JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, geliştirilmiş bir kemotaksi test protokolü sunuyoruz. Bu protokolün amacı, geleneksel bakteriyel kemotaksi yöntemlerinin adımlarını ve maliyetlerini azaltmak ve bitki-mikrop etkileşimlerini anlamak için değerli bir kaynak olarak hizmet etmektir.

Özet

Kemotaksi tanımlaması, rizosfer büyümesini teşvik eden bakterilerin araştırılması ve uygulanması için çok önemlidir. Steril cam kaydıraklarda rizosfer büyümesini teşvik eden bakterilerin kemotaktik hareketini basit adımlarla teşvik edebilecek kemoattratantları hızlı bir şekilde tanımlamak için basit bir yöntem belirledik. Cam kaydırağa 1 cm aralıklarla bakteri çözeltisi (OD600 = 0.5) ve steril kemoattraktant sulu çözelti damla yönünde ilave edildi. Kemoattratant sulu çözeltiyi bakteriyel çözeltiye bağlamak için bir aşılama döngüsü kullanıldı. Slayt temiz tezgahta 20 dakika oda sıcaklığında tutuldu. Son olarak bakteriyel sayım ve mikroskobik gözlem için kemoattraktant sulu çözeltisi toplandı. Bu çalışmada, deneysel sonuçların birden fazla karşılaştırması ile, yöntem geleneksel bakteriyel kemotaksi yöntemlerinin birden fazla eksikliklerini aşmaktadır. Yöntem plaka sayma hatasını azalttı ve deneysel döngüyü kısalttı. Kemoattratant maddelerin tanımlanması için, bu yeni yöntem geleneksel yönteme kıyasla 2-3 gün tasarruf edebilir. Ek olarak, bu yöntem herhangi bir araştırmacının bakteriyel bir kemotaksi deneyini 1-2 gün içinde sistematik olarak tamamlamasını sağlar. Protokol, bitki-mikrop etkileşimlerini anlamak için değerli bir kaynak olarak kabul edilebilir.

Giriş

Kemotaksi, kökler üzerinde bitki büyümesini teşvik eden rizobakterinin (PGPR) kolonileştirilmesi ve bitki-mikrop etkileşimlerinin anlaşılması için önemlidir1. Bitki kökündeki düşük moleküler ağırlıklı bileşikler (kemoattraktantlar) sınıfı, PGPR'nin rizosfere kemotatik hareketini teşvik eder2. Malik asit, sitrik asit ve kök eksüdalarındaki diğer bileşenler Bacillus suşlarının kemotaksisini uyarır3. Örneğin, mısır kökündeki glikoz, sitrik asit ve fumarik asit, bakterileri kök yüzeyine toplar4. Kök eksüdalarından elde edilen D-galaktoz, Bacillus velezensis SQR95'in kemostaksisini indükler. Fümarat, malik asit ve süksinit de dahil olmak üzere organik asitler, Cajanus cajan - Zea mays intercropping sisteminde çeşitli PGPR'nin kemotaksisini ve kolonizasyonunu etkiler6. Pirinç kökündeki oleanolik asit eksüda eder, FP357 suşu için bir kemoattraktant görevi görür. Diğer bitki eksüdaları (histidin, arginin ve aspartat dahil) bakterilerin kemotaktik tepkisinde çok önemli bir rol oynayabilir8. Bitki eksüdaları, rizosfer kolonizasyonu sırasında ilk adım olan bakterilerin hareketini yönlendirmek için bir sinyal olarak işlev görür. PGPR tarafından bitki kolonizasyonu, PGPR bitki konağı için faydalı olduğu için muazzam bir alaka sürecidir.

