Esterilización por radiación gamma de baja dosis para injertos traqueales descelularizados

Resumen

La esterilización es esencial para el trasplante de tejido traqueal. En este documento, presentamos un protocolo de esterilización utilizando irradiación gamma de baja dosis que es totalmente tolerada por los órganos.

Resumen

Uno de los principales aspectos clave para asegurar que un trasplante evoluciona correctamente es la esterilidad del medio. El trasplante traqueal descelularizado implica implantar un órgano que originalmente estaba en contacto con el medio ambiente, por lo que no es estéril desde el principio. Si bien el protocolo de descelularización (a través de la exposición con detergente [dodecil sulfato de sodio al 2%, agitación continua y choques osmóticos) se lleva a cabo de acuerdo con las medidas asépticas, no proporciona esterilización. Por lo tanto, uno de los principales desafíos es garantizar la esterilidad previa a la implantación in vivo . Aunque existen protocolos establecidos de esterilización por radiación gamma para materiales inorgánicos, no existen tales medidas para materiales orgánicos. Además, los protocolos establecidos para materiales inorgánicos no se pueden aplicar a materiales orgánicos, ya que la dosis de radiación establecida (25 kGy) destruiría completamente el implante. Este artículo estudia el efecto de una dosis de radiación escalada en una tráquea de conejo descelularizada. Mantuvimos el rango de dosis (kGy) y probamos las dosis escalonadas hasta encontrar la dosis mínima a la que se logra la esterilización. Después de determinar la dosis, estudiamos los efectos de la misma en el órgano, tanto histológica como biomecánicamente. Determinamos que mientras 0,5 kGy no alcanzaban la esterilidad, las dosis de 1 kGy y 2 kGy sí lo hacían, siendo 1 kGy, por lo tanto, la dosis mínima necesaria para lograr la esterilización. Los estudios microscópicos no mostraron cambios relevantes en comparación con los órganos no esterilizados. Las características biomecánicas axiales no se alteraron en absoluto, y solo se observó una ligera reducción en la fuerza por unidad de longitud que el órgano puede tolerar radialmente. Por lo tanto, podemos concluir que 1 kGy logra la esterilización completa de la tráquea de conejo descelularizada con un efecto mínimo, si es que tiene alguno, en el órgano.

Introducción

La esterilización de un implante es un requisito básico para su viabilidad; De hecho, las prótesis que han demostrado ser exitosas son aquellas implantadas en áreas estériles (vasos sanguíneos, corazón, hueso, etc.) ¹. La tráquea tiene dos superficies: una superficie en contacto con el ambiente externo, que por lo tanto no es estéril, y una superficie hacia el mediastino, que es estéril. Por lo tanto, desde el momento en que se extrae la tráquea, no es un órgano estéril. A pesar de que el proceso de descelularización posterior se lleva a cabo en condiciones máximas estériles, no es una etapa de esterilización². La implantación de material extraño en sí misma conlleva un riesgo de infección debido al microambiente probacteriano que produce³y un riesgo de transmisión de enfermedades del donante al receptor, incluso si el material ha sido esterilizado⁴. Para asegurar la correcta vascularización de la tráquea, en casi todos los protocolos experimentales de trasplante, primero se somete al implante heterotópico ^5,6,7 en un área estéril (músculo, fascia, epiplón, subcutáneo, etc.); Esto se debe a que la implantación de un elemento no estéril en este medio conduciría a la infección del área³.

Hay una gama de estrategias posibles para obtener un implante estéril. El uso de_CO2supercrítico ha logrado la esterilización terminal ^8,9. Otros métodos, como la radiación ultravioleta o el tratamiento con sustancias como el ácido peracético, el etanol, el peróxido de oxígeno y el agua electrolizada, han obtenido diferentes tasas de éxito en la esterilización, casi siempre dependiendo de sus dosis, pero se ha demostrado que afectan a las características biomecánicas de los implantes. De hecho, algunas sustancias, como el óxido de etileno, pueden cambiar sustancialmente la estructura de la matriz implantada e incluso pueden causar efectos inmunogénicos indeseables. Por esta razón, muchas de estas estrategias no pueden ser aplicadas a modelos biológicos 2,10,11,12,13.

La estrategia de esterilización más estudiada y aceptada es la establecida por la norma ISO 11737-1:2006 para la esterilización de productos sanitarios implantados en humanos, con una dosis de radiación gamma de 25 kGy. Sin embargo, esta regulación se centra únicamente en la esterilización de elementos inertes no biológicos^14,15. Además, las dosis de radioterapia en el tratamiento radical del carcinoma son tres órdenes de magnitud inferiores a las utilizadas para esterilizar dispositivos médicos¹. Con esto en mente, podemos concluir que dicha dosis no solo mataría la microbiota, sino que también destruiría y alteraría radicalmente la estructura biológica del implante. También existe la posibilidad de que genere lípidos residuales tras la degradación, que potencialmente pueden ser citotóxicos y acelerar la degradación enzimática del andamio 13,14,15,16,17, incluso cuando se utilizan dosis tan bajas como ^1,9 kGy y con daños directamente proporcionales a la dosis de radiación recibida ¹⁷.

Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es tratar de identificar la dosis de radiación que permite obtener un implante estéril con mínimos efectos nocivos causados por la irradiación 2,18,19. La estrategia que seguimos consistió en la irradiación de tráqueas descelularizadas e irradiadas a diferentes dosis escalonadas dentro de un rango de kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), hasta lograr un cultivo negativo. Se realizaron pruebas adicionales para aquellas dosis que lograron cultivos negativos, con el fin de confirmar la esterilización. Después de determinar la dosis mínima para obtener la esterilización, se verificó el impacto estructural y biomecánico de la irradiación en la tráquea. Todas las métricas se compararon con las tráqueas de conejo nativas de control. La esterilización de la construcción se probó in vivo mediante la implantación de las tráqueas en conejos blancos de Nueva Zelanda.

Protocolo

Se adhirió a la directiva europea 20170/63/UE para el cuidado y uso de animales de laboratorio y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universitat de València (Ley 86/609/CEE y 214/1997 y Código 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 de la Generalitat Valenciana, España).

1. Descelularización traqueal

NOTA: El método de descelularización ha sido reportado en otra parte²⁰.

1. Eutanasia a conejos blancos adultos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) que pesan 3.5-4.1 kg con 133 mg/kg de pentobarbital sódico, usando una inyección de 200 mg/ml a través de la vena marginal del oído.
2. Mientras asegura condiciones asépticas, realice una cervicotomía longitudinal central, diseccione los músculos cervicales y aborde la tráquea. Diseccionar el órgano circunferencial y longitudinalmente. Finalmente, transecto debajo del primer anillo y justo encima de la carina.
3. Con un bisturí, secciona las tráqueas en trozos de 2 cm. Con unas tijeras, retire el tejido conectivo circundante y la capa interna de la mucosa⁶.
4. Sumerja las muestras en 12 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 2% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 5% de penicilina-estreptomicina y 5% de anfotericina B.
5. Someter las tráqueas a agitación constante con un agitador magnético a 400 rpm durante 5 semanas a temperatura ambiente. Reemplazar la solución de descelularización semanalmente después de un choque osmótico de 2 h, mediante inmersión de la tráquea en agua destilada.
6. Criogenizar las muestras utilizando una mezcla de 12 ml de suero bovino fetal al 80% (FBS) y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) en un recipiente de congelación a -80 °C.
7. Cuando se vayan a utilizar las tráqueas (después de 13-15 días), descongelarlas en un baño maría a 37 °C y lavarlas sumergiéndolas en PBS después de que se complete la descongelación.

