Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Riepilogo

I mitocondri sono organelli metabolici chiave che mostrano un alto livello di plasticità fenotipica nel muscolo scheletrico. L'importazione di proteine dal citosol è una via critica per la biogenesi degli organelli, essenziale per l'espansione del reticolo e il mantenimento della funzione mitocondriale. Pertanto, l'importazione di proteine funge da barometro della salute cellulare.

Abstract

I mitocondri sono organelli metabolici e regolatori chiave che determinano l'approvvigionamento energetico e la salute generale della cellula. Nel muscolo scheletrico, i mitocondri esistono in una serie di morfologie complesse, che vanno da piccoli organelli ovali a un'ampia rete simile al reticolo. Capire come il reticolo mitocondriale si espande e si sviluppa in risposta a diversi stimoli come le alterazioni della domanda di energia è stato a lungo un argomento di ricerca. Un aspetto chiave di questa crescita, o biogenesi, è l'importazione di proteine precursori, originariamente codificate dal genoma nucleare, sintetizzate nel citosol e traslocate in vari sottocomparti mitocondriali. I mitocondri hanno sviluppato un meccanismo sofisticato per questo processo di importazione, che coinvolge molti canali selettivi della membrana interna ed esterna, noti come meccanismo di importazione delle proteine (PIM). L'importazione nel mitocondrio dipende dal potenziale di membrana vitale e dalla disponibilità di ATP derivato dagli organelli attraverso la fosforilazione ossidativa. Pertanto la sua misurazione può servire come misura della salute degli organelli. Il PIM mostra anche un alto livello di plasticità adattiva nel muscolo scheletrico che è strettamente accoppiato allo stato energetico della cellula. Ad esempio, l'allenamento fisico ha dimostrato di aumentare la capacità di importazione, mentre il disuso muscolare lo riduce, in coincidenza con i cambiamenti nei marcatori del contenuto mitocondriale. Sebbene l'importazione di proteine sia un passo fondamentale nella biogenesi e nell'espansione dei mitocondri, il processo non è ampiamente studiato nel muscolo scheletrico. Pertanto, questo documento delinea come utilizzare mitocondri isolati e completamente funzionali dal muscolo scheletrico per misurare la capacità di importazione di proteine al fine di promuovere una maggiore comprensione dei metodi coinvolti e un apprezzamento dell'importanza del percorso per il turnover degli organelli nell'esercizio fisico, nella salute e nella malattia.

Introduzione

I mitocondri sono organelli che esistono in morfologie complesse in diversi tipi di cellule e sono riconosciuti per possedere una gamma crescente di funzioni che sono fondamentali per la salute cellulare. In quanto tali, non possono più essere ridotti semplicemente agli organelli che producono energia. I mitocondri sono regolatori metabolici chiave, determinanti del destino cellulare e hub di segnalazione, le cui funzioni possono servire come utili indicatori della salute cellulare generale. Nelle cellule muscolari scheletriche, gli studi di microscopia elettronica rivelano la presenza di mitocondri subsarcolemmali (SS) e intermiofibrillari (IMF) geograficamente distinti, che mostrano un grado di ^{connettività1,2,3,4} che è ora riconosciuto come altamente dinamico e adattabile ai cambiamenti nei livelli di attività muscolare scheletrica, nonché con l'età e la malattia. Il contenuto e la funzione mitocondriale nel muscolo possono essere valutati in numerosi ^modi5,6 e sono stati applicati metodi tradizionali di isolamento degli organelli per comprendere meglio le capacità respiratorie ed enzimatiche (Vmax) dei mitocondri distinte dall'influenza dell'ambiente ^cellulare7,8. In particolare, questi metodi tradizionali hanno rivelato sottili distinzioni biochimiche tra mitocondri isolati dalle regioni subsarcolemmali e intermiofibrillari, smentendo possibili implicazioni funzionali per il metabolismo in queste regioni subcellulari8,9,10,11.