Bakteriyel kemotaksi analizi için birçok yöntem kullanılmıştır. Yüzme plakası yöntemi daha önce açıklanan yöntemlerden biridir9. Bu yöntemde plakalar semisolid bir ortamla yapılmıştır. Plakaya agar (%1.0, w/v) içeren bir kemotaktik tampon eklendi. Tampon ısıtılır ve daha sonra kemoattraktant ile karıştırılır. Daha sonra plakanın ortasına damla yönünde 8 μL bakteri süspansiyonu eklendi ve plaka 28 °C'de bir inkübatöre yerleştirildi. Plaka düzenli olarak gözlemlendi ve fotoğraflandı. Ancak yüzme plakası yönteminin deneysel döngüsü çok uzundu. Kılcal damar benzeri yöntem10'da, pipet ucu 100 μL bakteri süspansiyonu tutmak için bir oda görevi görür. Kılcal damar olarak 1 mL şırınga iğnesi kullanılmıştır. 100 μL pipet ucuna farklı konsantrasyon gradyanlarına sahip kemoattratantlar içeren bir şırınga iğnesi yerleştirildi. Oda sıcaklığında 3 saat inkübasyondan sonra şırınga iğnesi çıkarıldı, içerik seyreltildi ve ortama kaplandı. Şırınddaki bakteri birikimi plakalarda koloni oluşturan birimler (CFO' lar) ile temsil edildi. Bununla birlikte, kılcal damar benzeri yöntem için kopyalar içindeki deneysel hata büyüktü. Başka bir yöntem bir mikroakışkan SlipChip cihazı kullandı11. Kısaca, sığır serum albümin (BSA) çözeltisi tüm kanallara enjekte edildi ve vakum kullanılarak çıkarıldı. Farklı kemoattratantlar (sadece nitel algılama için 1 mM konsantrasyon), fosfat tamponlu salin ve fosfat tamponlu salin tamponunda asılı bakteri hücreleri (negatif kontrol) içeren çözeltiler sırasıyla üst, orta ve alt mikrowelllere eklendi. Kuluçka daha sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlık bir ortamda gerçekleştirildi. Bakteri hücreleri daha sonra mikrowelllerde tespit edildi. Ancak mikroakışkan SlipChip cihazı pahalıydı. Bu nedenle, yukarıda açıklanan yöntemlerin her birinin avantajları ve dezavantajları vardı.

Karmaşık adımlar olmadan steril cam slaytlar kullanarak kök eksüdalarında rizobakteri kemoattratantlarının hızlı tanımlanması için geliştirilmiş bir kemotaksi tahlilini kurduk. Bu çalışmada, deneysel sonuçların birden fazla karşılaştırması ile, yöntem geleneksel bakteriyel kemotaksi yöntemlerinin birden fazla eksikliklerini aşmaktadır. Yöntem plaka sayma hatasını azalttı ve deneysel döngüyü kısalttı. Bu nedenle, kemoattratant bir maddeyi tanımlamak için kullanılırsa, bu yeni yöntem 2-3 gün tasarruf edebilir ve deneysel malzemelerin maliyetini azaltabilir.

Protokol

1. Malzeme ve ekipmanlar

NOT: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) bu çalışma için Çin'in kuzeydoğusundaki pirincin rizosferinden izole edilmiştir12,13.

  1. Kültür B. altitudinis Luria-Bertani (LB) ortamında LZP02 (pepton, 10 g L-1; NaCl, 8 g L-1 ve maya özü, 5 g L-1) 10 saat boyunca. Hücreleri 4 °C'de 2 dakika boyunca 9.569 x g'da santrifüjleme ile toplayın ve -80 °C'de% 15 gliserol ile saklayın.
    NOT: Bu deney için Heilongjiang Tarım Bilimleri Akademisi Pirinç Araştırma Enstitüsü tarafından pirinç tohumları (Oryza sativa Longgeng 46) sağlanmıştır.

2. Kök eksüdaları koleksiyonu

  1. Pirinç tohumlarını bir büyüme odasında rastgele dağıtın.
    NOT: Pirinç tohumları 30 dakika boyunca% 30 H2O2 ile sterilize edildi ve bir gecede suya batırıldı. Koşullar aşağıdaki gibiydi: kontrollü ışık (16/8 saat ışık / karanlık döngü), sıcaklık (22 ± 2 ° C) ve bağıl nem (% ͂ 70).
  2. Bir hafta boyunca pirinç tohumlarını kültürleyin ve iki kez steril su ekleyin.
  3. Benzer büyüklükteki pirinç fidelerini seçin ve 50 mL Murashige ve Skoog (MS) sıvı ortamında bitki. Aseptik koşullar altında 22 °C'de 48 saat kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Pirinç kökü eksüdaları MS ortamına serbest bırakılacaktır14,15,16.

