Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi

Riepilogo

Qui, l'iniezione intra-peritoneale delle cellule leucemiche viene utilizzata per stabilire e propagare la leucemia mieloide acuta (LMA) nei topi. Questo nuovo metodo è efficace nel trapianto seriale di cellule LMA e può servire come alternativa per coloro che possono sperimentare difficoltà e incongruenze con l'iniezione endovenosa nei topi.

Abstract

C'è un bisogno insoddisfatto di nuove terapie per trattare la leucemia mieloide acuta (LMA) e la ricaduta associata che coinvolge le cellule staminali persistenti della leucemia (LSC). Un modello sperimentale di roditore AML per testare terapie basate sul trapianto di successo di queste cellule tramite iniezioni retro-orbitali nei topi riceventi è irto di sfide. Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo semplice, affidabile e coerente per generare un robusto modello murino di LMA utilizzando una via intra-peritoneale. Nel presente protocollo, le cellule del midollo osseo sono state trasdotte con un retrovirus che esprime oncoproteina di fusione umana MLL-AF9. È stata testata l'efficienza delle popolazioni di lignaggio negativo (Lin-) e Lin-Sca-1^+c-Kit+ (LSK) come LSC donatrici nello sviluppo della LMA primaria ed è stata adottata l'iniezione intraperitoneale come nuovo metodo per generare LMA. Il confronto tra iniezioni intra-peritoneali e retro-orbitali è stato fatto in trapianti seriali per confrontare e contrastare i due metodi. Entrambe le ^{cellule Lin} e LSK trasdotte con il virus umano MLL-AF9 si sono innestate bene nel midollo osseo e nella milza dei riceventi, portando a una LMA conclamata. L'iniezione intra-peritoneale di cellule donatrici ha stabilito la LMA nei riceventi dopo il trapianto seriale e l'infiltrazione delle cellule AML è stata rilevata nel sangue, nel midollo osseo, nella milza e nel fegato dei riceventi mediante citometria a flusso, qPCR e analisi istologiche. Pertanto, l'iniezione intraperitoneale è un metodo efficiente di induzione della LMA utilizzando il trapianto seriale di cellule leucemiche del donatore.

Introduzione

La leucemia mieloide acuta (LMA) è un tipo di tumore ematologico di diversa eziologia con prognosi infausta¹. La generazione di modelli animali AML pone le basi per la comprensione delle sue complesse variazioni e patobiologia nel tentativo di scoprire nuove terapie². La leucemogenesi nei topi comporta il trapianto di cellule donatrici che esprimono oncoproteine di fusione, comprese le fusioni che coinvolgono il gene della leucemia a linea mista (MLL) per indurre potentemente la LMA, per imitare la malattia nell'uomo³. Varie origini cellulari di cellule donatrici sono state riportate nel trapianto di AML⁴ associata al gene MLL, con pochissime conoscenze sulle cellule responsabili dell'origine della malattia.

Sono state sviluppate molteplici vie per il trapianto nei topi; piuttosto che un'iniezione intra-femorale, che introduce direttamente cellule donatrici mutanti nel midollo osseo⁵, un'iniezione endovenosa che utilizza il plesso del seno venoso, la vena caudale e la vena giugulare è stata ampiamente utilizzata per generare modelli murini di LMA 6,7,8,9. Nel caso dell'iniezione retroorbitale (r.o.), vari svantaggi intrinseci, come la limitazione del volume, l'elevata richiesta tecnica, le poche possibilità di ripetuti tentativi o errori e potenziali lesioni oculari, sono stati importanti ostacoli con alternative limitate o non praticabili⁷. L'iniezione della vena caudale può avere problemi simili oltre alle lesioni locali; Per facilitare la procedura, i topi spesso devono essere riscaldati per dilatare le vene della coda¹⁰. È anche difficile individuare la vena caudale senza una fonte di luce aggiuntiva, in particolare nel ceppo C57BL / 6 dei topi. Per l'iniezione della vena giugulare, il personale di ricerca richiede una formazione sufficiente per localizzare la vena e limitare le possibili complicanze. Inoltre, sia le iniezioni di seno venoso che di vena giugulare devono essere eseguite in anestesia, il che aggiunge un altro livello di complessità. Pertanto, si è tentati di esplorare nuove vie per il trapianto per facilitare la creazione di modelli murini AML.

