Impianto tridimensionale di scaffold a matrice di collagene come strategia di rigenerazione epatica

Riepilogo

Le malattie del fegato sono indotte da molte cause che promuovono la fibrosi o la cirrosi. Il trapianto è l'unica opzione per recuperare la salute. Tuttavia, data la scarsità di organi trapiantabili, è necessario esplorare alternative. La nostra ricerca propone l'impianto di scaffold di collagene nel tessuto epatico da un modello animale.

Abstract

Le malattie del fegato sono la principale causa di morte in tutto il mondo. Il consumo eccessivo di alcol, una dieta ricca di grassi e l'infezione da virus dell'epatite C promuovono la fibrosi, la cirrosi e / o il carcinoma epatocellulare. Il trapianto di fegato è la procedura clinicamente raccomandata per migliorare e prolungare la durata della vita dei pazienti nelle fasi avanzate della malattia. Tuttavia, solo il 10% dei trapianti ha successo, con disponibilità di organi, procedure prechirurgiche e postchirurgiche e costi elevati direttamente correlati a tale risultato. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) sono emersi come alternativa per il ripristino dei tessuti. La biocompatibilità e l'accettazione dell'innesto sono le principali caratteristiche benefiche di tali biomateriali. Sebbene la capacità di ripristinare le dimensioni e la corretta funzione del fegato sia stata valutata in modelli di epatectomia epatica, l'uso di scaffold o di qualche tipo di supporto per sostituire il volume della massa epatica estirpata non è stato valutato.

L'epatectomia parziale è stata eseguita in un fegato di ratto con lo xenoimpianto di uno scaffold a matrice di collagene (CMS) da un condilo bovino. Il tessuto del lobo epatico sinistro è stato rimosso (circa il 40%) e una percentuale uguale di CMS è stata impiantata chirurgicamente. I test di funzionalità epatica sono stati valutati prima e dopo la procedura chirurgica. Dopo i giorni 3, 14 e 21, gli animali sono stati sottoposti a eutanasia e sono state eseguite valutazioni macroscopiche e istologiche. Nei giorni 3 e 14, il tessuto adiposo è stato osservato intorno al CMS, senza evidenza clinica di rigetto o infezione, così come la neoformazione dei vasi e il riassorbimento della CMS al giorno 21. C'erano prove istologiche di un processo infiammatorio insignificante e della migrazione delle cellule adiacenti al CMS, osservate con l'ematossilina e l'eosina (H & E) e la colorazione tricroma di Masson. Il CMS ha dimostrato di funzionare bene nel tessuto epatico e potrebbe essere un'alternativa utile per studiare la rigenerazione e la riparazione dei tessuti nelle malattie epatiche croniche.

Introduzione

Il fegato è uno degli organi più importanti coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi e della produzione di proteine¹. Sfortunatamente, la malattia del fegato è la principale causa di morte in tutto il mondo. Nelle fasi avanzate del danno epatico, che includono cirrosi e carcinoma epatocellulare, il trapianto di fegato è la procedura clinicamente raccomandata. Tuttavia, a causa della scarsità di donatori e del basso tasso di trapianti di successo, sono state sviluppate nuove tecniche di ingegneria tissutale (TE) e medicina rigenerativa (RM)^2,3.

TE prevede l'uso di cellule staminali, scaffold e fattori di^{crescita 4} per promuovere il ripristino di organi e tessuti infiammati, fibrotici ed edematosi^1,5,6. I biomateriali utilizzati negli scaffold imitano l'ECM nativo, fornendo i segnali fisici, chimici e biologici per il rimodellamento cellulare guidato⁷. Il collagene è una delle proteine più abbondanti ottenute dal derma, dal tendine, dall'intestino e dal pericardio^8,9. Inoltre, il collagene può essere ottenuto come biopolimero per produrre scaffold bi- e tridimensionali attraverso bioprinting o elettrofilatura^10,11. Questo gruppo è il primo a segnalare l'uso di collagene da una fonte ossea per la rigenerazione del tessuto epatico. Un altro studio riporta l'uso di scaffold sintetizzati dal collagene bovino, che è stato ottenuto dalla pelle, con pori omogenei e strettamente situati, senza alcuna comunicazione tra loro¹².