3. Kök eksüdalarının sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi analizi

  1. Numunenin 100 μL'sini (kök eksüdaları içeren MS ortamı) 1,5 mL santrifüj tüpünde toplayın. Ekstraksiyon çözücüsünden 20 μL ekleyin (asetonitrile-metanol-su, 2:2:1, iç standart dahil). Örneği 4 dakika boyunca 45 Hz'de homojenize edin, ardından bir su banyosunda 5 dakika boyunca buz üzerinde ultrasonikasyon.
  2. Homojenizasyon ve ultrasonik döngüyü üç kez tekrarlayın. Numuneyi 1 saat boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın, ardından 133.778 x g ve 4 °C'de 15 dk santrifüjleme.
  3. Elde eden süpernatantı LC-MS şişelerine aktarın ve UHPLC-QE analizine kadar -80 °C'de saklayın. Tüm numunelerin süpernatantının eşit bölümlerini karıştırarak kalite kontrol (QC) örneklerini hazırlayın.
    NOT: Sunulan deneyde her örnek hacmi 600 μL (deney başına altı çoğaltma) idi.
  4. UHPLC sistemi, UPLC HSS T3 sütunu (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) ve Q Exactive12 kullanarak LC-MS/MS analizi yapın.
    1. Mobil faz olarak %0,1 formik asit sulu çözeltisi ve 5 mmol/L amonyum asetat sulu çözeltiyi mobil faz A ve asetonitril olarak mobil faz B olarak kullanın.
    2. Elution gradyanını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0 dk, %1 B; 1 dk, %1 B; 8 dk, %99 B. 10 dk, %99 B. 10.1 dk, %1 B; 12 dk, %1 B. Akış hızını ve enjeksiyon hacmini sırasıyla 0,5 mL/dk ve 2 μL olarak ayarlayın.
      NOT: Makromolekül (>1.000 Dalton) algılanamaz.

4. Kemotaksi tahlil

  1. Kemoattractant sulu çözeltisini hazırlayın. Steril olduğundan emin olun. Kemoattratant çözeltisini 0,22 μm bakteri filtresi ile filtreleyin.
    NOT: Kemoattratant sulu çözelti, suda çözünen LC-MS çalışmalarından elde edilen tek maddeydi. Konsantrasyon ve hacim farklı çalışmalara göre uygun şekilde ayarlanabilir. Örnek olarak sitrik asit çözeltisi kullanılmıştır. Tüm eylemler bir lambanın yanında yapılmalıdır.
  2. Cam slaydın orta konumunu 1 cm aralıklarla işaretleyin. Cam kaydırağın alev üzerinde birkaç kez sterilize olduğundan emin olun.
  3. Cam slaydın soluna 30 μL kemoattratant çözeltisini ekleyin. Bakterilerin LB ortamında logaritmik aşamaya (2 x 108 CFU/mL) kültüre edildiğine emin olun. Cam kaydırağın sağ kısmına 30 μL bakteri çözeltisi ekleyin.
    NOT: Eşit hacimde steril suya sahip negatif bir kontrol grubu hazırlayın. Salin çözeltisi (%0.9 NaCI), intermoleküler kuvvetin deney üzerindeki neden olduğu değişiklikleri ortadan kaldırmak için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.
  4. Bir aşılama halkasını alev üzerinde birkaç kez sterilize edin. Kemoattraktant sulu çözeltiyi bakteri çözeltisine bağlamak ve temiz bir tezgahta 20 dakika oda sıcaklığında tutmak için aşılama döngüsünü kullanın.
    NOT: Deney rüzgarsız bir ortamda yapılmalıdır. Farklı atletik yeteneklerin suşları için bağlantı hattının bağlantısını kesmeden önceki süreyi uygun şekilde ayarlayın.
  5. 20 dakika sonra, bağlantı hattını filtre kağıdıyla çıkarın.
  6. 1,5 mL santrifüj tüpünün steril olduğundan emin olun. Cam slaydın solundaki kemoattractant sulu çözeltiyi toplayın. Çözeltiyi 1,5 mL steril santrifüj tüpüne aktarın.
  7. Santrifüj tüpüne uygun safranin hacmini ekleyin. 2 dakika sonra, bakteri saymak ve mikroskobik gözlem için yanlış sıvıları bir kan sayma odası ile toplayın.

