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Un protocollo semplice e completo per acquisire dettagli tridimensionali dei siti di contatto della membrana tra organelli negli epatociti dal fegato o cellule in altri tessuti.
La microscopia elettronica a trasmissione è stata a lungo considerata il gold standard per la visualizzazione dell'ultrastruttura cellulare. Tuttavia, l'analisi è spesso limitata a due dimensioni, ostacolando la capacità di descrivere completamente l'ultrastruttura tridimensionale (3D) e la relazione funzionale tra gli organelli. La microscopia elettronica volumetrica (vEM) descrive una raccolta di tecniche che consentono l'interrogazione dell'ultrastruttura cellulare in 3D a mesoscala, microscala e risoluzioni su scala nanometrica.
Questo protocollo fornisce un metodo accessibile e robusto per acquisire dati vEM utilizzando la trasmissione a sezione seriale EM (TEM) e copre gli aspetti tecnici dell'elaborazione dei campioni fino alla ricostruzione 3D digitale in un unico flusso di lavoro semplice. Per dimostrare l'utilità di questa tecnica, viene presentata la relazione ultrastrutturale 3D tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri e i loro siti di contatto negli epatociti epatici. I contatti interorganelle svolgono ruoli vitali nel trasferimento di ioni, lipidi, sostanze nutritive e altre piccole molecole tra gli organelli. Tuttavia, nonostante la loro scoperta iniziale negli epatociti, c'è ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche fisiche, dinamiche e funzioni.
I contatti interorganelle possono mostrare una gamma di morfologie, che variano nella vicinanza dei due organelli l'uno all'altro (in genere ~ 10-30 nm) e l'estensione del sito di contatto (dai contatti puntati ai contatti 3D più grandi simili a cisternali). L'esame dei contatti stretti richiede l'imaging ad alta risoluzione e la sezione seriale TEM è adatta per visualizzare l'ultrastrutturale 3D dei contatti interorganelle durante la differenziazione degli epatociti, nonché le alterazioni dell'architettura degli epatociti associate a malattie metaboliche.
Dalla loro invenzione nel 1930, i microscopi elettronici hanno permesso ai ricercatori di visualizzare i componenti strutturali di cellule e tessuti 1,2. La maggior parte delle indagini ha fornito informazioni 2D, poiché la costruzione di modelli 3D richiede una scrupolosa raccolta di sezioni seriali, fotografia manuale, elaborazione negativa, tracciamento manuale e la creazione e l'assemblaggio di modelli 3D da lastre di vetro, plastica o polistirolo 3,4. Quasi 70 anni dopo, ci sono stati notevoli progressi in numerosi aspetti del processo, dalle prestazioni del microscopio, alla raccolta di sezioni seriali, all'imaging digitale automatizzato, al sofisticato software e hardware per la ricostruzione, la visualizzazione e l'analisi 3D ad approcci alternativi per quello che ora è collettivamente chiamato volume EM (vEM). Queste tecniche vEM sono generalmente considerate per fornire informazioni ultrastrutturali 3D a risoluzioni nanometriche su scale micron e comprendono la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e le più recenti tecniche di microscopia elettronica a scansione (SEM); vedi recensioni 5,6,7,8.
