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Un protocollo semplice e completo per acquisire dettagli tridimensionali dei siti di contatto della membrana tra organelli negli epatociti dal fegato o cellule in altri tessuti.
La microscopia elettronica a trasmissione è stata a lungo considerata il gold standard per la visualizzazione dell'ultrastruttura cellulare. Tuttavia, l'analisi è spesso limitata a due dimensioni, ostacolando la capacità di descrivere completamente l'ultrastruttura tridimensionale (3D) e la relazione funzionale tra gli organelli. La microscopia elettronica volumetrica (vEM) descrive una raccolta di tecniche che consentono l'interrogazione dell'ultrastruttura cellulare in 3D a mesoscala, microscala e risoluzioni su scala nanometrica.
Questo protocollo fornisce un metodo accessibile e robusto per acquisire dati vEM utilizzando la trasmissione a sezione seriale EM (TEM) e copre gli aspetti tecnici dell'elaborazione dei campioni fino alla ricostruzione 3D digitale in un unico flusso di lavoro semplice. Per dimostrare l'utilità di questa tecnica, viene presentata la relazione ultrastrutturale 3D tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri e i loro siti di contatto negli epatociti epatici. I contatti interorganelle svolgono ruoli vitali nel trasferimento di ioni, lipidi, sostanze nutritive e altre piccole molecole tra gli organelli. Tuttavia, nonostante la loro scoperta iniziale negli epatociti, c'è ancora molto da imparare sulle loro caratteristiche fisiche, dinamiche e funzioni.
I contatti interorganelle possono mostrare una gamma di morfologie, che variano nella vicinanza dei due organelli l'uno all'altro (in genere ~ 10-30 nm) e l'estensione del sito di contatto (dai contatti puntati ai contatti 3D più grandi simili a cisternali). L'esame dei contatti stretti richiede l'imaging ad alta risoluzione e la sezione seriale TEM è adatta per visualizzare l'ultrastrutturale 3D dei contatti interorganelle durante la differenziazione degli epatociti, nonché le alterazioni dell'architettura degli epatociti associate a malattie metaboliche.
Dalla loro invenzione nel 1930, i microscopi elettronici hanno permesso ai ricercatori di visualizzare i componenti strutturali di cellule e tessuti 1,2. La maggior parte delle indagini ha fornito informazioni 2D, poiché la costruzione di modelli 3D richiede una scrupolosa raccolta di sezioni seriali, fotografia manuale, elaborazione negativa, tracciamento manuale e la creazione e l'assemblaggio di modelli 3D da lastre di vetro, plastica o polistirolo 3,4. Quasi 70 anni dopo, ci sono stati notevoli progressi in numerosi aspetti del processo, dalle pres....
Tutti gli animali sono stati alloggiati in conformità con le linee guida del Ministero degli Interni del Regno Unito e la raccolta dei tessuti è stata effettuata in conformità con l'Animal (Scientific Procedures) Act del Regno Unito del 1986.
1. Fissazione e preparazione del campione
Per questa tecnica, le regioni di interesse vengono selezionate in base all'obiettivo della ricerca biologica e identificate prima del taglio e del sezionamento del tessuto incorporato. Allo stesso modo, la dimensione della faccia del blocco può essere dettata dalla domanda di ricerca; in questo caso, il campione è stato tagliato per lasciare una faccia di blocco di circa 0,3 mm x 0,15 mm (Figura 4A). Ciò ha permesso di creare due griglie di 9 sezioni seriali per griglia, fornendo 18 sezi.......
In questo protocollo è descritta una tecnica vEM accessibile per visualizzare la struttura e le interazioni degli organelli in 3D. La morfologia dei contatti interorganelle negli epatociti è presentata come un caso di studio qui. Tuttavia, questo approccio è stato applicato anche per studiare una varietà di altri campioni e aree di ricerca, tra cui le interazioni cellula-endotelio di Schwann nei nervi periferici45, la biogenesi del corpo di Weibel Palade nelle cellule endoteliali
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamo Joanna Hanley, Rebecca Fiadeiro e Ania Straatman-Iwanowska per l'assistenza tecnica esperta. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Stefan e Ian J. White per le discussioni utili. J.J.B. è supportato da finanziamenti MRC al MrC Laboratory of Molecular Cell Biology presso uCL, codice di assegnazione MC_U12266B. C.J.S. è supportato dal finanziamento MRC al MRC Laboratory of Molecular Cell Biology University Unit presso uCL, codice di assegnazione MC_UU_00012/6. P.G. è finanziato dal Consiglio europeo della ricerca, codice di sovvenzione ERC-2013-StG-337057.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Aluminum trays | Agar Scientific | AGG3912 | |
Amira v6 | ThermoFisher | https://www.thermofisher.com | |
Chloroform | Fisher | C/4960/PB08 | |
DDSA/Dodecenyl Succinic Anhydride | TAAB | T027 | Epon ingredient |
Diamond knife | DiaTOME | ultra 45° | |
DMP-30/2,4,6-tri (Dimethylaminomethyl) phenol | TAAB | D032 | Epon ingredient |
Dumont Tweezers N5 | Agar Scientific | AGT5293 | |
Fiji | https://imagej.net/ | ||
Fiji TrakEM2 plugin | https://imagej.net/ | ||
Formaldehyde 36% solution | TAAB | F003 | |
Formvar coated slot grid | Homemade | Alternative: EMS diasum (FF2010-Cu) | |
Glass bottle with applicator rod | Medisca | 6258 | |
Glass vials | Fisher Scientific | 15364769 | |
Gluteraldehyde 25% solution | TAAB | G011 | |
MNA/Methyl Nadic Anhydride | TAAB | M011 | Epon ingredient |
Osmium Tetroxide 2% solution | TAAB | O005 | |
Potassium Ferricyanide | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
Propylene oxide | Fisher Scientific | E/0050/PB08 | |
Reuseable adhesive | Blue Tack | ||
Reynolds Lead Citrate | TAAB | L037 | Section stain |
Sodium Cacodylate | Sigma-Aldrich | C-0250 | to make 0.1 M Caco buffer |
Super Glue | RS Components | 918-6872 | Cyanoacrylate glue, Step 1.3 |
TAAB 812 Resin | TAAB | T023 | Epon ingredient |
Tannic acid | TAAB | T046 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Two part Epoxy Resin | RS Components | 132-605 | Alternative: Step 2.13 |
Ultramicrotome | Leica | UC7 | |
Vibrating microtome | Leica | 100 µm thick slices, 0.16 mm/s cutting at 1 mm amplitude . | |
Weldwood Original Contact cement | DAP | 107 | Contact adhesive: Step 3.1.4 |
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