2. Esterilización

1. Irradiación
   1. Colocar lotes de cuatro piezas traqueales de 2 cm cada una en un matraz de cultivo de 20 ml de metacrilato en T25 lleno de PBS hasta alcanzar un volumen total de 30 ml. Tenga cuidado de evitar que se formen burbujas, lo que podría causar la difusión de energía en la interfaz aire-líquido.
   2. Conducir la irradiación utilizando un acelerador lineal, con fotones de una energía nominal de 10 MV aplanando haces libres de filtro. Aplicar una tasa de dosis de 2.400 unidades monitoras por minuto en el isocentro, colocando las tráqueas a una distancia fuente-superficie de 100 cm a irradiar, con una profundidad de campo de 2,5 cm para un campo de radiación de 10 cm x 10 cm -de forma que cubra todo el recipiente- correspondiente a una dosis de 24 Gy/min.
   3. Aumente las dosis con cada lote de cuatro piezas; cuatro piezas se someterán a 0,5 kGy, cuatro a 1 kGy, cuatro a 2 kG, etc., hasta alcanzar la esterilización.
2. Cultura
   1. Introducir las piezas en 30 mL del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con FBS inactivado al 10% sin antibióticos ni antifúngicos.
   2. Cultivarlos en una incubadora de tejidos estándar a 37 °C y 5% de_CO2 durante 2 semanas e inspeccionarlos cada 24 h.
      NOTA: Los parámetros de contaminación son cambios en el pH del medio de cultivo y, en consecuencia, cambios en el color y la turbidez del medio. Las tráqueas se cosecharon de lagomorfos libres de gérmenes, que no estaban enfermos y, por lo tanto, se esperaba que carecieran de bacterias anaeróbicas en sus tráqueas.

3. Análisis histológico

NOTA: Tiñe las piezas con hematoxilina y eosina²¹, tricrómico de Masson y orceína²².

1. Tinción DAPI
   1. Determinar la viabilidad tisular utilizando DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol). Esta tinción azul-fluorescente se une fuertemente a las regiones ricas en adenina y timina en las secuencias de ADN y, por lo tanto, permite que el ADN se vea mediante microscopía de fluorescencia.
   2. Incruste las muestras de tejido en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT).
   3. Corte las muestras con un criostato.
   4. Lave la muestra a teñir tres veces en agua destilada para eliminar el OCT. Coloque en un medio de montaje que incluya una solución de 30 nM de DAPI.
   5. Visualice la fluorescencia utilizando microscopía de fluorescencia.
2. Análisis del contenido de ADN
   1. Corte segmentos de tráquea que midan aproximadamente 3 mm de largo con un bisturí.
   2. Incubar durante 2 h en proteinasa K (Tabla de materiales).
   3. Extraiga el ADN con un kit de extracción de ADN, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   4. Mediante espectrofotometría, determinar la concentración de ADN midiendo la absorbancia a 260/280 utilizando un espectrofotómetro.
   5. Mida el tamaño de las muestras de ADN extraídas mediante cromatografía capilar con un bioanalizador.

4. Estudio biomecánico

NOTA: La resistencia traqueal a las fuerzas longitudinales y transversales se mide mediante ensayos de tracción axial y compresión radial²³.

1. Medición traqueal
   1. Mida la longitud traqueal, el grosor de la pared y el diámetro externo con una pinza Vernier.
   2. Calcule los valores promedio a partir de tres mediciones aleatorias de cada una de las variables.
   3. En las pruebas de compresión radial, calcular el diámetro anteroposterior detectando el punto en el que la placa entra en contacto con la muestra.
   4. Realice todas las pruebas a temperatura ambiente.
2. Ensayos de tracción
   1. Realice pruebas de tracción en un control de desplazamiento de máquina de prueba universal (UTM) de escritorio de tracción, equipado con una carga de 100 N (resolución de fuerza de 0.1 N, 0.001 mm de posición y 0.1 s). La máquina de prueba está equipada con sensores de fuerza y posición, y está conectada a una computadora con software diseñado específicamente por el fabricante²³.
   2. Registra datos cada 0,4 s y expórtalos a una hoja de cálculo.
   3. Construir mordazas de tracción adaptadas al calibre medio de las tráqueas de conejo a partir de tubos huecos monocapa, de cloruro de polivinilo cristalino (PVC) no tóxicos y monocapa con un diámetro externo de 1 cm y un espesor de pared de 1,5 mm.
   4. Dividir los conductos en segmentos de 3 cm de largo.
   5. Taladrar 12 orificios preformados para la sutura termino-terminal, a 2 mm del borde de las mandíbulas y separados por una distancia de 2,5 mm, para evitar el sesgo debido a las suturas.
   6. Fijar los tubos de vidrio de PVC a la tráquea del conejo mediante anastomosis termino-terminal con una sutura continua a través de orificios preformados alternos (cada 5 mm), a 2 mm del borde de la tráquea y con una sutura de monofilamento de nylon 6-0.
   7. Estirar todas las piezas a una velocidad de desplazamiento de 5,0 mm/min.
   8. Registre las variables tensión máxima (σ máx., en N/mm²) y deformación (ε_máx., sin unidades), junto con la energía almacenada por unidad de volumen de tráquea (W/Vol, en _mJ/mm), y el módulo de Young (E, en MPa).
3. Pruebas de compresión radial
   1. Realice pruebas de compresión radial en un escritorio UTM de compresión, equipado con una célula de carga de 15 N (resolución de fuerza 0.001 N, posición 0.001 mm y tiempo 0.1 s) para obtener datos de fuerza (N), posición (mm) y tiempo (s). Grabe datos y expórtelos a una hoja de cálculo a intervalos de 0,5 s.
   2. Coloque las tráqueas con el área membranosa apoyada en la placa inferior. La placa se eleva gradualmente hacia la placa superior a una velocidad constante de 5 mm / min.
   3. Calcular cada unidad por unidad de longitud de la muestra (f en N/mm), rigidez (R en Mpa·mm), y la energía por unidad de superficie (W / S en mJ/mm²) necesaria para ocluir completamente la tráquea.

5. Técnica quirúrgica

NOTA: La técnica quirúrgica ha sido ampliamente reportada en otros lugares²⁰.

1. Coloque un stent de PVC intraluminal estéril, tamaño 14 Fr (que permita que se deslice libremente sin comprimir las paredes), con un margen de 3-4 mm en cada extremo.
2. Fije el stent con una sola puntada de monofilamento de nylon 6-0 a través del espacio intercartilaginoso del primer cartílago.
3. Proceder a anestesiar a los conejos.
   1. Premedicar a los sujetos (3,65-4,05 kg de conejos blancos machos de Nueva Zelanda) con analgésicos intramusculares (35 mg/kg de ketamina) con un sedante, relajante muscular y analgésico (2,5 mg/kg de xilazina).
   2. Afeite la zona de incisión fuera de la zona de operación y limpie el área quirúrgica para eliminar el vello.
   3. Administrar analgésicos más profilaxis antibiótica: 0,05 mg/kg de buprenorfina intramuscular y 10 mg/kg de enrofloxacino.
   4. Coloque un catéter venoso en la vena marginal del oído de cada conejo.
   5. Anestesia inductiva con un bolo intravenoso de 10 mg/kg de propofol.
   6. Controle los signos vitales del animal mediante un electrocardiograma de tres derivaciones, oximetría de pulso y medición de presión no invasiva. Cada 30 minutos, aplique suero fisiológico en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
   7. Verifique el plano anestésico utilizando el método de pellizco del dedo del pie.
   8. Mantener la anestesia con isoflurano inhalado al 1,5%-2% de la concentración alveolar mínima sin perder la ventilación espontánea y proporcionar soporte térmico al conejo con una almohadilla térmica.
4. Desinfecte la zona de la incisión varias veces con un movimiento circular con un exfoliante a base de yodo. En condiciones asépticas en todo momento y con material estéril, realizar una incisión torácica central longitudinal de 3 cm, y cosechar colgajos pediculados bilaterales compuestos por fascia pectoral y un componente muscular.
5. Envuelva las tráqueas con el colgajo en cuatro conejos, uno en cada hemitórax (por lo tanto, un total de ocho tráqueas).
6. Cuando se complete la cirugía, revertir la anestesia interrumpiendo la administración de isoflurano.
7. Período postquirúrgico
   1. Mantenga a los animales en la sala de operaciones hasta que se hayan recuperado completamente de la anestesia. Cuando se hayan recuperado por completo, devuélvalos a su entorno con otros conejos.
   2. Tratar a los conejos con antibióticos (0,5 mL/kg de enrofloxacino al 2,5%) y analgésicos (meloxicam 5 mg/mL; metacam 0,05 mL/kg) cada 24 h durante 5 días.
   3. Dejar los implantes in situ durante el tiempo deseado.
   4. Antes de la eutanasia, premedicar a los conejos con analgésicos intramusculares (35 mg / kg de ketamina) y un sedante, relajante muscular y analgésico (2,5 mg / kg de xilazina). Luego eutanasia a los conejos con 133 mg / kg de pentobarbital sódico usando una inyección de 200 mg / ml a través de la vena marginal del oído y cosechar las tráqueas.
   5. Realizar pruebas biomecánicas e histológicas en las tráqueas.