La biogenesi dei mitocondri è unica nel richiedere il contributo di prodotti genici sia dal DNA nucleare che da quello mitocondriale. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono derivati dal nucleo poiché la trascrizione del mtDNA porta solo alla sintesi di 13 proteine. Poiché i mitocondri comprendono normalmente proteine >1000 coinvolte in diverse vie metaboliche, la biogenesi dell'organello richiede un mezzo strettamente regolato di importazione e assemblaggio di proteine precursori dal citosol nei vari sottocompartimenti mitocondriali per mantenere una corretta stechiometria e ^{funzione12,13}. Le proteine codificate nucleare destinate ai mitocondri normalmente trasportano una sequenza di targeting mitocondriale (MTS) che le indirizza all'organello e facilita la loro localizzazione sub-compartimentale. La maggior parte delle proteine legate alla matrice contengono un MTS N-terminale scissibile, mentre quelle destinate alla membrana mitocondriale esterna o interna di solito hanno domini di targeting ^interni14. Il processo di importazione viene effettuato da una serie di canali diversi che forniscono più strade per l'ingresso ^{nell'organello13}. Il complesso translocase della membrana esterna (TOM) trasporta i precursori dal citosol nello spazio intermembrana, dove sono riconosciuti dal translocase del complesso della membrana interna (TIM). Questo complesso è responsabile dell'importazione di precursori codificati nucleari nella matrice, dove le proteasi scisdono la presequenza di targeting N-terminale. Le proteine destinate alla membrana esterna possono essere inserite direttamente in questa membrana attraverso il complesso TOM, mentre quelle destinate alla membrana interna sono inserite da una proteina TIM, nello specifico TIM22. Dopo la loro importazione, le proteine vengono ulteriormente elaborate da proteasi e chaperoni residenti e spesso si combinano per formare complessi più grandi, come quelli che si trovano nella catena di trasporto degli elettroni.

L'importazione stessa di proteine mitocondriali serve anche come misura della salute mitocondriale, poiché questo processo si basa sulla presenza di potenziale di membrana e una fonte di energia sotto forma di ^ATP15. Ad esempio, quando il potenziale di membrana viene dissipato, la proteina chinasi PINK1 non può essere assorbita dall'organello, e questo porta a segnali di fosforilazione che innescano l'insorgenza della degradazione dell'organello attraverso una via chiamata ^{mitofagia16,17}. In circostanze analoghe, quando l'importazione è ostacolata, la proteina ATF5 non può entrare nell'organello e successivamente trasloca nel nucleo, dove funge da fattore di trascrizione per l'up-regolazione dell'espressione genica ^UPR18,19. Pertanto, la misurazione dell'efficienza dell'importazione di proteine può fornire una visione completa della salute dell'organello, mentre la risposta all'espressione genica può essere utilizzata per indicare il grado di segnalazione retrograda al nucleo.

Nonostante la sua ovvia importanza per la biogenesi dei mitocondri e per la salute cellulare in generale, la via di importazione nei mitocondri dei mammiferi è notevolmente poco studiata. In questo rapporto, descriviamo i passaggi specifici coinvolti nella misurazione dell'importazione di proteine precursori nei mitocondri del muscolo scheletrico e forniamo dati per illustrare la risposta adattativa del sistema di importazione ai cambiamenti muscolari e al disuso, illustrando il contributo dell'importazione proteica alla plasticità adattativa del muscolo scheletrico.

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati in questi esperimenti sono mantenuti nella struttura di cura degli animali della York University. Gli esperimenti sono condotti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care con l'approvazione del Comitato per la cura degli animali della York University (Permesso: 2017-08).

