Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Résumé

Nous présentons ici une méthode non génétique pour générer des sphéroïdes hépatiques autologues humains en utilisant des cellules mononucléaires isolées du sang périphérique à l’état d’équilibre.

Résumé

Les cellules hépatiques humaines peuvent former une structure tridimensionnelle (3D) capable de croître en culture pendant quelques semaines, préservant ainsi leur capacité fonctionnelle. En raison de leur nature à se regrouper dans les boîtes de culture avec des caractéristiques adhésives faibles ou nulles, ils forment des agrégats de plusieurs cellules hépatiques appelées sphéroïdes hépatiques humains. La formation de sphéroïdes hépatiques 3D repose sur la tendance naturelle des cellules hépatiques à s’agréger en l’absence d’un substrat adhésif. Ces structures 3D possèdent de meilleures réponses physiologiques que les cellules, qui sont plus proches d’un environnement in vivo . L’utilisation de cultures d’hépatocytes 3D présente de nombreux avantages par rapport aux cultures bidimensionnelles classiques (2D), notamment un microenvironnement biologiquement plus pertinent, une morphologie architecturale qui réassemble les organes naturels ainsi qu’une meilleure prédiction de l’état de la maladie et des réponses in vivo aux médicaments. Diverses sources peuvent être utilisées pour générer des sphéroïdes, comme le tissu hépatique primaire ou les lignées cellulaires immortalisées. Le tissu hépatique 3D peut également être modifié en utilisant des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou des cellules souches pluripotentes induites (CSPhi) pour obtenir des hépatocytes. Nous avons obtenu des sphéroïdes hépatiques humains en utilisant des cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSC) générées à partir de sang périphérique non manipulé par activation de la protéine liée à la GPI liée à la membrane humaine et différenciée aux hépatocytes humains. Les cellules hépatiques humaines dérivées des BD-PSC et les sphéroïdes hépatiques humains ont été analysés par microscopie optique et immunophénotypage à l’aide de marqueurs hépatocytes humains.

Introduction

Au cours des dernières années, les systèmes de culture sphéroïde tridimensionnels (3D) sont devenus un outil important pour étudier divers domaines de la recherche sur le cancer, de la découverte de médicaments et de la toxicologie. De telles cultures suscitent un grand intérêt car elles comblent le fossé entre les monocouches de culture cellulaire bidimensionnelles (2D) et les organes complexes¹.

En l’absence de surface adhésive, par rapport à la culture cellulaire 2D, la formation de sphéroïdes est basée sur l’affinité naturelle de ces cellules pour se regrouper sous forme 3D. Ces cellules s’organisent en groupes constitués d’un ou plusieurs types de cellules matures. Exemptes de corps étrangers, ces cellules interagissent les unes avec les autres comme dans leur microenvironnement d’origine. Les cellules en culture 3D sont beaucoup plus proches et ont une orientation appropriée les unes vers les autres, avec une production de matrice extracellulaire plus élevée que les cultures 2D, et constituent un environnement proche de la nature ².

Les modèles animaux sont utilisés depuis longtemps pour étudier la biologie humaine et les maladies³. À cet égard, il existe des différences intrinsèques entre les humains et les animaux, ce qui rend ces modèles pas tout à fait adaptés aux études extrapolatives. Les sphéroïdes et les organoïdes de culture 3D représentent un outil prometteur pour étudier l’architecture, l’interaction et la diaphonie tissulaires entre différents types de cellules qui se produisent in vivo et peuvent contribuer à réduire, voire à remplacer, les modèles animaux. Ils présentent un intérêt particulier pour l’étude de la pathogenèse des maladies du foie ainsi que des plateformes de criblage^{de médicaments 4}.

La culture sphéroïde 3D revêt une importance particulière pour la recherche sur le cancer, car elle peut éliminer la discontinuité entre les cellules et leur environnement en réduisant le besoin de trypsinisation ou de traitement par collagénase nécessaire à la préparation des monocouches de cellules tumorales pour les cultures 2D. Les sphéroïdes tumoraux permettent d’étudier comment les cellules normales par rapport aux cellules malignes reçoivent et répondent aux signaux de leur environnement⁵ et constituent une partie importante des études de biologie tumorale.

Par rapport à la monocouche, les cultures 3D composées de différents types de cellules ressemblent aux tissus tumoraux dans leurs propriétés structurelles et fonctionnelles et conviennent donc à l’étude des métastases et de l’invasion des cellules tumorales. C’est pourquoi de tels modèles sphéroïdes contribuent à accélérer la recherche sur le cancer⁶.

Les sphéroïdes aident également à développer la technologie pour créer des organoïdes humains parce que la biologie des tissus et des organes est très difficile à étudier, en particulier chez les humains. Les progrès de la culture de cellules souches permettent de développer des cultures 3D comme des organoïdes constitués de cellules souches et de progéniteurs tissulaires ainsi que différents types de cellules matures (tissulaires) à partir d’un organe présentant certaines caractéristiques fonctionnelles comme un organe réel qui peut être utilisé pour modéliser le développement des organes, les maladies, mais elles peuvent également être considérées comme utiles en médecine régénérative⁷.

Les hépatocytes humains primaires sont généralement utilisés pour étudier in vitro la biologie des hépatocytes humains, la fonction hépatique et la toxicité induite par les médicaments. Les cultures d’hépatocytes humains présentent deux inconvénients principaux, d’une part, la disponibilité limitée de tissus primaires comme les hépatocytes humains, et d’autre part, la tendance des hépatocytes à se dédifférencier rapidement en culture 2D, perdant ainsi leur fonction hépatocytes spécifique⁸. Les cultures hépatiques 3D sont supérieures à cet égard et ont récemment été fabriquées à partir de cellules souches embryonnaires humaines différenciées (CSEh) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPhi)⁹. Les sphéroïdes hépatiques 3D issus de la bio-ingénierie présentent un intérêt particulier pour étudier le développement, la toxicité, les maladies génétiques et infectieuses du foie, ainsi que la découverte de médicaments pour le traitement des maladies du foie¹⁰. Enfin, ils ont également le potentiel d’être utilisés cliniquement, sachant que les maladies hépatiques aiguës ont un taux de mortalité de près de 80%, le foie bio-artificiel et / ou les sphéroïdes hépatiques pourraient potentiellement sauver ces patients en fournissant une fonction hépatique partielle jusqu’à ce qu’un donneur approprié puisse être trouvé¹¹.

Nous avons établi un protocole pour la génération de sphéroïdes hépatiques humains à l’aide de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSC) pour préparer des sphéroïdes de tailles différentes contenant 4000 à 1 x 10⁶ cellules et les avons analysés au moyen de la microscopie optique et de l’immunofluorescence. Nous avons également testé la capacité de la fonction spécifique des hépatocytes, en évaluant l’expression des enzymes du cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) et 2E1 (CYP2E1) appartenant à la famille du cytochrome P450 qui jouent un rôle important dans le métabolisme cellulaire et médicamenteux par le processus de désintoxication¹².

Protocole

L’approbation éthique a été obtenue (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) pour effectuer ces expériences et le consentement éclairé a été signé par tous les donneurs avant l’extraction de sang conformément aux directives institutionnelles.

1. Préparation de cellules mononucléées (MNC) à partir de sang périphérique humain (PB)

1. Extraire 30 mL de sang de donneurs sains avec l’aide d’un personnel médical formé selon le protocole standard.
2. Isoler les PBMNCs à l’aide de milieux à gradient de densité selon le protocole publié par Becker-Kojić et ^al.13. Isoler, par pipetage, la couche interphasique entre le plasma et le milieu de gradient de densité et utiliser une solution saline tampon phosphate stérile (PBS) pour laver les cellules isolées.
3. Utilisez une chambre de comptage et comptez le nombre de cellules en utilisant des méthodes standard.