La decellularizzazione preserva l'ECM nativo, permettendo la successiva incorporazione di cellule con potenziale di cellule staminali^13,14. Tuttavia, questa procedura è ancora in fase sperimentale nel fegato, nel cuore, nei reni, nell'intestino tenue e nella vescica urinaria da topi, ratti, conigli, maiali, pecore, bovini e cavalli^3,14. Attualmente, il volume di massa epatica resecato non viene sostituito in nessuno dei modelli di epatectomia animale. Tuttavia, l'uso di un supporto o di una rete aggiuntiva (biomateriali) che consente la proliferazione cellulare e l'angiogenesi potrebbe essere essenziale per il rapido ripristino delle funzioni parenchimali epatiche. Pertanto, gli scaffold potrebbero essere impiegati come approcci alternativi per rigenerare o riparare i tessuti nelle malattie epatiche croniche, a loro volta, eliminando le limitazioni dovute alla donazione e le complicanze cliniche del trapianto di fegato.

Protocollo

La presente ricerca è stata approvata dal comitato etico della Scuola di Medicina (DI/115/2015) presso l'Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e dal comitato etico dell'Hospital General de Mexico (CI/314/15). L'istituzione soddisfa tutte le specifiche tecniche per la produzione, la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è legalmente certificata dalla legge nazionale (NOM-062-ZOO-1999). Ratti Wistar maschi del peso di 150-250 g (6-8 settimane) sono stati ottenuti dalla Laboratory Animal Facility della School of Medicine, UNAM, per questo studio.

1. Ottenere scaffold a matrice di collagene dal femore bovino

1. Ottenere il condiolo dal femore bovino da un macello certificato dalle autorità sanitarie e agricole del Messico.
   1. Sezionare attentamente il grasso del condiolo, il muscolo e la cartilagine con uno strumento chirurgico. Tagliare i frammenti del condilo in frammenti di 3 cm x3 cm usando un taglierino e pulire il grasso e il sangue con un asciugamano. Lavare i frammenti di condiolo con acqua.
   2. Far bollire (92 °C) i frammenti con 1 L di un detergente anionico (10 g/L) per 30 min. Lavare due volte i frammenti del condiolo per rimuovere eventuali residui del detergente anionico.
   3. Asciugare i frammenti di condilo per 3 ore utilizzando carta da filtro (0,5 mm).
2. Preparare un CMS triangolare (1 cm x1 cm x1 cm) di spessore 0,5 cm dai frammenti menzionati al punto 1.1 (Figura 1A).
   1. Demineralizzare i frammenti in 100 mL di 0,5 M HCl per 10 min con agitazione costante. Rimuovere l'HCl.
      NOTA: Neutralizzare l'HCl con idrossido di sodio (10 M).
   2. Risciacquare i frammenti tre volte con 100 ml di acqua distillata, 15 minuti ogni volta, con agitazione costante. Asciugare il CMS con carta da filtro (0,5 mm) per 1 ora.
   3. Utilizzare uno stereomicroscopio¹⁵ per analizzare le proprietà strutturali del CMS (dimensione dei pori, formazione dei pori e interconnessione porosa) (Figura 1B).
   4. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione¹⁶ per analizzare la superficie ruvida delle trabecole CMS (Figura 1C).
   5. Utilizzare lo strumento di dissezione per la miscelazione e lo stiramento per valutare i cambiamenti meccanici (plasticità e flessibilità) del CMS (Figura 1D).
   6. Imballare il CMS nella custodia di sterilizzazione e sterilizzarlo con plasma di perossido di idrogeno per 38 minuti. Conservare il CMS sterile nella confezione originale in una zona asciutta a 20-25 °C fino all'uso.