L'iniezione intraperitoneale (i.p.) è comunemente usata per somministrare farmaci, coloranti e anestetici 11,12,13,14,15; È stato anche usato per introdurre cellule ematopoietiche per l'ematopoiesi ectopica¹⁶ e per trapiantare cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo in vari modelli murini 17,18,19,20,21. Tuttavia, è stato usato raramente per stabilire neoplasie ematopoietiche nei topi, in particolare per studiare la progressione della malattia AML.

Il presente studio descrive la fattibilità dell'iniezione di i.p. nella generazione di modelli murini AML, oltre a confrontare l'efficienza del trapianto di popolazioni di lignaggio negativo (Lin-) e Lin-Sca-1 + ^{c-Kit +} (LSK) come cellule donatrici. Questi risultati forniscono un modo semplice ed efficiente per generare modelli sperimentali di LMA e leucemie mieloidi correlate. Tale metodo ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi della malattia e fornire un modello relativamente facile per testare terapie sperimentali.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati preapprovati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Pennsylvania State University.

1. Preparazione di tamponi e reagenti

1. Preparare piastre di agar LB con ampicillina integrata (AP) (piastre sterili da 10 cm). Per fare questo, sciogliere 10 g di brodo LB con agar in 400 ml di acqua distillata, mescolare e portare il volume fino a 500 ml. Sterilizzare la soluzione in autoclave, quindi lasciare raffreddare la soluzione, aggiungere 0,5 ml di ampicillina (stock: 150 mg / ml) nella soluzione e agitare per mescolare. Aggiungere immediatamente 18 mL di soluzione in una piastra sterile da 10 cm vicino a una lampada ad alcool, lasciare solidificare a temperatura ambiente e conservare le piastre capovolte a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.
2. Preparare i mezzi LB sciogliendo 10 g di LB senza agar in 500 mL di acqua distillata. Sterilizzare la soluzione mediante autoclave, lasciare raffreddare la soluzione, aggiungere 0,5 ml di ampicillina (stock: 150 mg/ml) nella soluzione e agitare per mescolare.
3. Preparare il tampone di flusso aggiungendo 5 ml di penicillina/streptomicina e 10 ml di siero bovino fetale inattivato dal calore (hiFBS) in 485 ml di 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS).
   NOTA: Per inattivare l'FBS mediante riscaldamento, posizionare le bottiglie FBS scongelate a bagnomaria a 56 °C. Assicurarsi che le bottiglie non si ribaltino o non vengano altrimenti sommerse nel bagnomaria. La temperatura è fondamentale per il completo degrado; per garantire ciò, attendere che la temperatura si stabilizzi a 56 °C dopo aver messo le bottiglie a bagnomaria. Ruotare delicatamente le bottiglie ogni 10 minuti tre volte. Non lasciare che il siero incubi per più di 30 minuti.
4. Preparare i mezzi di manutenzione aggiungendo 50 ml di hiFBS, 5 mL di L-glutammina e 5 ml di penicillina/streptomicina in 440 ml di terreno di aquila modificato (DMEM) di Dulbecco. Preparare i mezzi di trasfezione aggiungendo 50 ml di hiFBS e 5 ml di L-glutammina in 445 ml di supporti DMEM.
5. Preparare il tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) aggiungendo 4,145 g di NH₄Cl, 0,504 g di NaHCO₃ e 16,81 mg di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in 500 ml di acqua distillata. Preparare il mezzo di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove aggiungendo 75 ml di hiFBS, 5 g di albumina sierica bovina (BSA), 0,5 ml di 10 mg/ml di insulina, 2,5 ml di olotransferrina da 4 mg/ml, 3,5 μL di β-mercaptoetanolo, 5 ml di L-glutammina e 0,5 ml di ciprofloxacina in 416,5 mL di media IMDM.
6. Preparare 10 ml di 2x mezzi IMDM, in cui la concentrazione di citochine è il doppio della quantità in 1x IMDM media, aggiungendo 10 μL di 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL di 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL di 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL di 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL di 10 mg/mL di insulina, e 50 μL di olotransferrina da 4 mg/mL in 9,87 mL di mezzi IMDM incompleti.
   NOTA: assicurarsi che il buffer di flusso, il tampone di lisi dei globuli rossi, i mezzi di manutenzione, i mezzi di trasfezione e i supporti IMDM incompleti siano sterilizzati con filtro prima dell'uso.

2. Trasformazione plasmidica

1. Scongelare 20 μL di cellule competenti α-Select su ghiaccio. Aggiungere 1 μL (~2 ng) di MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmide²² alle cellule competenti scongelate e mescolare delicatamente picchiettando il tubo. Incubare la reazione sul ghiaccio per 30 minuti.
2. Shock termico della miscela mediante incubazione per 40 s in un blocco riscaldante a 42 °C. Trasferire immediatamente il tubo sul ghiaccio per 2 minuti.
3. Aggiungere 1 mL di fluido LB (senza ampicillina) al tubo e agitare a 37 °C e 200 giri/min per 1 ora.
4. Centrifugare il tubo a temperatura ambiente a 500 x g per 4 minuti ed eliminare 0,9 mL di surnatante. Risospendere il precipitato nei restanti 0,1 mL di fluido LB.
5. Distribuire le cellule competenti trasformate su piastre di agar AP LB preriscaldate (37 °C). Incubare la piastra capovolta a 37 °C per 12-16 ore.
6. Scegli una singola colonia e spendi le cellule trasformate in 10 ml di materiale AP LB durante la notte a 37 °C e 200 giri/min.
7. Aggiungere 5 mL di cellule competenti trasformate esaurite a 500 mL di materiale AP LB in un matraccio e incubare il matraccio per una notte a 37 °C e 200 giri/min.
8. Estrarre il plasmide utilizzando un kit di estrazione plasmidica secondo le istruzioni del produttore e risospendere in 0,5 ml di acqua ultrapura autoclavata. Quantificare il plasmide utilizzando uno spettrofotometro.

3. Trasfezione di cellule ecotrope di Phoenix (pECO)

1. Coltura 2 x 10⁶ pECO celle/piastra in mezzi di manutenzione in piastre da 10 cm in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C. Assicurarsi che le cellule pECO siano mantenute in fase di crescita esponenziale e si dividano attivamente prima del passaggio.
2. Quando le cellule diventano confluenti all'80%, lavare le piastre con 5 ml di DPBS due volte, aggiungere 1 ml di tripsina alla piastra e incubare in un incubatore umidificato al 5% di CO 2 a 37 °C per₂ minuti. Raccogliere le cellule con 5 mL di terreno di mantenimento in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare a 4 °C e 400 x g per 3 minuti. Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzi di mantenimento.
3. Mescolare 10 μL di sospensione cellulare e 10 μL di blu tripano e caricare 10 μL su un emocitometro per contare le cellule.
   Totale celle/mL = (Totale celle contate x Fattore di diluizione x 10⁴ celle/ml)/Numero di quadrati contati)
   Seminare 2 x 10 6 cellule/piatto in piatti da⁶ cm utilizzando 5 ml di terreno di mantenimento per la trasfezione e la coltura delle cellule in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C.
4. Sostituire i mezzi di mantenimento con 5 ml di terreno di trasfezione quando le cellule diventano confluenti al 50%-60% dopo 18 ore di coltura.
5. Mantenere il reagente di trasfezione a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima della trasfezione.
6. Aggiungere 5,5 μg di MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmide²² a 0,5 mL di media DMEM semplice in un tubo sterile da 1,5 ml. Mescolare delicatamente picchiettando il tubo e lasciarlo riposare per 10 minuti.
7. Aggiungere 14,6 μL (3 volte la quantità di plasmide; v / p) di reagente di trasfezione al tubo e picchiettare delicatamente il tubo ogni 10 minuti tre volte.
8. Aggiungere uniformemente la miscela a goccia su tutte le aree dei piatti con le cellule pECO in mezzi di trasfezione. Spostare delicatamente i piatti avanti e indietro 10 volte e lateralmente 10 volte. Incubare le stoviglie in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C per 48 ore.
9. Misurare l'efficienza di trasfezione mediante microscopia a fioritura e citometria a flusso per la proteina fluorescente verde (GFP) come descritto in²². Le cellule vengono prima controllate su FSC-A/FSC-H e FSC-A e SSC-A per acquisire singoletti. La popolazione GFP⁺ è controllata sul grafico FL1 confrontandolo con cellule non trasfettate.
10. Raccogliere e filtrare i surnatanti attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm in un tubo sterile da 50 ml. Utilizzare immediatamente i surnatanti per la trasduzione o congelarli in azoto liquido e conservarli a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
    NOTA: le cellule pECO devono essere opportunamente miscelate e seminate in piatti in modo uniforme. Lasciare che le cellule si diffondano spostando i piatti avanti e indietro 10 volte e lateralmente 10 volte durante la semina. Il numero di cellule da seminare può variare a seconda delle variazioni nel conteggio. Per trovare il numero ottimale di cellule di semina che può raggiungere il 50% -60% di confluenza dopo 18 ore di coltura, è utile seminare cellule con diluizioni seriali.

4. Trasduzione lentivirale

1. Eutanasia di topi femmina CD45.1 di 8-10 settimane C57BL6/J (da due a tre topi donatori per topo ricevente) in una camera di CO₂ .
2. Sterilizzare tutto il corpo dei topi con etanolo al 70%. Posizionare i topi su un tampone chirurgico sterile su una tavola di polistirolo e fissare le gambe attraverso i cuscinetti delle zampe del mouse.
3. Tagliare la pelle sopra la cavità addominale sulla linea mediana e allargare lo spazio sottocutaneo verso le zampe posteriori con forbici sterili affilate.
4. Estendere l'incisione dalla linea mediana addominale fino alle caviglie. Allargare lo spazio sottocutaneo sotto le zampe posteriori con le lame di forbici sterili affilate.
5. Tagliare il tendine di Achille con forbici sterili affilate. Tenere il tendine usando una pinza con i denti e tagliare l'altra estremità attaccata al femore per rimuovere il muscolo gastrocnemio.
6. Tagliare il tendine del quadricipite attaccato al ginocchio con forbici sterili affilate. Tenere il tendine usando una pinza con i denti e tagliare le teste muscolari attaccate al femore per rimuovere il muscolo gastrocnemio.
7. Tagliare gli altri muscoli che circondano il femore all'estremità attaccati alla tibia con forbici sterili affilate.
8. Tagliare la caviglia con forbici sterili affilate, assicurandosi che la tibia rimanga intatta. Tenere l'estremità distale del femore usando una pinza con i denti e tagliare l'articolazione dell'anca con forbici sterili affilate, assicurandosi che la testa del femore rimanga intatta.
9. Trasferire le tibie e i femori in un tampone di flusso in un tubo sterile da 15 ml.
10. Separare la tibia e il femore rompendo il ginocchio a mano. Rimuovere la rotula, la cartilagine e i condili femorali per esporre il plateau tibiale e il femore distale a mano. Rimuovere i muscoli con una garza sterile e quindi immergere le ossa nel tampone di flusso.
11. Tagliare il collo del femore e lavare le cellule del midollo osseo con tampone di flusso da entrambe le estremità del femore usando una siringa da 10 ml con un ago da 23 G.
12. Tagliare il malleolo tibiale e lavare le cellule del midollo osseo con tampone di flusso da entrambe le estremità della tibia usando una siringa da 10 ml con un ago da 23 G.
13. Disperdere le cellule pipettando su e giù usando una siringa da 10 mL con un ago da 18 G. Centrifugare la sospensione monocellulare a 4 °C e 400 x g per 3 minuti.
14. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi per lisare i globuli rossi per 3 minuti.
15. Aggiungere 5 mL di tampone di flusso per arrestare la lisi e centrifugare la sospensione cellulare a 4 °C e 400 x g per 3 minuti.
16. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su un tubo sterile da 50 ml. Sospendere il pellet con 5 ml di tampone di flusso, mescolare e passare attraverso il filtro cellulare per raccogliere le cellule.
17. Regolare la concentrazione della cella con tampone di flusso a 1 x 10⁸/mL in tubi di polipropilene a fondo tondo.
18. Selezionare le cellule di Lin^- utilizzando un kit di isolamento delle cellule ematopoietiche del topo secondo le istruzioni del produttore.
19. Tenere da parte tre provette da 1 x 10⁴ cellule in 100 μL di tampone per un controllo non colorato e due controlli singoli colorati con anticorpi per CD117 (c-Kit) antitopo coniugato con APC e Ly-6A/E antitopo coniugato PE-Cy7 (Sca-1). Utilizzare 1 μL di anticorpo (da 0,2 mg/mL di stock) per ciascuno dei singoli controlli colorati con anticorpi.
20. Colorare il resto delle cellule in una provetta con entrambi gli anticorpi (4 μL di ciascuno da 0,2 mg/mL di stock) in 400 μL. Incubare i tubi sul ghiaccio al buio per 0,5-1 ora.
21. Dopo la colorazione, lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone di flusso e centrifugare a 4 °C e 400 x g per 3 minuti.
22. Risospendere le cellule per il controllo non colorato e i controlli singoli colorati con anticorpi in 100 μL di tampone di flusso. Risospendere le cellule colorate con doppio anticorpo in 1 mL di tampone di flusso per la selezione.
23. Ordinare le cellule staminali ematopoietiche (HSC) come una popolazione LSK utilizzando un selezionatore cellulare come descritto in^23,24.
24. Durante la colorazione, rivestire un piatto sterile da 6 cm con retronectina come segue: Preparare 100 μg/mL di scorte di retronectina in PBS e aggiungere 0,9 mL di PBS e 0,1 mL di retronectina a un piatto da 6 cm. Rivestire il piatto in un cappuccio sterile a temperatura ambiente per 2 ore. Quindi, rimuovere la retronectina e bloccare il piatto con 0,5 ml di BSA filtrato al 2% (in PBS) per 30 minuti. Lavare il piatto con 5 ml di PBS due volte e il piatto è pronto per la trasduzione.
25. Centrifugare le HSC selezionate o le cellule di Lin^- non selezionate a 4 °C e 400 x g per 3 minuti e risospendere in 3 mL di 2x (di citochine) mezzi IMDM e 3 mL di surnatante virale (generato dal punto 3.10) in un piatto rivestito di retronectina. Incubare il piatto in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C per 6 o 24 ore.
    NOTA: Nel presente studio, le cellule di Lin^- sono state ordinate o non ordinate a seconda del disegno sperimentale.

5. Trapianto seriale (Figura 1)

NOTA: I topi riceventi primari erano topi maschi C57BL6/J di 8-10 settimane (CD45.2). Sono stati forniti acqua ad libitum contenente antibiotici per prevenire infezioni digestive opportunistiche, da 3 giorni prima del trapianto a 7 giorni dopo il trapianto. I topi riceventi primari sono stati irradiati sub-letalmente (4,75 Gy) 3 ore prima del trapianto²⁵. L'isoflurano non è stato applicato ai topi con iniezione intraperitoneale.

1. Dopo la trasduzione per 6 o 24 ore, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a temperatura ambiente e 400 x g per 3 minuti. Utilizzare la tripsina per raccogliere le cellule attaccate al fondo del piatto, se necessario. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel PBS preriscaldato. Determinare il volume di PBS in base al numero di destinatari (cioè 0,1 mL/topo e 0,5 ml/topo per i riceventi con iniezioni retro-orbitali e intra-peritoneali, rispettivamente).
2. Collocare i topi riceventi irradiati sub-letalmente in una camera di isoflurano (la portata di ossigeno è impostata su 1,0 L/min e il vaporizzatore di isoflurano è impostato su 5%). Applicare unguento bagnato sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. I topi sono pronti per ulteriori procedure quando il battito cardiaco scende a 60 battiti al minuto.
3. Iniettare cellule in topi riceventi primari retroorbitalmente (0,1 mL/topo)⁷ o intraperitonealmente (0,5 mL/topo)26 con un ago da ²⁷ G1/2. Osservare i topi continuamente fino a quando non acquisiscono sufficiente coscienza per mantenere la recumbentenza sternale. Monitorare quotidianamente i topi per il loro benessere dopo il trapianto.
4. Dopo 1 mese, raccogliere il sangue settimanalmente mediante sanguinamento retroorbitale per monitorare la leucocitosi valutando l'emocromo completo (CBC) su un havet come descritto di seguito.
   1. Posizionare il mouse lateralmente dopo l'anestesia con isoflurano (la portata di ossigeno è impostata su 1,0 L/min e il vaporizzatore di isoflurance è impostato su 5%). I topi sono pronti per ulteriori procedure quando il battito cardiaco scende a 60 battiti al minuto.
   2. Proptose l'occhio con il pollice e l'indice. Penetrare nel plesso del seno venoso con tubo capillare hemacrit asterile attraverso il canto interno.
   3. Raccogliere 20-25 μL di sangue in un tubo di raccolta del sangue EDTA e chiudere le palpebre per fermare l'emorragia. Applicare una goccia di soluzione oftalmica di gentamicina solfato sull'occhio.
5. Alla fine, quando i globuli bianchi (WBC) raggiungono 4 x 10 4 cellule / μL, eutanasia del topo in una camera CO₂ e isolare le cellule del midollo osseo lavando i femori e le tibie con tampone di flusso, seguito dalla lisi dei globuli rossi come menzionato nella fase⁴.
6. Alla fine, raccogliere gli splenociti come indicato di seguito.
   1. Eutanasia del topo in una camera CO₂ . Posizionare i topi su un tampone chirurgico sterile su una tavola di polistirolo e fissare le gambe attraverso i cuscinetti delle zampe del mouse. Sterilizzare tutto il corpo dei topi con etanolo al 70%.
   2. Tagliare la pelle e il muscolo sulla linea mediana per esporre la cavità addominale con forbici sterili affilate. Isolare la milza con forbici sterili affilate e metterla in un tampone di flusso in un tubo sterile da 15 ml.
   3. Mescolare la milza attraverso un colino sterile da 70 μm in un piatto da 6 cm con 3 ml di tampone di flusso. Trasferire le cellule dal piatto in una provetta sterile da 15 ml e centrifugare la sospensione monocellulare a 4 °C e 400 x g per 3 minuti.
   4. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi per lisare i globuli rossi per 3 minuti. Aggiungere 5 mL di tampone di flusso per arrestare la lisi e centrifugare la sospensione cellulare a 4 °C e 400 x g per 3 minuti.
   5. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su un tubo sterile da 50 ml. Sospendere il pellet con 5 ml di tampone di flusso, mescolare e passare attraverso il filtro cellulare per raccogliere le cellule.
7. Identificare le cellule AML primarie (1°) colorando gli splenociti e le cellule del midollo osseo con l'anticorpo CD45.1 coniugato con FITC e rilevando su un citometro a flusso. Le cellule vengono prima controllate su FSC-A/FSC-H e FSC-A e SSC-A per acquisire singoletti. La popolazione CD45.1+ è controllata sul grafico FL1 confrontandolo con cellule non colorate.
8. Per il trapianto secondario (2°), risospendere le cellule spleniche LMA CD45.1 da riceventi di 1° r.o. in PBS (0,1 mL/topo) e iniettarle retroorbitalmente in topi maschi CD45.2 C57BL6/J. Parallelamente, risospendere le cellule spleniche AML da 1° i.p. riceventi in PBS (0,5 mL/topo) e iniettarle intraperitonealmente in topi maschi di 8-12 settimane di proteina di fluorescenza rossa (RFP) che esprimono Ai14^{TdTomato 27}.
9. Per il trapianto terziario (3°), risospendere le cellule LMA isolate dal midollo osseo o dalla cavità peritoneale di 2° i.p. riceventi e iniettarle intraperitonealmente rispettivamente in topi Ai14^TdTomato (RFP⁺) o CD45.2. Risospendere le cellule AML isolate dalla cavità peritoneale dei riceventi di 2° r.o. e trapiantarle mediante iniezione di r.o. in topi Ai14^TdTomato (RFP⁺).
   NOTA: Per il 2° trapianto, abbiamo identificato la progressione della malattia in 2° riceventi monitorando il CBC nel sangue periferico. Per confermare ulteriormente l'istituzione della LMA, abbiamo raccolto sangue periferico intero mediante puntura cardiaca, midollo osseo, milza e fegato. Inoltre, abbiamo eseguito il lavaggio i.p. per raccogliere le cellule i.p. Le sospensioni monocellulari sono state acquisite dal midollo osseo, dalla milza e dal lavaggio i.p. come descritto sopra. Le cellule di questi siti sono state analizzate su un citometro a flusso dopo la lisi dei globuli rossi. Le cellule AML sono state riconosciute come cellule RFP negative (RFP^-). Per il 3° trapianto, abbiamo campionato sangue, midollo osseo, milza, fegato e cellule i.p. all'endpoint; Le cellule ^{RFP o} CD45.1⁺ sono state identificate come cellule AML ed esaminate mediante citometria a flusso. Non è stata somministrata acqua di irradiazione o antibiotica a topi riceventi 2° e 3°.

Figura 1: Schema della trasduzione virale di MLL-AF9 nelle HSC del midollo osseo e trapianto seriale (1°, 2° e 3°). L'ordinamento della popolazione doppia positiva di Sca-1 e c-Kit utilizzando un ordinatore di celle mostrato nella casella dell'ombra tratteggiata è considerato facoltativo, se le risorse lo consentono. La figura è stata creata utilizzando BioRender (https://biorender.com/). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

6. Lavaggio intraperitoneale

1. Iniettare 5 mL di IMDM media incompleto nella cavità peritoneale due volte per raccogliere le cellule in un tubo sterile da 15 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente e 400 x g per 3 min. Trapianto di cellule LMA (4 x 10⁵ cellule/topo) dalla cavità peritoneale di 2° riceventi tramite iniezione i.p. in topi riceventi 3° CD45.2 (n = 3).

7. Analisi istologica ²⁸

1. Isolare la milza, i fegati e i femori dai topi dopo l'eutanasia. Fissarli in 5 ml di formalina tamponata al 10% (v/v). Campionare la milza e il fegato da controparti sane per i confronti.
2. Incorporare i tessuti fissi in paraffina e tagliarli in sezioni. Colorare le sezioni con coloranti di ematossilina ed eosina (H & E).
3. Ottenere le immagini al microscopio con ingrandimento 20x installato con un software compatibile per l'analisi istologica.

8. Esecuzione della PCR semi-quantitativa (qPCR)

1. Preparare gli RNA nel reagente RNA secondo le istruzioni del produttore.
2. Utilizzare 0,5-1,0 μg di RNA per sintetizzare il cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa del cDNA secondo le istruzioni del produttore.
3. Utilizzare cDNA per eseguire qPCR utilizzando un kit qPCR ed eseguire i campioni in un sistema qPCR. Utilizzare le seguenti sonde TaqMan pre-convalidate: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)²⁹ e 18S RNA ribosomiale (Hs99999901_s1).
4. Caricare gli ampliconi KMT2A e 18S su un gel di agarosio al 2% per visualizzare l'espressione. Acquisire immagini in un imager installato con il programma software compatibile.

9. Trattamento dei dati

1. Analizza i risultati utilizzando un software di analisi statistica e presenta i risultati come media ± SEM. Genera figure utilizzando uno strumento illustratore commerciale.

Risultati

Confronto dell'efficienza del trapianto di cellule LMA murine utilizzando vie di trapianto r.o. e i.p.
In precedenza, l'istituzione di 1° AML è stata riportata in topi riceventi trapiantati retroorbitalmente con cellule LSK trasdotte MLL-AF9 e la trapiantabilità di 1° cellule AML è stata dimostrata mediante trapianto seriale³⁰. Il presente studio è il primo a valutare la possibilità di utilizzare le cellule Lin^- del midollo osseo per eseguire il trapianto. La ...

Discussione

Questi studi sopra descritti forniscono prove a sostegno del fatto che il trapianto di cellule Lin^- è paragonabile alle cellule LSK nella generazione di LMA murina 1°. Inoltre, i dati attuali mostrano anche che l'iniezione i.p. è un metodo efficiente e conveniente per stabilire la LMA murina rispetto all'iniezione endovenosa (o r.o.).

Oltre alle cellule LSK, altre popolazioni come il progenitore granulocitario-monocitario (GMP), il progenitore linfoide comune (CLP) e il progenito...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Select competent cells	Bioline	BIO-85027
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma Aldrich	Cat# A-9434
Ampicillin	Sigma Aldrich	Cat# A0797
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade	Gemini bio-products	Cat# 700-102P
Ciprofloxacin HCl	GoldBio.com	Cat# C-861-100
DMEM, high glucose, no glutamine	Gibco	Cat# 11960-044
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	Cat# 21-031-CV
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade	Calbiochem	Cat# 324503
Fetal Bovine Serum - Premium Select	Atlanta Biologicals	Cat# S11550
Holo-transferrin, bovine	Sigma Aldrich	Cat# T1283
Insulin solution human	Sigma	Cat# I-9278
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	Cat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) solution	HyClone, Gelifesciences	Cat# SH30034.01
LB broth, Lennox	NEOGEN	Cat #: 7290A
LB Broth with agar (Miller)	Sigma Aldrich	Cat# L-3147
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)	Miltenyi Biotec	Cat# 130-124-211
Mouse Interleukin-3 (IL-3)	Gemini bio-products	Cat# 300-324P
Mouse Interleukin-6 (IL-6)	Gemini bio-products	Cat# 300-327P
Mouse Stem Cell Factor (SCF)	Gemini bio-products	Cat# 300-348P
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	Cat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) cells	ATCC	CRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular	JT. Baker	Cat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)	BioLegend	Cat # 105812
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)	BD Pharmingen	Cat# 558162
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Pepro Tech, INC.	Cat# 250-31L
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	TaKaRa	Cat# T100A
TransIT-293 Reagent	MirusBio	Cat# MIR 2705
TRI Reagent	Sigma Aldrich	Cat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	Cat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	Cat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	Cat# M3148
Commercial Assays
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit	StemCell technologies	Cat# 19856A
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher	Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMix	Quanta Bio	Cat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25)	Qiagen	Cat#:12163
Animals
Ai14TdTomato mice	Jackson Laboratory	Strain # 007914
CD45.1 C57BL6/J mice	Jackson Laboratory	Strain # 002014
CD45.2 C57BL6/J mice	Jackson Laboratory	Strain # 000664
Instruments and Softwares
Adobe illustrator	Version 25.2.3
BD accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences
FlowJo 10.8.0	BD
GeneSys software program	Version 1.5.7.0
GraphPad Prism version 6	GraphPad
Hemavet 950FS	Drew Scientific
7300 Real time PCR system	Applied Biosystems
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging	G:Box Chemi