Ad esempio, il fascio ionico focalizzato SEM (FIB-SEM) utilizza un fascio ionico focalizzato all'interno di un SEM per fresare la superficie del blocco tra scansioni sequenziali seM della superficie del blocco, consentendo la fresatura / imaging automatizzato ripetuto di un campione e la creazione di un set di dati 3D per la ricostruzione 9,10. Al contrario, il blocco seriale FACCIA SEM (SBF-SEM) utilizza un ultramicrotomo all'interno del SEM per rimuovere materiale dalla faccia del blocco prima dell'imaging 11,12, mentre la tomografia array è un processo non distruttivo che richiede la raccolta di sezioni seriali, su coverslip, wafer o nastro, prima di impostare un flusso di lavoro automatizzato di imaging della regione di interesse nelle sezioni sequenziali nel SEM per generare il set di dati 3D13 . Simile alla tomografia ad array, la sezione seriale TEM (ssTEM) richiede che le sezioni fisiche siano raccolte prima dell'imaging; tuttavia, queste sezioni sono raccolte su griglie TEM e fotografate in un TEM 14,15,16. ssTEM può essere esteso eseguendo la tomografia tilt 17,18,19. La tomografia inclinabile seriale fornisce la migliore risoluzione in x, y e z e, sebbene sia stata utilizzata per ricostruire intere celle20, è ragionevolmente impegnativa. Questo protocollo si concentra sugli aspetti pratici di ssTEM come la tecnica vEM più accessibile disponibile per molti laboratori EM che potrebbero non avere attualmente accesso a strumenti specializzati di sezionamento o vEM, ma trarrebbero vantaggio dalla generazione di dati vEM 3D.
L'ultramicrotomia seriale per la ricostruzione 3D è stata precedentemente considerata impegnativa. Era difficile tagliare nastri dritti di spessore di sezione uniforme, essere in grado di disporre e raccogliere nastri delle dimensioni corrette, nell'ordine corretto, su griglie con supporto sufficiente, ma senza barre della griglia che oscuravano le regioni di interesse e, soprattutto, senza perdere sezioni, poiché una serie incompleta potrebbe impedire la ricostruzione 3D completa21. Tuttavia, i miglioramenti agli ultramicrotomi commerciali, i coltelli da taglio e rifilatura diamantati 22,23, le pellicole di supporto elettrone lucente sulle griglie 21,24 e gli adesivi per aiutare l'adesione della sezione e la conservazione del nastro13,21 sono solo alcuni dei progressi incrementali nel corso degli anni che hanno reso la tecnica più di routine in molti laboratori. Una volta raccolte le sezioni seriali, l'imaging seriale in TEM è semplice e può fornire immagini EM con dimensioni px subnanometriche in x e y, consentendo l'interrogazione ad alta risoluzione delle strutture subcellulari, un potenziale requisito per molte domande di ricerca. Il caso di studio qui presentato dimostra l'uso di ssTEM e ricostruzione 3D nello studio dei contatti reticolo endoplasmatico (ER)-organello negli epatociti epatici, dove i contatti ER-organello sono stati osservati per la prima volta25,26.
Pur essendo contiguo con l'involucro nucleare, l'ER ha anche stretti contatti con numerosi altri organelli cellulari, tra cui lisosomi, mitocondri, goccioline lipidiche e la membrana plasmatica27. I contatti ER-organello sono stati implicati nel metabolismo lipidico28, nella segnalazione fosfoinositide e calcio29, nella regolazione dell'autofagia e nella risposta allo stress30,31. I contatti ER-organello e altri contatti interorganelle sono strutture altamente dinamiche che rispondono alle esigenze metaboliche cellulari e ai segnali extracellulari. È stato dimostrato che variano morfologicamente nelle loro dimensioni e forma e nelle distanze tra le membrane degli organelli32,33. Si ritiene che queste differenze ultrastrutturali riflettano probabilmente le loro diverse composizioni proteiche / lipidiche e la funzione34,35. Tuttavia, è ancora un compito impegnativo definire i contatti interorganelle e analizzarli36. Pertanto, è necessario un protocollo affidabile ma semplice per esaminare e caratterizzare i contatti interorganelle per ulteriori indagini.
Poiché i contatti ER-organello possono variare da 10 a 30 nm nella separazione membrana-membrana, il gold standard per l'identificazione è stato storicamente TEM. Il TEM a sezione sottile ha rivelato la localizzazione di sottodomini specifici per le proteine ER residenti a contatti di membrana distinti37. Tradizionalmente, questo ha rivelato contatti ER-organello con risoluzione nm, ma spesso ha presentato solo una visione 2D di queste interazioni. Tuttavia, gli approcci vEM rivelano la presentazione ultrastrutturale e il contesto di questi siti di contatto in 3D, consentendo la ricostruzione completa dei contatti e una classificazione più accurata dei contatti (punto vs. tubolare vs. simile a cisternale) e la quantificazione38,39. Oltre ad essere il primo tipo di cellula in cui sono stati osservati contatti ER-organello25,26, gli epatociti hanno un ampio sistema di altri contatti interorganelli che svolgono ruoli vitali nella loro architettura e fisiologia28,40. Tuttavia, manca ancora un'accurata caratterizzazione morfologica dell'ER-organello e di altri contatti interorganelli negli epatociti. Di conseguenza, il modo in cui i contatti interorganelle si formano e rimodellano durante la rigenerazione e la riparazione è di particolare rilevanza per la biologia degli epatociti e la funzionalità epatica.
Tutti gli animali sono stati alloggiati in conformità con le linee guida del Ministero degli Interni del Regno Unito e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con l'Animal (Scientific Procedures) Act del Regno Unito del 1986.
1. Fissazione e preparazione del campione
2. Disidratazione del campione, incorporamento della resina Epon e montaggio
3. Taglio e sezionamento seriale di campioni incorporati
NOTA: il sezionamento è un'abilità appresa; gli utenti dovrebbero essere abili nel sezionamento ultrasottile prima di tentare il sezionamento seriale. Poiché i controlli esatti dei microtomi variano da produttore a produttore, seguire le istruzioni e le linee guida del produttore.
Figura 1: Flusso di lavoro TEM della sezione seriale. (A) Diagramma del campione nel blocco di resina. (B) Tagliare il blocco per generare una forma trapezoidale con bordi adatti per il sezionamento seriale e la faccia asimmetrica del blocco per garantire l'orientamento noto. (C) Diagramma che mostra nastri di sezioni seriali, che galleggiano sulla superficie dell'acqua nella barca del coltello diamantato. (D) Diagramma che mostra l'organizzazione della sezione e del nastro, dettando l'ordine delle sezioni, su una griglia di fessure TEM di 3 mm di diametro. (E) Imaging e navigazione TEM. Visualizzazione dell'ordine del nastro e delle sezioni e utilizzo di "adesivi a stella gialla" sul monitor per il riferimento allo schermo per garantire la reimaging della stessa regione di interesse nelle sezioni successive. (F) Allineamento e ritaglio dell'immagine. (G) Segmentazione, ricostruzione 3D e visualizzazione. Abbreviazione: TEM = microscopia elettronica a trasmissione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Colorazione della griglia
5. Acquisizione di immagini da parte di TEM
NOTA: poiché i controlli TEM esatti variano da produttore a produttore, seguire le istruzioni e le linee guida del produttore. I seguenti passaggi devono essere eseguiti da utenti che sono già esperti nell'uso di TEM.
6. Esportazione di immagini e registrazione dell'allineamento della sezione seriale
Figura 2: Creazione di uno stack seriale e allineamento della sezione seriale utilizzando Fiji. (A) Screenshot che mostra le opzioni di sequenza durante il caricamento delle immagini per la creazione di uno stack seriale. (B) Screenshot del plugin TrackEM2 e delle finestre chiave del plugin. Premete OK nella separazione slice per procedere con l'allineamento. (C) Screenshot dopo aver caricato correttamente lo stack seriale nel riquadro di visualizzazione. Una volta selezionate allinea le sezioni dello stack , verranno visualizzate tre finestre sequenziali dei parametri di allineamento. Esportare lo stack allineato una volta completato l'allineamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
7. Segmentazione e ricostruzione 3D
Figura 3: Segmentazione dello stack seriale utilizzando Amira. (A) La finestra popup di definizione voxel prima di caricare uno stack allineato. (B) Screenshot dell'interfaccia del progetto dopo l'importazione di uno stack. Selezionate la scheda Segmentazione per avviare la traccia degli oggetti nel pannello Editor segmentazione. (C) Caratteristiche principali della scheda segmentazione. Definire gli oggetti per la segmentazione nella sezione Editor segmentazione della scheda Segmentazione. Utilizzare la funzione di zoom per facilitare l'identificazione degli oggetti. Selezionate lo strumento pennello e tracciate il contorno dell'oggetto. Fare clic sul simbolo + in Selezione per assegnare la traccia. Un oggetto assegnato apparirà con un limite rosso nel riquadro di visualizzazione dell'ortoslice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
NOTA: nell'interfaccia del progetto verrà visualizzato un nodo dello stack di immagini e un'ortoslice nel riquadro di visualizzazione a destra (Figura 3B).
Per questa tecnica, le regioni di interesse vengono selezionate in base all'obiettivo della ricerca biologica e identificate prima del taglio e del sezionamento del tessuto incorporato. Allo stesso modo, la dimensione della faccia del blocco può essere dettata dalla domanda di ricerca; in questo caso, il campione è stato tagliato per lasciare una faccia di blocco di circa 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Ciò ha permesso di creare due griglie di 9 sezioni seriali per griglia, fornendo 18 sezi...
In questo protocollo è descritta una tecnica vEM accessibile per visualizzare la struttura e le interazioni degli organelli in 3D. La morfologia dei contatti interorganelle negli epatociti è presentata come un caso di studio qui. Tuttavia, questo approccio è stato applicato anche per studiare una varietà di altri campioni e aree di ricerca, tra cui le interazioni cellula-endotelio di Schwann nei nervi periferici45, la biogenesi del corpo di Weibel Palade nelle cellule endoteliali
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamo Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro e Ania Straatman-Iwanowska per l'assistenza tecnica esperta. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Stefan e Ian J. White per le discussioni utili. J.J.B. è supportato da finanziamenti MRC al MrC Laboratory of Molecular Cell Biology presso uCL, codice di assegnazione MC_U12266B. C.J.S. è supportato dal finanziamento MRC al MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit presso uCL, codice di assegnazione MC_UU_00012/6. P.G. è finanziato dal Consiglio europeo della ricerca, codice di sovvenzione ERC-2013-StG-337057.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Aluminum trays | Agar Scientific | AGG3912 | |
Amira v6 | ThermoFisher | https://www.thermofisher.com | |
Chloroform | Fisher | C/4960/PB08 | |
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride | TAAB | T027 | Epon ingredient |
Diamond knife | DiaTOME | ultra 45° | |
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol | TAAB | D032 | Epon ingredient |
Dumont Tweezers N5 | Agar Scientific | AGT5293 | |
Fiji | https://imagej.net/ | ||
Fiji TrakEM2 plugin | https://imagej.net/ | ||
Formaldehyde 36% solution | TAAB | F003 | |
Formvar coated slot grid | Homemade | Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu) | |
Glass bottle with applicator rod | Medisca | 6258 | |
Glass vials | Fisher Scientific | 15364769 | |
Gluteraldehyde 25% solution | TAAB | G011 | |
MNA/Methyl Nadic Anhydride | TAAB | M011 | Epon ingredient |
Osmium Tetroxide 2% solution | TAAB | O005 | |
Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
Propylene oxide | Fisher Scientific | E/0050/PB08 | |
Reuseable adhesive | Blue Tack | ||
Reynolds Lead Citrate | TAAB | L037 | Section stain |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C-0250 | to make 0.1 M Caco buffer |
Super Glue | RS Components | 918-6872 | Cyanoacrylate glue, Step 1.3 |
TAAB 812 Resin | TAAB | T023 | Epon ingredient |
Tannic acid | TAAB | T046 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Two part Epoxy Resin | RS Components | 132-605 | Alternative: Step 2.13 |
Ultramicrotome | Leica | UC7 | |
Vibrating microtome | Leica | 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude . | |
Weldwood Original Contact cement | DAP | 107 | Contact adhesive: Step 3.1.4 |
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