2. Preparazione dell'area chirurgica e manipolazione e preparazione del modello animale

1. Disinfettare l'area chirurgica, il piano di lavoro, il microscopio microchirurgico e il sedile con una soluzione di clorexidina al 2%. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, spugne chirurgiche, tamponi e teli chirurgici monouso attraverso la sterilizzazione a caldo (121 °C/30 min/100 kPa)
2. Assegnare i ratti (n = 5) in tre gruppi di cinque ratti per gruppo: 1. sham, 2. epatectomia e 3. epatectomia più CMS e seguire tutti i gruppi nei giorni 3, 14 e 21 giorni.
   1. Somministrare ketamina (35 mg/kg) e xilazina (2,5 mg/kg) per via intramuscolare nell'arto posteriore.
      NOTA: Il periodo sedativo dura in genere 30-40 minuti.
   2. Rasare la pelle addominale (5 cm x 2 cm) usando sapone chirurgico e una lama a doppio taglio e disinfettare la pelle con una soluzione topica di povidone-iodio al 10% in tre cicli¹⁷.
   3. Posizionare l'animale su una piastra calda in posizione dorsale decubito, con il collo iperesteso per mantenere una via aerea permeabile (Figura 2).
   4. Valutare la profondità dell'anestesia attraverso il pattern respiratorio e la perdita del riflesso di astinenza negli arti.
   5. Posizionare un drappo chirurgico monouso intorno alla pelle rasata e praticare un'incisione (2,5 cm) sulla linea degli albous con un bisturi, utilizzando il processo xifoide come punto di riferimento. Evitare il vaso sanguigno della parete addominale per prevenire il sanguinamento.
   6. Metti il divaricatore addominale in posizione e osserva la cavità addominale. Usando la pinica di dissezione, estrarre il lobo epatico sinistro e posizionarlo sulla piastra metallica (Figura 3A).
      NOTA: Nel gruppo fittizio, estrarre solo il lobo epatico sinistro e quindi restituire il fegato alla cavità addominale. Suturare la parete addominale e la pelle con una sutura di nylon 3-0.
   7. Nei gruppi sperimentali con e senza CMS, utilizzare una lama di bisturi e una lama di bisturi sterile (# 15) per eseguire l'epatectomia (circa il 40%) con due tagli. Utilizzare una smussata metallica triangolare (1 cm x 1 cm x 1 cm) per eseguire l'epatectomia (Figura 3B).
   8. Per prevenire il sanguinamento del fegato, mantenere la compressione chirurgica con un tampone sul bordo del fegato per 5 minuti.
   9. Idratare il CMS in soluzione salina sterile per 20 minuti prima della procedura chirurgica. Impiantare il CMS nel sito di epatectomia con quattro punti di sutura tra il tessuto epatico e il CMS per prevenire lo spostamento del biomateriale. Utilizzare suture di polipropilene non assorbibili 7-0 (Figura 3C).
      NOTA: Non rimuovere le suture in un secondo intervento chirurgico; le suture possono essere utilizzate come riferimento per identificare il sito di impianto del CMS.
   10. Riportare il fegato nella cavità addominale e suturare la parete addominale e la pelle con una sutura di nylon 3-0. Pulire l'incisione chirurgica con una spugna chirurgica imbevuta di iodio in due round. Osservare e monitorare i segni vitali degli animali.

3. Cura postoperatoria

1. Somministrare meglumina flunixin (2,5 mg/kg) per via intramuscolare nell'arto posteriore. Somministrare analgesici come approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
2. Per il recupero dell'anestesia, posizionare gli animali in singole scatole di policarbonato con lettiera per animali da laboratorio in un'area priva di rumore con controllo della temperatura (23 ° C).
3. Osservare il recupero degli animali e monitorare il loro consumo di acqua e cibo per 2 ore. Monitorare gli animali post-operatoriamente come approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

4. Valutazione della funzionalità epatica nel siero

1. Raccogliere campioni di sangue (500 μL) dalle vene laterali della coda degli animali anestetizzati prima della procedura chirurgica (valori basali) e nei giorni di valutazione 3, 14 e 21.
2. Centrifugare i campioni di sangue a 850 × g/10 min a temperatura ambiente (23 °C); separare il siero e conservarlo a -80°C fino all'uso.
3. Eseguire un pannello di test di funzionalità epatica: albumina sierica (ALB), fosfatasi alcalina (ALP), alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), bilirubina totale (TB) e bilirubina diretta (DB)(Tabella 1).