1. Isolamento funzionale dei mitocondri subsarcolemmali e intermiofibrillari dal muscolo scheletrico

1. Preparazione del reagente:
   1. Preparare tutti i buffer e i supporti come indicato nella Tabella 1.
   2. Impostare i tamponi a pH 7,4 e conservare a 4 °C (fino a 2 settimane), ad eccezione della proteasi della nagrasi.
   3. Preparare ogni volta la proteasi nagarse fresca (Tabella 1).
2. Rimozione dei tessuti e tritatura
   NOTA: Un diagramma di flusso dei passaggi seguenti per l'isolamento dei mitocondri è fornito nella Figura 1.
   1. Riempire un flaconcino di vetro a scintillazione con ~20 ml di Tampone 1 (Tabella 1) e metterlo sul ghiaccio.
   2. Mentre il topo è sotto anestesia, raccogliere i muscoli scheletrici (tibiale anteriore, quadricipite, gastrocnemio ecc.), circa 500-1000 mg, e posizionare i muscoli nella fiala di scintillazione contenente Tampone 1 refrigerato.
      NOTA: L'isoflurano gassoso viene utilizzato come anestetico al 2,5% ad una portata di 0,4 L di _O2/min. Viene eseguito un test di pizzico per garantire che l'animale non risponda.
   3. Dopo la raccolta dei tessuti, eutanasizzare l'animale tramite lussazione cervicale.
   4. Pre-raffreddare un bicchiere dell'orologio sul ghiaccio. Rimuovere qualsiasi grasso o tessuto connettivo dai muscoli e tritare il tessuto sul vetro dell'orologio fino a quando non è un liquame omogeneo.
   5. Posizionare il tessuto tritato in un tubo di centrifugazione di plastica pre-refrigerato da 50 ml (vedere Tabella dei materiali) e registrare il peso esatto.
   6. Diluire il tessuto tritato 10 volte con Tampone 1 + ATP (Tabella 1).
   7. Omogeneizzare il campione muscolare utilizzando un omogeneizzatore a doppia lama da 8 mm (vedi Tabella dei materiali) a una potenza di 9,8 Hz per 10 s, assicurando che non rimangano pezzi visibili di muscolo.
   8. Centrifugare i campioni a 800 x g per 10 minuti utilizzando una centrifuga ad alta velocità (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Lo scopo di questo passaggio è quello di separare le frazioni mitocondriali SS e IMF. Il supernato contiene mitocondri SS, mentre il pellet contiene mitocondri IMF.
3. Isolamento mitocondriale SS
   1. Filtrare il supernato attraverso un singolo strato di garza in un altro set di tubi di centrifugazione in plastica da 50 ml per rimuovere eventuali detriti o contaminanti di grandi dimensioni.
   2. Centrifugare il supernato a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
   3. Scartare il supernato e risospesciare il pellet in 3,5 ml di Tampone 1 + ATP.
      NOTA: Sospendere nuovamente con un P1000 e farlo con attenzione. I mitocondri sono organelli fragili. Eseguire delicatamente ed evitare di toccare il pellet con la punta della pipetta.
   4. Centrifugare il campione a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
   5. Scartare il supernato a meno che non si desideri un'ulteriore elaborazione per isolare una frazione citosolica priva di nuclei, mitocondri e altri organelli. Risospenare accuratamente il pellet in circa 95 μL del mezzo di risospensione (Tabella 1) utilizzando una pipetta P200.
      NOTA: analogamente al passaggio 1.3.3, evitare di toccare il pellet con la punta della pipetta. Il volume del mezzo di risospensione può essere modificato a seconda delle dimensioni del pellet. Questa è la frazione mitocondriale SS, che può essere immagazzinata sul ghiaccio fino a quando la frazione IMF non viene isolata. Se lo si desidera, la frazione citosolica, priva di organelli, può essere isolata centrifugando il supernato a 100.000 x g in un ultracentrifuga (vedi Tabella dei materiali) e successivamente scartando il pellet.
4. Isolamento mitocondriale IMF
   1. Diluire il pellet dal punto 1.2.8 di 10 volte nel tampone 1 + ATP. Risospesso utilizzando un pestello di Teflon mescolando delicatamente il pellet e il tampone insieme fino a quando il campione è coerente.
   2. Omogeneizzare il campione utilizzando un omogeneizzatore a doppia lama da 8 mm (vedi Tabella dei materiali) con una potenza di uscita di 9,8 Hz per 10 s.
   3. Centrifugare il campione a 800 x g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
   4. Scartare il supernato e diluire il pellet mitocondriale IMF 10 volte usando Buffer 2 e risospesciare usando il pestello di Teflon mescolando delicatamente fino a quando non è omogeneo.
   5. Aggiungere 25 μL/g di tessuto a 10 mg/mL di proteasi nagarse (Tabella 1) e posizionare il tubo di centrifugazione su un lato sul ghiaccio, mescolando delicatamente ogni minuto facendo oscillare il tubo da un lato all'altro.
      NOTA: L'aggiunta di nagarse aiuta a liberare i mitocondri del FMI eseguendo una digestione limitata delle miofibrille.
   6. Dopo 5 minuti, aggiungere 20 ml di Tampone 2 (Tabella 1) per diluire la proteasi nagarse fino al punto di inattività e interrompere la digestione.
   7. Centrifugare immediatamente il campione a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga ad alta velocità.
   8. Scartare il supernato e diluire il pellet 10 volte usando Buffer 2 e risospesciare usando un pestello di Teflon mescolando delicatamente.
   9. Centrifugare il campione a 800 x g per 15 min a 4 °C per pellettare il materiale fibroso.
   10. Versare il supernato in un nuovo set di tubi centrifuga in plastica da 50 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet, che può essere scartato.
   11. Centrifugare il campione a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C come al punto 1.4.7.
   12. Scartare il supernato, aggiungere 3,5 ml di Buffer 2 e risospesciare delicatamente il pellet usando una pipetta P1000.
   13. Centrifugare il campione a 9.000 x g per 10 minuti a 4 °C come al punto 1.4.7.
   14. Scartare il supernato e risospesciare delicatamente il pellet con circa 180 μL di mezzo di risospensione utilizzando una pipetta P200.
       NOTA: Il volume del mezzo di risospensione può essere modificato a seconda delle dimensioni del pellet. Questa è la frazione mitocondriale imf, che può essere conservata sul ghiaccio fino a quando non deve essere utilizzata nel test di importazione.

