per decelerare, idratare e lavare le sezioni di paraffina sui vetrini.
2. Dopo aver tamponato l'acqua in eccesso dal supporto dello scivolo con salviette prive di lanugine di grado professionale, colorare il 50% di ematossilina per 10 minuti. Risciacquare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 10 minuti.
3. Trasferire i vetrini in Picrosirius Red e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Lavare i vetrini in acqua acidificata (5 ml di acido acetico glaciale in 1 L di acqua di rubinetto o distillata) due volte, incubando per 5 minuti su shaker.
5. Decantare la maggior parte dell'acqua dagli scivoli prima di scuotere fisicamente e tamponare le sezioni sui vetrini per rimuovere quanta più acqua possibile.
6. Posizionare rapidamente le diapositive in tre cambi di etanolo al 100% per disidratare le sezioni di paraffina.
7. Ripetere i passaggi 6.10 e 6.11 per cancellare le diapositive in xilene e montare il campione. Successivamente, immagine con microscopio composto dotato di una fotocamera.
8. Usando ImageJ, conta le fibre di collagene rosso-positivo del picrosirius in almeno tre campi casuali per ogni sezione. Confronta tra le diapositive di MYCN e MYCN; Sezioni di pesce LMO1.

Risultati

Per determinare se LMO1 sinergizza con MYCN per influenzare la patogenesi NB, i costrutti transgenici che guidano l'espressione di LMO1 (dβh:LMO1 e dβh:mCherry) o MYCN (dβh:EGFP-MYCN) nelle cellule PSNS sotto controllo del promotore dβh sono stati iniettati negli embrioni di ^zebrafish13. Come illustrato nella Figura 1A, dopo lo sviluppo di linee transgeniche stabili e la convalida dei loro gen...

Discussione

Il pesce zebra è stato comunemente utilizzato nella ricerca negli ultimi decenni, in particolare nella ricerca sul cancro, per ovvi motivi, come la sua facilità di manutenzione, la riproduzione robusta e chiari vantaggi per l'imaging in ^vivo1,28. Il modello del pesce zebra può essere facilmente manipolato embrionalmente a causa della loro fecondazione e sviluppo esterni, che si integra bene con gli organismi modello dei mammiferi, come ratti e topi, p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL