Пространственно-временная визуализация in vivo систем доставки глазных лекарств с использованием волоконно-оптической конфокальной лазерной микроскопии

Резюме

Представлен протокол применения фиброоптической конфокальной лазерной микроскопии (КМЛМ) для неинвазивного изучения пространственно-временного распределения липосом в глазу после субконъюнктивальной инъекции.

Аннотация

Субконъюнктивальная инъекция является привлекательным способом введения глазных препаратов из-за легкого транссклерального доступа, который обходит передние глазные барьеры, такие как роговица и конъюнктива. В то время как терапевтические эффекты и фармакокинетика лекарств при субконъюнктивальной инъекции были описаны в некоторых исследованиях, очень немногие оценивают глазное распределение лекарств или системы доставки лекарств (DDS). Последнее имеет решающее значение для оптимизации внутриглазной конструкции DDS и биодоступности препарата для достижения желаемой глазной локализации и продолжительности действия (например, острого и пролонгированного). Данное исследование устанавливает использование волоконно-оптической конфокальной лазерной микроэндоскопии (CLM) для качественного изучения глазного распределения флуоресцентных липосом в режиме реального времени у живых мышей после субконъюнктивальной инъекции. Будучи разработанным для визуального осмотра тканей in vivo на микроскопическом уровне, это также первое полное описание метода визуализации CLM для изучения пространственно-временного распределения инъекционных препаратов в глазу после субконъюнктивальной инъекции.

Введение

Очищение крови, распределение тканей и целевое заполнение лекарств в живых системах являются столпами для понимания диспозиции лекарств in vivo. В доклинических моделях на животных эти параметры обычно оцениваются путем частого забора крови и тканей в определенные моменты времени после введения препарата. Тем не менее, эти процедуры, как правило, являются инвазивными, часто включают измерения невыявляемости и требуют больших когорт животных для статистического питания. Могут возникнуть дополнительные расходы и время, а также этические проблемы чрезмерного использования животных. В результате неинвазивная визуализация быстро становится неотъемлемым шагом в исследованиях биораспределения. Конфокальная лазерная микроэндоскопия (^CLM1,2) хорошо подходит для глазных применений для неинвазивного изображения пространственно-временного распределения терапевтических средств в глазах живых животных с высокой чувствительностью и высоким разрешением1,3,4.

CLM обладает потенциалом для облегчения надежного скрининга систем доставки глазных лекарств (DDS), таких как липосомы, до всесторонней количественной оценки DDS и биодоступности лекарств. Липосомы привлекательны своей гибкостью в настройке своих физико-химических и биофизических свойств5,6,7,8,9,10,11 для инкапсуляции большого разнообразия терапевтического груза и контроля тканевого места высвобождения лекарственного средства и продолжительности действия. Липосомы использовались в глазных приложениях для доставки больших молекул, таких как моноклональное антитело бевацизумаб12, и малых молекул, таких как циклоспорин13 и ганцикловир14. Липосомы, нагруженные лекарственными средствами, имеют более длительные биологические периоды полураспада и длительные терапевтические эффекты по сравнению с нелипосомными составами «свободных лекарств». Однако распределение лекарственного средства в глазной ткани обычно экстраполируется из концентраций лекарственного средства в жидких компонентах глаза (т.е. крови, водной влаге и стекловидном теле15,16,17). Поскольку первоначальная судьба in vivo загруженного лекарственного груза определяется свойствами самого нанонесущего, CLM-визуализация флуоресцентных липосом может служить суррогатом для лекарственного средства, чтобы выявить нацеливание на ткань и время пребывания ткани in situ. Кроме того, визуальные доказательства доставки с CLM могут направлять редизайн DDS, оценивать терапевтические преимущества препарата и, возможно, даже прогнозировать неблагоприятные биологические события (например, токсичность тканей из-за нежелательной локализации DDS в течение длительных периодов времени).

Здесь подробно описана пошаговая процедура изучения глазного биораспределения липосом у живых мышей с двухдиапазонной системой CLM. Эта специальная система CLM может обнаруживать двухцветную флуоресценцию (с зелеными и красными лазерами возбуждения при 488 нм и 660 нм) в режиме реального времени с частотой 8 кадров / с. Физически помещая зонд обнаружения на глаз, протокол демонстрирует получение и анализ изображений зелено-флуоресцентных липосом при субконъюнктивальном введении у мышей, предварительно введенных внутривенно (IV) с 2% красителем Evans Blue (EB). Краситель EB помогает визуализировать васкуляризованные структуры в красном флуоресцентном канале. Мы показываем репрезентативные результаты исследования, оценивающего 100 нм нейтральных липосом, состоящих из фосфолипида POPC (т.е. 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина) и легированных флуоресцеин-меченым фосфолипидом Fl-DHPE (т.е. N-(флуоресцеин-5-тиокарбамоил)-1,2-дигекса-деканоилсн-глицеро-3-фосфоэтаноламин) в соотношении 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Рисунок 1B ). CLM способен захватывать зеленые флуоресцеин-меченые липосомы с осевым разрешением 15 мкм и боковым разрешением 3,30 мкм путем очерчивания границ глазной ткани, окрашенной EB.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в SingHealth (Сингапур). Самки мышей C57BL/6 J (6-8 недель; 18-20 г) были получены из InVivos, Сингапур, и размещены в варии с контролируемой температурой и светом Медицинской школы Duke-NUS, Сингапур. Животные лечились в соответствии с руководящими принципами Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема, выделяющая основные процедуры, показана на рисунке 2.

1. Приготовление контрастных веществ: Evans Blue (EB) и липосом

1. Для 2% раствора красителя EB растворить 1 г EB в 50 мл стерильного физиологического раствора. Фильтруйте раствор с помощью фильтров 0,22 мкм в стерильные трубки объемом 1,5 мл и храните их при комнатной температуре для последующего использования.
2. Для зелено-флуоресцентных липосом добавьте POPC/Fl-DHPE (95:5), хлороформ/метанол (2:1) в колбу с круглым дном объемом 100 мл. Используйте роторный испаритель при 150 об/мин при 40 °C в течение 1 ч, при этом вакуум поддерживается при 0 ^мбар1 для создания тонкой липидной пленки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При сравнении влияния липосомальных свойств (например, размер, заряд, насыщение липидов, длина липидной цепи) на распределение, поддерживайте фиксированный процент Fl-DHPE или других флуоресцентных липидов, чтобы подтвердить, что наблюдаемые результаты обусловлены эффектом тестируемых свойств, а не переменной нагрузкой крупных гидрофобных красителей.
3. Увлажняют липидную пленку фосфатно-буферным физиологическим раствором (для достижения 26,3 мМ флуоресцентных липосом) при 40 °C с образованием многоламеллярных везикул (MLV). Загрузите MLV в стеклянный шприц для ручной экструзии (30 раз с использованием поликарбонатного фильтра размером пор 0,08 мкм) для достижения желаемого размера 100 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура для гидратации должна быть выше, чем температура перехода липидов.
4. Фильтруйте липосомы, пропуская их через 0,22 мкм стерильный шприцевой фильтр. Подтвердите гидродинамический диаметр (_DH) липосом с помощью динамической системы рассеяния света.

2. Введение ЭБ и липосом живым мышам

1. Вводят мышам EB IV (внутривенно) через хвостовую вену (2,5 мг/кг) за 2 ч до субконъюнктивальной инъекции.
2. Для субконъюнктивальной инъекции, во-первых, успокойте мышь, используя 5% изофлурана путем ингаляции в индукционной камере для достижения адекватной плоскости анестезии. Переведите мышь на носовой конус и поддерживайте седацию на уровне 2%-2,5% изофлурана, находясь на грелке на протяжении всей процедуры.
3. Обрежьте усы возле глаза для инъекций и закапывайте каплю местного анестетика 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида непосредственно в глаз.
4. Загрузите стеклянный шприц объемом 10 мкл (с иглой 32 г) флуоресцентными липосомами (Fl-DHPE: 0,78 мг/ кг) и рассейте все пузырьки воздуха в шприце перед инъекцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: До 20 мкл инъекционного вещества может быть размещено в субконъюнктивальном пространстве ^{мышей18,19}.
5. С помощью пинцета слегка приподнимите конъюнктиву и медленно введите в субконъюнктивальное пространство (рисунок 1А). Медленно вынимайте иглу, чтобы предотвратить обратный поток. Убедитесь, что образовалась видимая блеб, заполненная флуоресцентными липосомами (рисунок 1С).
6. Вводят каплю антибиотика 1% фузидовой кислоты в глаз после инъекции и контролируют мышь до тех пор, пока она не придет в сознание.

3. Настройка CLM

1. Включите систему CLM и убедитесь, что разъем и дистальный наконечник сканирующего зонда чисты.
2. Очистите разъем сканирующего зонда с помощью очистителя оптических разъемов, следуя инструкциям производителя.
   1. Нажмите на рейет (часто цветной) очистителя оптического разъема, чтобы открыть ленту очистки.
   2. Расположите разъем в контакте с лентой очистки и сдвиньте разъем вдоль ленты, сохраняя контакт.
3. Очистите дистальный наконечник (также известный как сканирующий наконечник) зонда, окунув его в очищающий раствор, а затем раствор для полоскания, предоставленный производителем. Аппликатор хлопкового наконечника также можно использовать для более тщательной очистки, если наконечник очень грязный.
4. Подключите зонд к системе CLM. Выберите поле зрения (FOV) и расположение файлов сбора на этом этапе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте интенсивность лазера на этом шаге, чтобы убедиться, что обнаружение флуоресценции для Fl-DHPE находится в линейном диапазоне. Интенсивность лазера должна быть постоянной для сравнения между изображениями, сделанными в разные моменты времени.
5. Дайте системе прогреться в течение 15 минут в соответствии с инструкциями и используйте калибровочный комплект для калибровки системы в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В калибровочном комплекте имеется три флакона для каждого лазера, содержащих следующие растворы: очищающий раствор, раствор для полоскания и раствор флуорофора 488/660 нм для внутренней калибровки. Этапы калибровки запрашиваются системой и должны соблюдаться соответствующим образом.
   1. Погрузите наконечник в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом (по 5 с в каждом флаконе). Оставьте его в эфире для фоновой записи для обоих каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень важен, так как он нормализует фоновые значения из разных волокон зонда и обеспечивает однородность изображения.
   2. Погрузите наконечник в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом (по 5 с в каждом флаконе). Погружайте наконечник во флакон флуорофор 488 нм на 5 секунд для нормализации значений сигнала от разных волокон в зонде.
   3. Погрузите наконечник в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом (по 5 с в каждом флаконе). Погружайте наконечник в промывочный флакон до флуоресцентного сигнала, зафиксированного в разделе 3.5.2. Исчезает. Погружайте наконечник во флакон флуорофор 660 нм для нормализации значений сигнала от разных волокон в зонде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы калибровки для достижения правильной калибровки и оптимального качества изображения.
6. После калибровки зонда убедитесь, что фоновые значения для зондов как можно ниже. Для используемой системы CLM сохраняйте фоновые значения ниже 100. Выполните повторную очистку зонда с помощью хлопкового наконечника и калибровку, если значения превышают 100 / определенное пользовательское значение или если зонд кажется грязным. Это делается для того, чтобы фоновый шум сохранялся примерно на том же значении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить максимальное фоновое значение (например, 100, как указано на шаге 3.6), чтобы убедиться, что условия зонда схожи. Это позволит правильно проводить количественное сравнение между изображениями, сделанными в разные моменты времени. Значение может отличаться в разных системах и условиях зонда.
7. Включите регулятор температуры животных (ATC). Отрегулируйте ATC до 37 °C. Накройте грелку хирургической драпировкой и закрепите носовой конус на грелке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ATC с прикрепленной грелкой требуется для обеспечения того, чтобы животное оставалось в тепле в течение всего периода визуализации.
8. Прижмите подставку рассекающего микроскопа к столешнице, чтобы закрепить ее. Поверните и отрегулируйте окуляр микроскопа, чтобы эргономично просматривать глаз мыши через окуляр, когда пользователь сидит (внесите коррективы после размещения животного).
9. Успокоить мышь, используя 5% изофлурана в индукционной камере. Перенесите мышь на носовой конус, как только животное не реагирует, и поддерживайте седацию на уровне 2-2,5% изофлурана, находясь на грелке на протяжении всей процедуры.
10. Обрежьте усы мыши и закапывайте в глаз каплю анестетика 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида.
11. Чтобы убедиться, что глаза чистые, опустите несколько капель физиологического раствора, чтобы промыть глазную поверхность.
12. Отрегулируйте микроскоп так, чтобы глаз мыши находился в прямом фокусе при увеличении 0,67x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно смажьте глаза физиологическим раствором. Если глаза не смазаны в течение всего сеанса визуализации, они могут стать сухими, в результате чего хрусталик кристаллизуется. В результате во время CLM-визуализации объектив может излучать фоновую красную флуоресценцию.

4. Живая визуализация глаз мыши с помощью CLM и сбора

1. Включите лазер, поместите зонд на глаз и начните запись захвата, чтобы наблюдать флуоресценцию в глазу в областях, указанных на карте глаза на рисунке 3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите зонд, как ручку, дистальным концом зонда непосредственно на области, подлежащей изображению.
2. Остановите запись, когда все регионы будут помечены и помечены. Файлы получения будут сохранены автоматически в расположении файлов, выбранном на шаге 3.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Файл будет сохранен в виде видеофайла, который может быть экспортирован в отдельные изображения. Пометьте флаг в соответствии с картой глаз, чтобы точно знать местоположение зонда в точном кадре, в котором была сделана запись.

5. Анализ изображений

1. Используя то же программное обеспечение для сбора CLM, экспортируйте файлы сбора изображений для дальнейшего анализа. Нажмите на файл | Экспортируйте и выберите формат для экспорта. Файлы формата Mkt позволят корректировать таблицу поиска (LUT) и дальнейшую экспорт в форматы файлов изображений с помощью программного обеспечения CLM Viewer.
2. Для точного сравнения интенсивности флуоресценции используйте один и тот же LUT, настроенный для каждого канала при экспорте всех файлов изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите минимальный и максимальный порог LUT по отношению к пороговым значениям контрольной мыши (без введения липосом), чтобы свести к минимуму показания фоновой флуоресценции.
3. Откройте изображение в соответствующем программном обеспечении для обработки изображений / бесплатной программе (например, ImageJ). Нарисуйте интересующую область (ROI).
   ПРИМЕЧАНИЕ: ROI здесь относится к региону, представляющему интерес в программе обработки. В большинстве случаев ROI будет представлять собой все отсканированное изображение. Однако в случае визуализации лимбуса зонд не может просто получить изображение лимбуса отдельно. Таким образом, ROI должен быть использован для «количественной оценки» флуоресценции в области лимбуса, как показано на рисунке 4. Чтобы обеспечить согласованность окупаемости инвестиций, используйте одинаковую рентабельность инвестиций для всех изображений.
4. Измерьте и запишите значения ROI для зеленой флуоресценции. Введите значения в электронную таблицу. Сведите в таблицу значения средней интенсивности и интенсивности флуоресценции (a.u.) ROI.

6. Оценка гистологии

1. Усыплите мышь, используя метод, одобренный местным IACUC.
2. Энуклеат глаза и фиксация глаза в 1 мл 4% формальдегида или 10% раствора формалина на ночь.
3. Обрежьте лишние жиры и вставьте глаз в соединение оптимальной температуры резки (OCT) и храните его замороженным в морозильной камере при температуре -80 °C в течение по крайней мере одного дня.
4. Разрезанные участки толщиной 5 мкм в криостате с температурой резания, поддерживаемой при 20 °C. Перенесите секцию на предметное стекло микроскопа с поли-L-лизином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гистология может служить дополнительной проверкой распределения DDS. Тем не менее, это требует дополнительной оптимизации, технических знаний и жертвоприношения животных, которые исследование стремится уменьшить с помощью CLM.

Результаты

Протокол демонстрирует полезность CLM для оценки пространственно-временного глазного распределения зеленых флуоресцентных липосом, вводимых через субконъюнктивальную инъекцию. Чтобы использовать двухцветную способность (длины волн возбуждения 488 нм и 660 нм) системы CLM, 100 нм нейтральн?...

Обсуждение

Как показано из результатов, CLM предоставляет простой и осуществимый метод для изображения глазного распределения липосом в глазу. Ранее мы продемонстрировали использование CLM для характеристики локализации различных липосомальных составов в глазу мыши с течением ^{времени1}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.08 µm polycarbonate filter	Whatman, USA	110604
0.22 µm syringe filter	Fisherbrand, Ireland	09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution	Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe	Hamilton, USA	65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti, USA	850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4)	Hamilton, USA	7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm)	WPI, USA	ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5)	Mauna Kea Technologies, France		Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar	WPI, USA	500233	11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue	Sigma Aldrich, USA	E2129
Fusidic acid eye drop	LEO Pharma, Denmark
ImageJ	National Institutes of Health, USA		https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane	Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical, UK
Methanol	Sigma Aldrich, USA	179337
Mini Extruder	Avanti, USA	610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE)	Invitrogen, USA	F362
Phosphate Buffered Saline	Gibco, USA	10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand	Olympus, Tokyo, Japan	SZ51 & SZ2-STU3