2. Importazione di proteine mitocondriali

1. In vitro trascrizione
   NOTA: questi passaggi successivi descrivono come preparare una proteina radiomarcata per l'importazione. La via di importazione in esame può dettare la scelta della proteina bersaglio, ad esempio, per valutare l'importazione nella matrice mitocondriale, l'ornitina carbamil transferasi, l'OCT e la malato deidrogenasi, MDH, sono comunemente usati, mentre Tom40 è comunemente usato come indicazione di importazione nella membrana mitocondriale esterna. Per i seguenti passaggi, è richiesto il DNA plasmidico che codifica la proteina di scelta. La trascrizione del DNA plasmidico può essere effettuata prima dell'isolamento mitocondriale in un giorno separato e l'mRNA raccolto da questo esperimento può essere memorizzato e utilizzato in futuri esperimenti di traduzione e importazione.
   1. Linearizzare il DNA: combinare 40 μL di DNA plasmidico (5 μg/μL), 5 μL di tampone enzimatico 10x e 5 μL di enzima di restrizione e incubare a 37 °C per 30 min.
      NOTA: Gli enzimi di restrizione utilizzati possono variare in base al plasmide, che può richiedere un diverso tampone enzimatico, e le condizioni sperimentali del DNA possono essere utilizzate in qualsiasi quantità / volume, poiché il modello può essere ridimensionato verso l'alto o verso il basso.
   2. Purificare e precipitare il DNA linearizzato usando fenolo ed etanolo. Eseguire tutte le fasi successive (2.1.3-2.1.15) in tubi sterili da 1,5 ml e utilizzare una centrifuga da tavolo (vedi Tabella dei materiali) per le fasi di centrifugazione.
   3. Aggiungere il volume appropriato di _H2O sterile in modo che il volume finale sia uguale a 400 μL. Quindi, aggiungere 400 μL di fenolo.
   4. Mescolare vigorosamente per inversione per ~10 s e centrifugare a 17.000 x g per 1 minuto a 4 °C. Prelevare e salvare la fase superiore.
   5. Aggiungere 400 μL di fenolo:cloroformio:isoamilalcol (25:24:1, v:v:v).
   6. Mescolare vigorosamente per inversione per ~10 s e centrifugare a 17.000 g per 1 minuto a 4 °C. Prelevare e salvare la fase superiore.
   7. Aggiungere 400 μL di cloroformio:isoamilalcol (24:1, v:v).
   8. Mescolare vigorosamente per inversione per ~10 s e centrifugare a 17.000 g per 1 minuto a 4 °C. Prelevare e salvare la fase superiore.
   9. Aggiungere 40 μL di acetato di sodio 3M (pH 7,0) e aggiungere 1 mL di etanolo al 95%.
   10. Posizionare i tubi sterili da 1,5 ml in un congelatore a -80 °C su un lato per 15 minuti.
   11. Centrifugare i campioni a 17.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   12. Scartare il supernato e lavare il pellet con 300 μL di etanolo all'80%.
   13. Centrifugare i campioni a 17.000 x g per 2 min a 4 °C.
   14. Scartare il supernato e asciugare all'aria il pellet. Una volta che il pellet è asciutto, dovrebbe essere chiaro.
   15. Risospendare il pellet in 20 μL di _H2O sterile
   16. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali) e assicurarsi che il rapporto _A260:280 sia superiore a 1,8.
   17. Diluire il DNA ad una concentrazione di 0,8 μg/μL in _H2O sterile.
   18. Trascrivere il DNA: Combinare plasmide (0,8 μg/μL, 60,8 μL), _H2O sterile (8,4 μL), 10 mM NTP (5,2 μL), 10 mM ATP (10,0 μL), 1 mM M-7-G (11,6 μL), la miscela come menzionato fase 2.1.19 (15,6 μL), RNAsina (5,2 μL) e un'appropriata RNA polimerasi (4,8 μL) per formare "una miscela di reazione" (volume totale = 121,6 μL) e incubare per 90 minuti alla temperatura ottimale per la polimerasi (37 °C per T7 polimerasi; 40 °C per SP6 polimerasi)