2. Dédifférenciation des multinationales lors de l’activation avec la glycoprotéine humaine ancrée dans le GPI

1. Placer 6 x 10⁶ cellules mononucléaires dans du PBS/albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans un tube en polystyrène (15 mL) et incuber avec l’anticorps spécifique pendant 30 min à 37 °C selon Becker-Kojić et ^coll.13.
2. Centrifuger les cellules à 300 x g à température ambiante et remplacer PBS/BSA par le milieu Dulbecco modifié d’Iscove complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
3. Faire pousser les cellules dans des tubes de polystyrène de 15 ml dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 8 à 10 jours, comme décrit dans Becker-Kojić et ^coll.13. Le jour 5 (J5), ajouter 1 à 2 mL du milieu d’Iscove complété par 10 % de FBS à chaque tube de 15 mL.

3. Tri des cellules dédifférenciées nouvellement générées

1. Centrifuger la suspension cellulaire cultivée à température ambiante pendant 10 min à 300 x g et aspirer avec une pipette stérile le surnageant résultant selon Becker-Kojić et ^al.13.
2. Resuspendre la pastille obtenue par centrifugation dans 90 μL de tampon PBS froid (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA et 2 mM EDTA) et ajouter 10 μL de billes magnétiques de taille nanométrique CD45 positives et incuber sur glace pendant 15 min.
3. Lavez la suspension cellulaire avec 2 mL de tampon PBS, centrifugez-la à 300 x g pendant 10 min à température ambiante et ajoutez 500 μL de tampon PBS aux cellules et remettez soigneusement en suspension.
4. Pipeter 500 μL de tampon PBS prérefroidi dans la colonne pour le laver et le placer dans le champ magnétique à l’aide d’un support magnétique.
5. Laver deux fois les cellules placées sur la colonne avec 500 μL de tampon PBS et recueillir les cellules CD45 négatives dans le milieu d’Iscove complétées par 10% de FBS.
6. Utilisez une chambre de comptage pour déterminer le nombre de cellules reprogrammées.

4. Préparation de lamelles de verre pour la génération d’hépatocytes humains

1. Séparer les lamelles de verre (14 mm) et les incuber dans un détergent non ionique pendant 10 min. Laver les lamelles de verre dans de l’eau désionisée jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles et les incuber dans 1M HCl pendant 30 minutes (adapté de Marchenko et ^al.14).
2. Lavez les lamelles de verre avec de l’eau désionisée au moins 3x et séchez-les pendant la nuit à température ambiante. Enveloppes en verre séché autoclave dans un récipient approprié.

5. Revêtement de plaques de culture cellulaire avec de la biolaminine pour la différenciation hépatique 2D des CSP-BD

1. Placez les lamelles de verre autoclavées avec une pince à épiler stérile dans 4 plaques de puits et allumez les lampes UV pendant 30 minutes pour assurer des conditions stériles.
2. Décongeler les aliquotes de biolaminine et ajouter 120 μL de biolaminine à 5 μg/mL à chaque glissement de couvercle en verre. Laisser les lamelles de verre couchées pendant la nuit à 4 °C.
3. Enlever l’excès de biolaminine et ajouter 200 μL de milieu de différenciation des hépatocytes comme décrit ci-dessous.

6. Préparation des milieux de différenciation des hépatocytes

1. Fabriquer 500 mL de milieu de remplacement du sérum knockout à l’hépatoblast (KSR)/diméthylsulfoxyde (DMSO) composé de 76,4 % de DMEM KNOCKOUT (KO-DMEM), 20 % de KSR, 0,5 % de L-glutamine, 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA), 0,1 % de β-mercaptoéthanol, 1 % de DMSO et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen/Strep).
2. Préparer 500 mL de milieu de maturation hépatocytes contenant 1 % de L-glutamine, 10 μM d’hydrocortisone 21-hémisuccinate de sel de sodium (CHC) et 1 % de Pen/Strep.
3. Aliquote du stock et ajouter le facteur de croissance des hépatocytes frais (HGF) et l’oncostatine M (OSM) à des concentrations finales de 10 ng/mL et/ou 20 ng/mL pour chaque changement de milieu.
   NOTE: L’oncostatine M est une cytokine appartenant au groupe des cytokines interleukine 6, importante pour l’hématopoïèse ainsi que pour le développement du foie.

7. Culture de cellules hépatiques différenciées des CSP-BD

1. Mettez 3 x 10⁵ cellules BD-PSCS dans chaque puits d’une plaque de 4 puits recouverte de biolaminine.
2. Placer les plaques à 4 puits dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂. Culture des cellules pendant 5 jours dans un milieu hépatoblast KSR/DMSO qui soutient la différenciation endodermique et changer le milieu tous les deux jours.
3. Passer au milieu de maturation des hépatocytes au jour 5 et cultiver les cellules pendant 7 à 10 jours supplémentaires dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂. Changez le milieu toutes les 48 h.

8.3D Différenciation hépatique sphéroïde

1. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage.
2. Centrifuger la suspension cellulaire dédifférenciée BD à 300 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dédifférenciées en BD dans un milieu KSR/DMSO à 2 x 10⁶ cellules/mL.
3. Passez les cellules dans une crépine cellulaire de 40 μm pour assurer une suspension unicellulaire et éliminer tout débris supplémentaire.
4. Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage et préparer un volume suffisant pour chaque densité d’ensemencement cellulaire afin de distribuer le volume requis par puits. Préparer un gradient avec un ensemencement supérieur de 1 x 10⁶ cellules jusqu’à une faible densité d’ensemencement de 4000 cellules.
5. Distribuer 100 μL de milieu KSR/DMSO dans 96 plaques de fixation bien basses et ajouter 100 μL de dilution d’ensemencement cellulaire.
6. Placer la plaque de fixation basse dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ et les cultiver pendant 5 jours.
7. Changez 50% du milieu à partir des jours 3-4 après l’ensemencement lorsque les sphéroïdes sont suffisamment compacts.
8. Le jour 5, changez le milieu en milieu de maturation hépatocytes et cultivez les cellules pendant 7 à 10 jours supplémentaires pour une maturation ultérieure. Changez le support tous les deux jours.

9. Analyse d’immunofluorescence de cultures de cellules hépatiques 2D nouvellement générées

1. Cultivez les cellules selon la méthode de différenciation décrite ci-dessus pendant 4, 8, 15 et 24 jours et retirez le milieu.
2. Incuber les cellules avec un fixateur préchauffé composé de 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 10 min. Jeter le fixateur et laver les cellules 2x avec du PBS pendant 5 min chacune. Ajouter immédiatement la solution de triton X-100 à 0,1% et perméabiliser les cellules pendant 5 min. Lavez 2x avec PBS.
3. Ajouter une solution de blocage à base de PBS et de BSA à 5% et placer sur la plaque à bascule pendant 1 h à température ambiante.
4. Diluer les anticorps primaires dans le tampon de dilution 1% BSA/PBS comme suit : albumine (ALB) 1:50, alpha-1 fœtoprotéine (AFP) 1:250, cytokératine 18 (CK18) 1:50, facteur nucléaire hépatocytes 4 alpha (HNF4α) 1:1000 et transthyrétine (TTR) 1:50. Utiliser 50 μL de dilution d’anticorps par puits.
5. Incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, jetez la solution d’anticorps, lavez les cellules pendant 5 minutes et répétez l’étape de lavage 3x.
6. Préparer les anticorps secondaires suivants dans un tampon de dilution : IgG anti-poulet de lapin (rouge Texas) 1:1000, IgG anti-souris de chèvre (488) 1:1000 et anti-lapin de chèvre (488) 1:500. Utiliser 50 μL de dilution d’anticorps par puits et incuber les cellules pendant 30 min à température ambiante.
7. Lavez les cellules 3x avec du PBS pendant 5 min chacune et montez les lamelles de couverture avec un support de montage contenant DAPI pour une analyse microscopique.