5. Sonuç analizi

  1. Aşağıdaki denklemi kullanarak çekilen canlı mikroorganizmaların sayısını belirleyin:
    figure-protocol-5168
    burada NBC: Toplam bakteri hücresi sayısı; N: 80 ızgaradaki bakteri sayısı.
    NOT: Veri analizi için istatistiksel analiz yazılımı kullanılmıştır. Hata üç farklı çoğaltılmış deneysel değere dayanıyordu ve tek yönlü ANOVA ve ardından Türkiye'nin post-hoc analizi kullanılarak hesaplandı. P ≤ 0.05 önemli olarak değerlendirildi.

Sonuçlar

Pozitif ve negatif iyon endekslerinde sırasıyla toplam 584 ve bilinen 937 metabolit saptanmıştır. Önceki çalışmalar kemoattraktantların tipik olarak organik asitler, amino asitler ve karbonhidratlar olduğunu göstermiştir17,18.

Bu çalışmada, sonraki deneyler için pirinç rizosfer eksüdatlarındaki LC-MS çalışmalarından 16 çeşit kemoattraktant seçilmiştir (Tablo 1). Yüzme plakası yöntemini ku...

Tartışmalar

Artan araştırmalar, bitki-bakteri etkileşimlerinin esas olarak rizosferde meydana geldiğini ve kök eksüdalarından etkilendiğini göstermektedir20,21,22,23,24. Bitki kökü eksüdaları, fenolik asitler, organik asitler ve amino asitlerin yanı sıra daha karmaşık ikincil bileşikler25,26,27 dahil olmak üzere çeşitli

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31870493), Heilongjiang, Çin'deki Temel Araştırma ve Geliştirme Projeleri (GA21B007) ve Çin'in Heilongjiang Eyaletindeki Üniversitelerin Temel Araştırma Ücretleri (No. 135409103) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2,5-dihydroxybenzoic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.490-79-9
AcetonitrileCNW Technologies75-05-8
Ammonium acetateCNW Technologies631-61-8
Caffeic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.331-39-5
CentrifugeThermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
Citric acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.77-92-9
Clean benchShanghai Boxun Industrial Co., Ltd.BJ-CD
Ferulic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.1135-24-6
Formic acidCNW Technologies64-18-6
FructoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.57-48-7
GalactoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.59-23-4
GlycineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-40-6
Grinding MillShanghai Jingxin Industrial Development
Co., Ltd.		JXFSTPRP-24
HistidineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.71-00-1
Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanineShanghai Hengbai Biotech C.,Ltd.103616-89-3
LeucineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.61-90-5
Malic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.6915-15-7
MannoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.3458-28-4
Mass SpectrometerThermo Fisher ScientificQ Exactive Focus
MethanolCNW Technologies67-56-1
Optical MicroscopeOlympusBX43
PhenylalanineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.63-91-2
ProlineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.147-85-3
ScalesSartoriusBSA124S-CW
SerineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-45-1
ThreonineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.72-19-5
UHPLCAgilent1290 UHPLC
Ultrasound InstrumentShenzhen Leidebang Electronics
Co., Ltd.		PS-60AL
ValineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.7004-03-7

Referanslar

  1. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
  2. Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
  3. Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
  4. Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685 (2015).
  5. Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
  6. Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan - Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331 (2021).
  7. Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575 (2020).
  8. Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
  9. Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
  10. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  11. Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
  12. Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
  13. Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516 (2020).
  14. Kaiira, M., Chemining'Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
  15. Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
  16. Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
  17. Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
  18. Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057 (2019).
  19. Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
  20. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
  21. Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
  22. Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
  23. Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
  24. Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
  25. Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
  26. Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
  27. Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 181kemotaksikemoattraktantbitki k k eks dalarbitki b y mesini te vik eden rizobakteriler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır