미세유체 혼합으로 제조된 mRNA-지질 나노입자의 In vitro 및 In vivo 효율 테스트

요약

여기에서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)를 제형화하기 위한 프로토콜이 제시된다. 이 LNP는 HepG2 세포의 in vitro 및 C57BL/6 마우스의 in vivo 에서 효능을 테스트했습니다.

초록

지질 나노입자(LNP)는 최근 모더나와 화이자/바이오엔테크의 코로나19 mRNA 백신 개발에 성공하면서 주목을 받고 있다. 이 백신은 mRNA-LNP 치료제의 효능을 입증하고 향후 임상 적용의 문을 열었습니다. mRNA-LNP 시스템에서 LNP는 뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA 화물을 보호하고 세포 내 전달을 매개하는 전달 플랫폼 역할을 합니다. LNP는 일반적으로 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합체(지질-PEG)의 네 가지 구성 요소로 구성됩니다. 여기서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP는 LNP 지질 성분을 함유하는 유기상과 mRNA를 함유하는 수성상의 미세유체 혼합에 의해 제형화된다. 그런 다음 이러한 mRNA-LNP를 체외에서 테스트하여 생물 발광 플레이트 기반 분석을 사용하여 HepG2 세포에서 transfection 효율을 평가합니다. 또한 mRNA-LNP는 측면 꼬리 정맥을 통한 정맥 주입 후 C57BL/6 마우스에서 in vivo로 평가됩니다. 전신 생물 발광 이미징은 in vivo 이미징 시스템을 사용하여 수행됩니다. 대표적인 결과는 mRNA-LNP 특성, HepG2 세포에서의 transfection 효율 및 C57BL/6 마우스의 총 발광 플럭스에 대한 것입니다.

서문

지질 나노입자(LNP)는 최근 몇 년 동안 비바이러스 유전자 치료 분야에서 큰 가능성을 보여주었습니다. 2018년 미국 식품의약국(FDA)은 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증 1,2,3,4 치료를 위해 최초의 RNA 간섭(RNAi) 치료제인 Onpattro by Alnylam을 승인했습니다. 이는 지질 나노입자 및 RNA 기반 치료법의 중요한 진전이었습니다. 최근에는 Moderna와 Pfizer/BioNTech가 SARS-CoV-2 ^4,5에 대한 mRNA-LNP 백신에 대한 FDA 승인을 받았습니다. 이러한 각각의 LNP 기반 핵산 치료제에서 LNP는 뉴클레아제에 의한 분해로부터 화물을 보호하고 강력한 세포 내 전달을 촉진하는 역할을 합니다 ^6,7. LNP는 RNAi 치료제 및 백신 응용 분야에서 성공을 거두었으며, mRNA-LNP는 단백질 대체 요법8과 유전자 편집을 위한 CRISPR-Cas9 시스템의 전달을 위한 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA의 동시 전달을 위해 연구되었습니다⁹. 그러나, 모든 응용에 적합한 하나의 특정 제형은 존재하지 않으며, LNP 제형 파라미터의 미묘한 변화는 생체내 효능 및 생체내 분포에 크게 영향을 미칠 수 있다 8,10,11. 따라서 각 LNP 기반 치료제에 대한 최적의 제형을 결정하기 위해 개별 mRNA-LNP를 개발하고 평가해야 합니다.

LNP는 일반적으로 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 폴리에틸렌-글리콜(PEG) 접합체(지질-PEG)의 4가지 지질 성분으로 제조됩니다11,12,13. LNP에 의해 촉진되는 강력한 세포내 전달은 부분적으로 이온화 가능한 지질 성분¹²에 의존한다. 이 성분은 생리학적 pH에서는 중성이지만 엔도솜¹¹의 산성 환경에서는 양전하를 띠게 된다. 이러한 이온 전하의 변화는 엔도솜 탈출(endosomal escape)의 주요 원인으로 생각된다^12,14,15. 이온화 가능한 지질 외에도 인지질(도우미 지질) 성분은 화물의 캡슐화를 개선하고 엔도솜 탈출을 돕고, 콜레스테롤은 안정성을 제공하고 막 융합을 향상시키며, 지질-PEG는 순환 중 LNP 응집 및 옵손화를 최소화합니다^10,11,14,16. LNP를 제형화하기 위해, 이들 지질 성분은 유기상, 전형적으로 에탄올로 결합되고, 핵산 화물을 함유하는 수성 상과 혼합된다. LNP 제형 공정은 다수의 물리화학적 특성(^10,17)을 갖는 많은 LNP 제형을 제형화하기 위해 상이한 성분을 상이한 몰비로 용이하게 치환하고 결합할 수 있도록 한다는 점에서 매우 다재다능하다. 그러나 이처럼 다양한 LNP를 탐색할 때는 표준화된 절차를 사용하여 각 제형을 평가하여 특성화 및 성능의 차이를 정확하게 측정하는 것이 중요합니다.

여기에서는 mRNA-LNP의 제형화와 세포 및 동물에서의 성능 평가를 위한 전체 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

참고: RNase 및 DNA에 대한 표면 오염 제거제로 표면과 장비를 닦아 mRNA-LNP를 제형화할 때 항상 RNase가 없는 상태를 유지하십시오. RNase가 없는 팁과 시약만 사용하십시오.

모든 동물 시술은 펜실베니아 대학의 실험 동물 관리 및 사용 지침과 펜실베니아 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 사전 제형 준비

1. 깨끗한 4L 비커에 200-300mL의 신선한 10x 인산염 완충 식염수(PBS)를 채웁니다.
   1. 비커의 10x PBS를 초순수로 10배 희석하여 1x PBS의 비커를 얻습니다. 1x PBS의 최종 부피가 2-3L 사이인지 확인하십시오.
   2. LNP 제형에 적합한 용량의 투석 카세트(20kDa 분자량 컷오프[MWCO])를 채워진 비커에 넣어 수화합니다.
      알림: 투석 카세트는 사용하기 전에 수분을 공급하는 데 최소 2분이 필요합니다.
   3. 비커에 교반 막대를 놓고 알루미늄 호일로 비커를 덮습니다.
   4. 덮개가 있는 비커를 자석 교반 접시에 놓습니다. 교반 플레이트를 켜고 300-400rpm으로 회전하도록 설정합니다.
2. 100mM 구연산 완충액 스톡(pH 3)을 초순수로 10배 희석하여 mRNA 희석에 사용되는 10mM 구연산 완충액을 만듭니다.
3. 각 지질을 12% 에탄올에 용해시켜 C200-100 이온화 가능한 지질, 보조 지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 PEG(지질-PEG) 원액을 만듭니다. 지질 성분의 농도는 표 1에 상세히 기재되어 있다.
   1. 원액을 37°C에서 가열하고 혼합하여 완전히 용해되도록 합니다.

2. 지질 및 핵산 혼합물의 준비

1. 원하는 몰 비율 및 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량 비율을 기준으로 이온화 가능한 지질, 도우미 지질, 콜레스테롤 및 지질-PEG의 필요한 부피를 계산합니다(표 1). 제형 중 주사기의 데드 부피를 설명하기 위해 유기상의 10% 추가 부피를 준비합니다.
   1. 서로 다른 지질 성분의 계산된 부피를 원뿔형 튜브에 결합합니다.
   2. 지질을 100% 에탄올로 희석하여 LNP 최종 부피의 25%를 나타내는 최종 부피 V로 만듭니다.
2. 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량 비율과 필요한 mRNA-LNP의 총 부피를 기반으로 제형에 필요한 mRNA의 양을 계산합니다(표 1).
   1. 반딧불이 루시페라아제 인코딩 mRNA를 얼음 위에서 해동합니다.
   2. mRNA를 10mM 구연산 완충액에서 유기상 부피의 3배인 최종 부피인3V로 희석합니다.
      참고: 모든 지질 부피 V에는3V로 희석된 mRNA에 대해 충분한 이온화 가능한 지질이 포함되어야 합니다. 이는 원하는 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량비에 해당합니다.

3. mRNA-LNP의 미세유체 제형

1. RNase 및 DNA에 대한 표면 오염 제거제를 섬세한 작업 와이프에 뿌리고 미세유체 기기 내부를 철저히 닦습니다.
   1. 새 미세유체 카트리지를 열고 입구 채널이 아래를 향하도록 삽입합니다.
   2. 코니컬 튜브 암이 2개의 15mL 코니컬 튜브를 고정하고 가장 오른쪽 위치에 있는지 확인합니다.
   3. 캡을 닫은 상태에서 홀더에 두 개의 멸균 15mL 코니컬 튜브를 구성합니다.
2. 10mM 구연산 완충액에 희석된 mRNA가 포함된 mRNA 용액으로 5mL 주사기를 채웁니다.
   1. 순수 100% 에탄올에 희석된 지질이 포함된 지질 용액으로 3mL 주사기를 채웁니다.
   2. 미세유체 장치의 카트리지 홀더를 위로 올립니다.
   3. 바늘 없이 mRNA가 들어 있는 5mL 주사기를 카트리지의 왼쪽 주입구에 삽입합니다.
   4. 바늘 없이 지질이 들어 있는 3mL 주사기를 카트리지의 오른쪽 주입구에 삽입합니다.
   5. 카트리지 홀더를 다시 아래로 뒤집고 미세유체 기기의 뚜껑을 닫습니다.
3. 기기 뒷면에 있는 스위치를 사용하여 미세유체 기기를 켭니다.
   1. Quick Run(빠른 실행)을 선택합니다.
   2. 삽입된 5mL 및 3mL 주사기에 맞는 올바른 주사기 유형을 선택합니다.
   3. 표 2에 설명된 대로 3:1 수성 대 유기 유속 비율로 mRNA-LNP 제형에 대한 파라미터를 입력합니다.
   4. 다음 버튼을 누르면 다음 화면으로 이동합니다.
   5. 올바른 매개변수가 입력되었는지 확인합니다.
   6. 시작 버튼을 눌러 mRNA-LNP를 제형화합니다.

4. mRNA-LNP의 제형 후 처리 및 특성 분석

1. 오른쪽 원뿔형 튜브에 수집된 mRNA-LNP를 이전에 수화된 투석 카세트에 로드합니다.
   알림: mRNA-LNP를 로드할 때 카세트의 멤브레인에 구멍을 뚫거나 손상시키지 마십시오. 멤브레인이 손상되면 로딩 시 mRNA-LNP가 손실됩니다.
   1. mRNA-LNP가 들어 있는 투석 카세트를 1x PBS가 들어 있는 비커에 다시 넣고 최소 2시간 동안 투석합니다.
   2. 투석 후 mRNA-LNP가 포함된 투석 카세트를 멸균 생물안전 캐비닛으로 가져오고 바늘이 있는 주사기를 사용하여 mRNA-LNP를 제거합니다.
   3. 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 mRNA-LNP를 멸균 여과하고 멸균 원뿔형 튜브에 수집합니다.
   4. 특성 분석을 위해 65μL의 mRNA-LNP 용액을 1.5mL 마이크로튜브에 넣습니다.
2. 동적 광 산란을 사용하여 유체역학적 크기 및 다분산 지수를 측정하기 위해 큐벳에서 1x PBS의 990μL에 mRNA-LNP 10μL를 1:100으로 희석합니다.
3. 형광 분석(예: RiboGreen)을 사용하여 mRNA-LNP의 농도 및 캡슐화 효율을 평가합니다.
   1. 20x TE 완충액을 분자생물학 물로 희석하여 1x TE 완충액의 원액을 준비합니다.
   2. Triton X-100을 1x TE 완충액으로 희석하여 1% Triton X-100 완충액의 원액을 준비합니다.
   3. 시약 스톡을 1x TE 완충액으로 1:200으로 희석하여 형광 시약을 준비합니다.
   4. mRNA-LNP를 1x TE 완충액에 1:100으로 희석하고 1% Triton X-100 완충액을 100μL의 흑벽 흑색 바닥 96웰 플레이트에 희석합니다.
   5. 제조업체의 지침에 따라 RNA 표준물질을 희석하여 저범위 표준 곡선을 준비하고 96웰 플레이트에 표준 곡선을 도금합니다.
   6. 희석된 mRNA-LNP 또는 희석된 표준물질이 들어 있는 각 웰에 100μL의 희석된 형광 시약을 추가합니다.
   7. 96웰 플레이트를 플레이트 리더 안에 넣고 1분 동안 흔든 다음 4분 동안 기다립니다.
   8. 제조업체의 프로토콜에 따라 480nm/520nm의 여기/방출에서 각 웰의 형광 강도를 측정합니다.
4. 표준 곡선을 사용하여 형광 값을 농도로 변환합니다.
   1. 방정식 4.4에 따라 1% Triton X-100(총 mRNA)에서 LNP를 희석하여 얻은 값에서 TE 완충액(캡슐화되지 않은 mRNA)에서 LNP를 희석하여 얻은 값을 빼고 1% Triton X-100에서 LNP를 희석하여 얻은 값으로 나누어 캡슐화 효율을 계산합니다.
   2. 1% Triton X-100(총 mRNA)에서 LNP를 희석하여 얻은 값에서 TE 완충액(캡슐화되지 않은 mRNA)의 LNP를 희석하여 얻은 값을 빼서 세포 및 동물 연구에 사용되는 mRNA-LNP 농도를 계산합니다.
5. 6-(p-toluidino)-2-naphthalenesulfonyl chloride(TNS) 분석을 수행하여 mRNA-LNP의pKa를 측정합니다.
   1. 초순수에 0.16mM TNS 용액을 만들어 TNS 시약을 준비합니다.
      알림: 시약을 사용할 때는 품질 저하를 방지하기 위해 얼음 위에 보관하고 빛을 피하십시오.
   2. 150mM 염화나트륨, 20mM 인산나트륨, 25mM 구연산암모늄 및 20mM 아세트산암모늄의 완충 용액을 0.5씩 증가하여 2에서 12 사이의 다양한 pH 값으로 조정합니다.
   3. 2.5μL의 LNP를 흑색 벽 흑색 바닥 96웰 플레이트의 각 pH 조정 완충 용액에 추가합니다.
   4. 최종 TNS 농도가 6μM가 되도록 각 웰에 TNS 시약을 추가합니다.
   5. 어두운 곳에서 96웰 플레이트를 5분 동안 배양합니다.
   6. fluorescence plate reader를 사용하여 322 nm/431 nm의 excitation/emission에서 형광을 측정합니다.
   7. 데이터를 시그모이드 곡선에 피팅하고, 피팅된 방정식을 사용하여 최대 강도의 50%가 관찰된 pH를 찾아 pK_a 를 계산합니다.
6. mRNA-LNP 유체역학적 크기, PDI, 캡슐화 효율 및pKA_에 대한 대표적인 결과는 표 3에 나타내었다.

5. HepG2 세포의 시험관 내 형질주입

참고: HeLa 세포 또는 HEK-293T 세포와 같은 다양한 다른 세포주를 in vitro에서 LNP의 transfection 효율을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 모든 세포는 LNP transfection 연구 전에 마이코플라스마에 대해 음성 판정을 받아야 합니다.

1. 100μL의 완전한 세포 배양 배지에 있는 백색 벽 투명 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 5,000개의 HepG2 세포를 플레이트링합니다(10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM).
   1. 세포를 37°C 및 5%_CO2의 제어된_CO2 인큐베이터에서 밤새 부착되도록 둡니다.
2. mRNA-LNP를 완전한 세포 배양 배지에 희석하여 총 투여량이 100μL로 전달되도록 합니다.
   1. 웰에서 전체 배지를 제거합니다.
   2. 완전한 세포 배양 배지에 원하는 용량으로 희석된 mRNA-LNP 또는 완전한 배지(대조군)로 세포를 처리합니다.
   3. 처리된 세포가 들어 있는 96웰 플레이트를 제어된 CO₂ 인큐베이터에 24시간 동안 다시 넣습니다.
3. 루시페라아제 분석을 수행하여 transfection 효율을 평가합니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 루시페라아제 시약과 1x 세포 용해 완충액을 준비합니다.
   2. 인큐베이터에서 세포가 들어 있는 96웰 플레이트를 꺼내 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다.
   3. 96웰 플레이트의 모든 웰에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
   4. 각 웰에 20μL의 1x 용해 완충액을 첨가한 다음 이전에 준비한 루시페라아제 분석 시약 100μL를 추가합니다.
   5. 플레이트를 빛으로부터 보호하고 플레이트를 플레이트 리더에 넣어 각 웰의 생물 발광 신호를 측정합니다.
      참고: 이전에 제형화된 C12-200 mRNA-LNP를 사용한 HepG2 세포의 처리를 보여주는 대표적인 결과가 그림 1에 나와 있습니다.

6. 꼬리 정맥 주입 후 마우스에서 mRNA-LNP의 생체 내 평가

1. mRNA-LNP 용액을 멸균 1x PBS로 희석하여 총 mRNA의 2μg이 100μL 꼬리 정맥 주입 부피에 존재하도록 하며, 이는 20g 마우스의 경우 약 0.1mg/kg의 체중 선량에 해당합니다.
2. 승인된 방법을 사용하여 각 마우스를 구속하고 70% 알코올을 적신 패드로 꼬리를 닦습니다.
   1. 29G 인슐린 주사기에 100μL의 mRNA-LNP(2μg) 또는 100μL의 1x PBS를 채웁니다. 주사기에서 기포를 제거합니다.
   2. 비스듬한 부분이 위로 향하도록 바늘을 쥐의 측면 꼬리 정맥에 삽입하고 100μL의 mRNA-LNP 또는 1x PBS를 천천히 주입합니다.
   3. 바늘을 제거하고 지혈이 이루어질 때까지 압력을 가합니다.
3. 주입 후 6시간 동안 멸균된 1x PBS에 15mg/mL d-루시페린 칼륨염의 원액을 준비합니다.
   1. 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다.
   2. 초기화를 눌러 데이터 수집을 위해 계측기를 준비합니다.
   3. 발광 옆의 박스를 체크하고 노출 시간을 자동으로 설정합니다. 이미징되는 마우스 수에 대해 올바른 시야가 선택되었는지 확인하십시오.
   4. 이전에 처리한 마우스에 복강내로 200μL의 d-루시페린(체중 kg당 루시페린 150mg)을 투여합니다.
   5. 마우스를 2.5% 이소플루란과 2.0L/min의 산소 유량으로 설정된 마취실에 넣습니다.
   6. mRNA-LNP 처리된 마우스를 이미징하기 전에 루시페라아제 신호가 안정화될 때까지 10분 동안 기다립니다.
   7. 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하고 이미징 챔버 내부의 노즈 콘을 통해 이소플루란을 투여하도록 마취 라인을 리디렉션합니다.
   8. 쥐를 코뿔로 옮기고 복부가 노출된 상태로 등을 대고 있는지 확인합니다.
   9. 챔버 도어를 닫고 소프트웨어에서 Acquire 버튼을 클릭하여 생물 발광 이미지를 얻습니다.
      참고: mRNA-LNP 또는 1X PBS 처리 후 마우스 전신 이미징에 대한 대표적인 결과는 그림 2에 나와 있습니다.

결과

mRNA-LNP는 평균 유체역학적 직경이 76.16nm이고 다분산성 지수가 0.098인 미세유체 기기를 사용하여 제형화되었습니다. mRNA-LNP의pKa는 TNS 분석(¹⁸)을 수행하여 5.75로 확인되었다. 이러한 mRNA-LNP에 대한 캡슐화 효율은 수정된 형광 분석 및 방정식 4.4를 사용하여 92.3%로 계산되었습니다. 세포 처리 및 동물 투여에 사용된 전체 RNA 농도는 40.24ng/μL였습니다. 이 값?...

토론

이 워크플로우를 통해 다양한 mRNA-LNP를 제형화하고 in vitro 및 in vivo 효율을 테스트할 수 있습니다. 이온화 가능한 지질과 부형제는 서로 다른 몰비 및 서로 다른 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량비로 스왑 및 결합하여 서로 다른 물리화학적 특성을 가진 mRNA-LNP를 생성할 수 있습니다²². 여기서는 10:1 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량비에서 35/16/46.5/2.5(이온화 가능한 지?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Hydrochloric Acid	Sigma	7647-01-0
0.22 μm Syringe Filters	Genesee	25-243
1 mL BD Slip Tip Syringe	BD	309659
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000)	Avanti Polar Lipids	880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725P
1.5 mL Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
200 proof Ethanol	Decon Labs	2716
23G Needles	Fisher Scientific	14-826-6C
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips	Fisher Scientific	14-823-435
3 mL Dialysis Cassettes	Thermo Scientific	A52976
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Scientific	165306
Ammonium Acetate, 1 Kilogram	Research Products International	631-61-8
Ammonium Citrate dibasic	SIgma	3012-65-5
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL	BD	309646
C12-200 Ionizable Lipid	Cayman Chemical	36699
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664
Cholesterol	Sigma	57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7202
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14955129
D-Luciferin, Potassium Salt	Thermo Scientific	L2916
DMEM, high glucose	Thermofisher Scientific	11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mL	Fisher Scientific	1484132
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]	ATCC	HB-8065
HyPure Molecular Biology Grade Water	Cytiva	SH30538.03
Infinite 200 PRO Plate Reader	Tecan	N/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Perkin Elmer	N/A
Large Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-11D
Luciferase Assay Kit	Promega	E4550
NanoAssemblr Ignite Cartridges - Classic - 100 Pack	Precision Nanosystems	NIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument	Precision Nanosystems	NIN0001
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0	Teknova	Q2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit	Thermo Scientific	R11490
Reporter Lysis 5x Buffer	Promega	E3971
RNase Away Surface Decontaminant	Thermofisher Scientific	7000TS1
Sodium Chloride	Sigma	7647-14-5
Sodium Hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sodium Phosphate	Sigma	7601-54-9
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt)	Sigma	T9792
Triton X-100	Sigma	9036-19-5
Zetasizer	Malvern Panalytical	NanoZS