10. Coloration vivante des sphéroïdes hépatiques nouvellement formés

1. Jetez soigneusement les milieux de culture sans toucher les sphéroïdes, ajoutez du PBS fraîchement préparé avec une solution de triton X-100 à 0,1% et incuber pendant 5 minutes pour perméabiliser les cellules.
2. Laver les sphéroïdes avec le milieu en pipetant lentement pendant 5 min, répéter 2x.
3. Incuber les sphéroïdes avec les anticorps primaires ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) et CYP3A4 (1:200) préparés dans du PBS avec 1% de BSA pendant 1 h dans un incubateur de CO₂ à 5% à 37 °C. Utiliser 50 μL de dilution d’anticorps par puits.
4. Retirez délicatement l’excès de solution d’anticorps et lavez les sphéroïdes avec un milieu 3x.
5. Préparer les anticorps secondaires correspondants IgG anti-souris de chèvre (Cy3), d’IgG anti-souris de chèvre (488) et d’IgG anti-poulet de lapin (Texas rouge) à une dilution de 1:1000 et 1:500 pour les anti-lapins de chèvre (488) dans du PBS dans 1% BSA. Utiliser 50 μL de dilution d’anticorps par puits et incuber pendant 20 min dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂.
6. Laver soigneusement 3x avec du milieu et laisser la plaque pendant 30 min dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ avant d’effectuer la microscopie à fluorescence.

11. Examen des sphéroïdes au microscope à fluorescence

1. Allumez la source lumineuse de fluorescence 10 min avant utilisation, allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel d’imagerie.
2. Utilisez un objectif avec un grossissement 4x, cliquez sur le bouton 4x dans la barre d’outils pour sélectionner la barre d’échelle correcte, puis placez la plaque de 96 puits sur la plaque centrale de la scène.
3. Allumez la source lumineuse LED, utilisez le filtre de fond clair et positionnez la plaque sur le puits d’intérêt à l’aide du bouton de réglage de la scène de l’axe x-y.
4. Passez au trajet lumineux de la caméra, cliquez sur le bouton Live dans le logiciel d’imagerie pour visualiser l’image à l’écran et assurez-vous que le sphéroïde est centré à l’aide des boutons de l’axe x-y et faites la mise au point à l’aide du bouton de mise au point grossière/fine.
   REMARQUE: La forme des sphéroïdes reste constante après l’application de coloration vivante.
5. Choisissez la méthode d’observation en fond clair dans la barre d’outils, définissez les paramètres d’exposition sur automatique, puis cliquez sur le bouton Snapshot dans le panneau de commande de l’appareil photo pour prendre une photo. Enregistrez ensuite l’image en tant que fichier .vsi en utilisant le nom approprié dans le dossier qui vous intéresse.
6. Placez la plaque de protection contre la lumière ambiante pour éteindre la lumière LED, passez au filtre pour l’excitation B, choisissez la méthode d’observation 488 dans la barre d’outils, ouvrez l’obturateur, prenez une photo en cliquant sur le bouton Instantané, fermez l’obturateur, puis enregistrez le fichier comme décrit ci-dessus.
7. Répétez cette opération avec un filtre pour l’excitation G en utilisant la méthode d’observation appropriée (Texas red ou CY3). Répétez ensuite toute la procédure pour chaque puits d’intérêt.
8. Remettre la plaque dans l’incubateur à 5% de CO₂ à 37 °C et la cultiver comme décrit ci-dessus.

Résultats

Nous avons réussi à différencier les CSD-BD humaines en cellules progénitrices endodermiques/hépatiques et en hépatocytes en appliquant un protocole en deux étapes. Les changements morphologiques au cours du processus de différenciation hépatique sont illustrés à la figure 1. Les CSP-BD se différencient en hépatocytes passant par trois étapes différentes. La première étape représente la différenciation en cellules endodermiques L4, la deuxième, la différenciation en cell...

Discussion

Le foie est un organe majeur du corps humain avec de nombreuses fonctions biologiques essentielles, telles que la désintoxication des métabolites. En raison d’insuffisances hépatiques graves comme la cirrhose et / ou l’hépatite virale, il y a près de 2 millions de décès par an dans le monde. Les transplantations hépatiques se classent au deuxième rang mondial des transplantations d’organes pleins, mais seulement environ 10% des besoins actuels sont satisfaits²².

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%