   19. Per preparare la miscela aggiungere 200 μL di 1M HEPES (pH 7,9), 100 μL di 1 M _MgAc2, 500 μL di 4 M KAc, 100 μL di 20 mM spermidina, 100 μL di 0,5 M DTT e 200 μL di _H20 sterile.
       NOTA: La reazione può essere scalata verso l'alto o verso il basso in volume purché vengano mantenute le proporzioni fornite di reagenti. L'RNA polimerasi utilizzata è dettata dalla sequenza del promotore batterico all'interno del plasmide utilizzato.
   20. Quindi, purificare e precipitare l'mRNA usando fenolo ed etanolo come nei passaggi 2.1.2-2.1.15. Portare il volume fino a 400 μL con _H2O sterile (aggiungere 280 μL) e procedere come descritto nei passaggi 2.1.2-2.1.15. Risospendare il pellet finale in 20 μL di _H2O sterile.
   21. Misurare la concentrazione di mRNA utilizzando uno spettrofotometro, assicurarsi che il rapporto _A260:280 sia ~2.0.
   22. Diluire l'mRNA a 2,8 μg/μL in _H2O sterile e conservare a -20 °C in aliquote da 50 μL.
2. Traduzione in vitro
   NOTA: La traduzione del DNA desiderato deve essere effettuata lo stesso giorno dell'esperimento di importazione. Questo esperimento richiede l'uso di amminoacidi radiomarcati, e quindi l'utente deve avere un permesso per l'uso di radioisotopi, e tutta la manipolazione e lo smaltimento devono essere in conformità con le politiche / requisiti dell'istituzione. Le misure di sicurezza dei radioisotopi sono state omesse o descritte brevemente, poiché probabilmente differiranno a seconda dell'istituzione.
   1. Preparare un mix di reazioni di traduzione sufficiente (Tabella 2) per fornire ~ 20 μL per campione di mitocondri da utilizzare nell'esperimento di importazione e includere lo stesso volume per una corsia di traduzione.
   2. Incubare la reazione per 30 minuti a 30 °C (il tempo può variare con l'mRNA, 25-60 min).
   3. Registrare l'uso di 35S-metionina secondo i requisiti di sicurezza radioattiva dell'istituzione e smaltire tutto ciò che è entrato in contatto con il radioisotopo secondo le linee guida dell'istituzione.
3. Importazione di proteine
   NOTA: i mitocondri appena isolati sono necessari per i passaggi successivi. Fare riferimento al protocollo di isolamento mitocondriale. Altri metodi di isolamento possono essere utilizzati purché i mitocondri siano vitali e funzionali. Per le fasi successive, i campioni mitocondriali utilizzati vengono risospesi in un tampone di risospensione come descritto sopra (Tabella 1). Anche la concentrazione proteica del campione mitocondriale deve essere misurata prima di iniziare il test di importazione.
   1. Circa 15 minuti dopo l'inizio della reazione di traslazione, aliquota 90 μg di mitocondri in tubi sterili da 1,5 ml e pre-incubazione a 30 °C per ~10 min.
      NOTA: Aliquot più mitocondri di quelli che saranno effettivamente utilizzati nell'esperimento; solo 75 μg saranno effettivamente utilizzati. Tuttavia, l'aliquota in eccesso non è un requisito.
   2. In un nuovo set di tubi sterili da 1,5 mL, combinare 75 μg di mitocondri con 18 μL della reazione di traslazione e incubare a 30 °C per il tempo desiderato.
   3. Mantenere il volume rimanente della reazione di traduzione sul ghiaccio; questo verrà utilizzato in seguito.
      NOTA: l'importazione è un processo dipendente dal tempo, quindi potrebbe essere prudente iniziare con un esperimento di corso temporale che varia in tempi di incubazione da 1 a 60 minuti. Un tempo di reazione tipico è di 30 min.
   4. Durante questo periodo, preparare il cuscino di saccarosio combinando 1 g di saccarosio, 200 μL di 2,5 M KCl, 10 μL 1 M _MgCl2, 100 μL di 1 M HEPES (pH 7,4) e portare il volume a 5 mL utilizzando _H2O sterile.
   5. Preparare un nuovo set di tubi sterili da 1,5 ml corrispondenti a ciascun tubo nella reazione di importazione. Aliquota 600 μL del cuscino di saccarosio in ciascun tubo e mantenere sul ghiaccio fino al termine della reazione di importazione.
   6. Per terminare la reazione di importazione dopo il tempo di incubazione appropriato, rimuovere il tubo da 30 °C, metterlo su ghiaccio e quindi trasferire con cura la reazione di importazione sulla parte superiore del tubo con il cuscino di saccarosio.
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito molto lentamente per garantire che i mitocondri non siano danneggiati / rotti. Il cuscino di saccarosio aiuta a rallentare la migrazione dei mitocondri e "ammortizza" la sua discesa verso il fondo del tubo durante la successiva fase di centrifugazione.
   7. Centrifugare i campioni + cuscino di saccarosio a 17.000 x g per 15 min a 4 °C.
   8. Preparare il tampone di rottura combinando 25 mL di sorbitolo da 2,4 M, 2 mL di 1 M HEPES (pH 7,4) e 72 mL di _H2O a doppia distillazione.
   9. Preparare il tampone di lisi per l'elettroforesi su gel SDS-PAGE: combinare 50 mL di glicerolo riscaldato, 11,5 g di SDS, 31,25 mL di 1 M Tris (pH 6,8) e portare il volume a 500 mL con _H2O a doppia distillazione.
   10. Per la preparazione del campione, miscelare 475 μL di tampone di lisi con 25 μL di β-mercaptoetanolo da utilizzare in una fase successiva.
       NOTA: il tampone di lisi può essere effettuato in anticipo e conservato a temperatura ambiente; tuttavia, l'aggiunta di β-mercaptoetanolo deve essere fatta fresca.
   11. Utilizzando una pipetta P1000, rimuovere con cura il supernato e non disturbare il pellet. Smaltire il supernato in un apposito contenitore per rifiuti radioattivi.
   12. Per l'importazione nella membrana esterna, eseguire questa operazione utilizzando Tom40, risospescere il pellet in 50 μL di carbonato di sodio 0,1 M appena preparato (pH 11,5) e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
   13. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione 14.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Questo passaggio viene eseguito solo per le reazioni di importazione della membrana esterna.
   14. Per preparare i campioni per l'elettroforesi SDS-PAGE, aggiungere 20 μL di tampone di rottura, 20 μL di tampone di lisi e β-mercaptoetanolo e risospeso bene. Aggiungere 5 μL di colorante campione.
   15. Preparare la corsia di controllo/traslazione combinando 3 μL della reazione di traslazione rimanente dal punto 2.3.3 con 37 μL di tampone di lisi e 5 μL di colorante campione. Mescolare bene.
   16. Far bollire i campioni per 5 minuti a 95 °C e ruotare delicatamente a bassa velocità per evitare di pellettizzare i mitocondri.
   17. Applicare i campioni su un gel di poliacrilammide SDS.
       NOTA: la percentuale di gel e il successivo tempo di esecuzione dipenderanno dalla proteina importata. Ad esempio, OCT è 37 kDa e la sua banda elaborata matura è leggermente più piccola; pertanto, un gel al 12% consente una buona separazione di queste bande.