5. Eutanasia e gestione dei tessuti

1. Anestetizzare gli animali per ogni valutazione (giorni 3, 14 e 21) seguendo il protocollo sopra descritto.
2. Eutanasia tramite metodi approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
3. Eseguire un'incisione (5-6 cm) sulla linea degli albous con un bisturi per osservare gli organi della cavità addominale e scattare fotografie dell'area di epatectomia del sham e dei gruppi sperimentali, con e senza cms.
4. Prelevare campioni di fegato (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) da tutti gli animali del gruppo di studio e metterli in una soluzione di formaldeide al 4% per 24 ore per la successiva valutazione istologica.

6. Analisi istologica

1. Preservare i tessuti epatici in formaldeide al 4% e disidratare il tessuto utilizzando una serie di concentrazioni alcoliche (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); metterli in xilene (1h) e incorporarli nella paraffina¹⁶.
2. Tagliare i blocchi di paraffina con un microtomo in sezioni spesse 4 μm per la preparazione di otto diapositive.
3. Eseguire la colorazione tricromatica di H&E e Masson¹⁶.
4. Osservare le sezioni colorate al microscopio ottico per selezionare le aree rappresentative del fegato, con e senza CMS. Ottenere fotomicrografie con ingrandimento 4x, 10x e 40x ed elaborare le immagini utilizzando l'apposito software¹⁸ (vedere la Tabella dei Materiali).

Risultati

La demineralizzazione ossea influisce sulle proprietà meccaniche del CMS senza alterare la forma originale o l'interconnessione dei suoi pori. CMS può avere qualsiasi forma e, quindi, può essere regolato in base alle dimensioni e alla forma dell'organo o del tessuto selezionato¹⁹. Nel presente protocollo, abbiamo utilizzato un CMS triangolare (Figura 1A-D). Un modello di ratto è stato utilizzato per valutare la c...

Discussione

Il trapianto di organi è il pilastro del trattamento nei pazienti con fibrosi epatica o cirrosi. Alcuni pazienti beneficiano di questa procedura, rendendo necessario fornire alternative terapeutiche per i pazienti in lista d'attesa. L'ingegneria tissutale è una strategia promettente che impiega scaffold e cellule con potenziale rigenerativo^2,4,13. La rimozione di una porzione del fegato è un passo critico in questa procedura ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anionic detergent	Alconox	Z273228
Biopsy cassettes	Leica	3802453
Camera DMX	Nikon	DXM1200F
Centrifuge	Eppendorf	5424
Chlorhexidine gluconate 4%	BD	372412
Cover glasses 25 mm x 40 mm	Corning	2980-224
Eosin	Sigma-Aldrich	200-M	CAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, pure	Sigma-Aldrich	459836	CAS 64-17-5
Flunixine meglumide	MSD	Q-0273-035
Glass slides 75 mm x 25 mm	Corning	101081022
Hematoxylin	Merck	H9627	CAS 571-28-2
Hydrochloric acid 37%	Merck	339253	CAS 7647-01-0
Ketamine	Pisa agropecuaria	Q-7833-028
Light microscopy	Nikon	Microphoto-FXA
Microtainer yellow cape	Beckton Dickinson	365967
Microtome	Leica	RM2125
Model animal: Wistar rats	Universidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)	Covidien	1750-41
Polypropylene 7-0	Atramat	SE867/2-60
Povidone-iodine10% cutaneous solution	Diafra SA de CV	1.37E+86
Scaning electronic microscopy	Zeiss	DSM-950
Sodium hydroxide, pellets	J. T. Baker	3722-01	CAS 1310-73-2
Software ACT-1	Nikon	Ver 2.70
Stereoscopy macroscopy	Leica	EZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100S	Johnson and Johnson	99970
Surgipath paraplast	Leica	39601006
Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm)	SensiMedical	LAN-078-077
Tissue Processor (Histokinette)	Leica	TP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)	Sakura Finetek USA	5229
Trichrome stain kit	Sigma-Aldrich	HT15
Unicell DxC600 Analyzer	Beckman Coulter	BC 200-10
Xylazine	Pisa agropecuaria	Q-7833-099
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAS 1330-20-7