6. Análisis estadístico

1. Ajuste todos los modelos por el método bayesiano en el software R, Versión 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
2. Analizar las variables de estudio, excepto f y R, utilizando modelos de regresión lineal múltiple.
3. Para las variables f y R , aplicar modelos de regresión lineal mixta. En estos modelos, además de las variables de interés relacionadas con el tratamiento y condición de cada tráquea, se introduce el porcentaje de oclusión como efecto monótono y un término independiente por tráquea como factor aleatorio.

Resultados

Descelularización
La tinción DAPI muestra la ausencia de ADN, y no se detectaron valores de ADN superiores a 50 ng en ninguna de las tráqueas por electroforesis, siendo todos los fragmentos menores de 200 pb²⁰.

Cultivo microbiano
Dos de las ocho piezas sometidas a 0,5 kGy mostraron cambio de color en menos de 1 semana. Ninguna de las piezas irradiadas a 1 kGy y 2 kGy mostró ningún cambio de color (Figura ...

Discusión

Existen varias estrategias de esterilización. El_CO2supercrítico penetra completamente en los tejidos, acidificando el medio y deconstruyendo la bicapa de fosfolípidos celulares con eliminación simple mediante la despresurización del implante ^8,14,25. También se ha utilizado radiación ultravioleta y se ha publicado su efectividad en la tráquea de roedores, aunque hay pocos relatos en la literatura

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 nylon monofilament suture	Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA	SN-5698G
Amphotericin B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15290018
Bioanalyzer	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)	DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich; MO, USA	D2650
DMEM	Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA	11965084
DNA extraction kit	DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain	SH20898.03IR
Fluorescence microscope	Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)	DM2500??
Freezing Container	Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain	5100-0001
Isofluorane	Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain	8.43603E+12
Ketamin	Imalgene. Merial; Toulouse, Francia	BOE127823
Linear accelerator	"True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA	H191001
Magnetic stirrer	Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia	BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Fischer Scientific, Madrid, Spain	12678646
Penicillin-streptomycin 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15140122
Pentobarbital sodium	Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España	3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania	G 151030
Proteinase K	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA	S3020
PVC hollow tubes	Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy	hhdddyyZ
PVC stent	ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey	019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core	R Foundation for Statistical Computing	R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	8,17,034
Spectrophotometer	Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands	ND-ONEC-W
Spreadsheet	Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Labs, Burlingame; CA; USA	H-1000-10
Xylacine	Xilagesic. Calier; Barcelona, España	20102-003