   18. Una volta completata l'elettroforesi, rimuovere il gel e metterlo in _H2O a doppio distillato.
   19. Far bollire il gel in TCA al 5% in una cappa aspirante per 5 minuti, mescolando / spostando continuamente il gel per evitare screpolature.
       NOTA: TCA aiuta a solidificare il gel per la visualizzazione; questo può essere fatto in un vassoio di metallo sopra un bruciatore Bunsen. Usa abbastanza TCA per coprire generosamente il gel, ~ 1/2 pieno.
   20. Rimuovere il gel e rimetterlo in _H2O a doppio distillato. Agitarlo su una piastra rotante per 1 minuto a ~ 50 giri / min.
   21. Lavare il gel in Tris da 10 mM su una piastra rotante per 5 minuti a ~ 50 giri / min, di nuovo usando abbastanza per coprire generosamente il gel, ~ 1/2 del contenitore.
   22. Precipitare la proteina lavando il gel in acido saliciclico 1 M su una piastra rotante per 30 minuti, di nuovo usando abbastanza acido saliciclico per coprire generosamente il gel, ~ 1/2 del contenitore utilizzato.
   23. Disidratare il gel come descritto nei passaggi 2.3.24-2.3.31.
       NOTA: questo può essere fatto in diversi modi. Un essiccatore di gel (vedi Tabella dei materiali) fornisce un'opzione efficiente in termini di tempo (descritta di seguito); tuttavia è possibile utilizzare altri metodi / kit disponibili in commercio che possono essere più convenienti ma più dispendiosi in termini di tempo. I kit di essiccazione del gel possono essere utilizzati come alternativa che non richiede l'applicazione di calore o aspirazione, ma consente invece al gel di asciugarsi all'aria tra i fogli di cellophane per evitare distorsioni.
   24. Posizionare un grande foglio di carta assorbente sul letto poroso dell'essiccatore di gel. Posizionare un foglio di carta assorbente nell'area in cui verrà applicato il gel.
   25. Tagliare un pezzo di carta assorbente di 15 cm x 20 cm e posizionarlo sul tovagliolo di carta.
   26. Estrarre il gel dal contenitore usando un secondo pezzo di carta assorbente da 15 cm x 20 cm e adagiarlo in piano sopra il primo pezzo.
   27. Tagliare un pezzo leggermente più grande di pellicola trasparente, ~ 20 cm x 25 cm, e posizionarlo su gel, assicurandosi che non ci siano pieghe o bolle sotto l'involucro.
       NOTA: questa operazione potrebbe richiedere alcuni tentativi, ma è imperativo che non vi siano sacche d'aria intrappolate.
   28. Stendere delicatamente il coperchio di plastica dell'essiccatore di gel sopra l'involucro, assicurandosi nuovamente che non ci siano bolle o pieghe.
   29. Accendere la pompa / vuoto e assicurarsi che il coperchio di plastica abbia formato un sigillo. Testare il sigillo sollevando un angolo del coperchio di plastica e attendere che si richiuda.
   30. Chiudere l'essiccatore di gel e funzionare per 90 minuti. Impostare la temperatura in modo che inizi a 30 °C, raggiunga gradualmente 80 °C e poi torni a 30 °C alla fine della corsa.
   31. Una volta disidratato, il gel si solidificherà e si sentirà sottile come la carta. Avvolgere il gel nell'involucro di plastica utilizzato nel processo di essiccazione.
   32. Posizionare il gel disidratato in una cassetta di film con un film di fosforo (vedi Tabella dei materiali), con il lato bianco rivolto verso il gel. I tempi di esposizione variano ma possono essere 24-48 ore per la visualizzazione delle bande.
   33. Visualizza utilizzando l'autoradiografia utilizzando qualsiasi imager adatto in grado di eseguire l'imaging al fosforo.

Risultati

Abbiamo ampiamente illustrato che questo protocollo è un test valido per determinare il tasso di importazione nei mitocondri muscolari scheletrici isolati funzionali e intatti. Rispetto alle condizioni non trattate, l'importazione di proteine precursori tipiche come la malato deidrogenasi (MDH) nella matrice è sensibile al potenziale di membrana perché può essere inibita dalla valinomicina, un disaccoppiatore della catena respiratoria (Figura 2A). L'importazione è ostac...

Discussione

I mitocondri dipendono in modo univoco dall'espressione e dal coordinamento dei genomi nucleari e mitocondriali per la loro sintesi ed espansione all'interno delle cellule. Tuttavia, il genoma nucleare codifica la stragrande maggioranza (99%) del proteoma mitocondriale, e questo sottolinea l'importanza del meccanismo di importazione delle proteine nel sostenere la biogenesi mitocondriale. L'importazione funge anche da importante evento di segnalazione, poiché la mancata importazione può promuovere l'inizio della rispos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2% BSA	Sigma	A2153
35S-methionine	Perkin Elmer	NEG709A500UC	Purchase requires a valid radioisotope permit
ATP	Sigma	A7699
Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper	Thermo Fisher	05-714-5
Cassette for film	Kodak	Kodak Xomatic
Centrifugation Tube	Thermo Fisher	3138-0050
Chloroform	Thermo Fisher	C298-4
DTT	Sigma	D9779-5G
EDTA	BioShop	EDT002
EGTA	Sigma	E4378
Gel Dryer	BioRad	Model 583
Gel Drying Kit	Sigma or BioRad	Z377570-1PAK or OW-GDF-10	Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.
Glycerol	Caledon Laboratory Chemicals	5350-1-40
HEPES	Sigma	H3375
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-25 Centrifuge
Homogenizer	IKA	T25 Digital Ultra Turrex
Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol	Sigma	I9392
KAc	BioShop	POA301.500
KCl	Sigma	P3911
M7G	New England Biolab	S1404S	Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock
MgCl	BioShop	MAG510
MgSO4	Thermo Fisher	M65-500
MOPS	BioShop	MOP001
NaCl	BioShop	SOD001
NTP	Thermo Fisher	R0191
OCT Plasmid	-	-	Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877
pGEM4Z/hTom40 Plasmid	-	-	Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia
pGMDH Plasmid	-	-	Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine
Phenol	Sigma	P4557
Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol	Sigma	P3803	Can also be made with the ratio provided
Phosphorus Film	Fujifilm	BAS-IP MS 2025
Rabbit reticulocyte lysate	Promega	L4960	Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well
RNAsin	Promega	N2311
Rotor for High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SDS	BioShop	SDS001.500	Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.
Sodium acetate	Bioshop	SAA 304
Sodium Carbonate	VWR	BDH9284
Sodium salicylate	Millipore Sigma	106601
Sorbitol	Sigma	S6021
SP6 RNA Polymerase	Promega	P1085
Spectrophotometer	Thermo Fisher	Nanodrop 2000
Spermidine	Sigma	S-2626
Sucrose	BioShop	SUC507
T7 RNA Polymerase	Promega	P2075
Tabletop Centrifuge	Thermo Fisher	AccuSpin Micro 17
Trichloroacetic acid	Thermo Fisher	A322-500
Tris	BioShop	TRS001
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250-100ML