توحيد النقل عبر المختبرات بين أجهزة قياس التدفق الخلوي للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال الذين تم تطعيمهم بالتهاب الدماغ الياباني

Summary

في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لتسهيل نقل الإعدادات التجريبية وقوالب التحليل بين اثنين من مقاييس التدفق الخلوي في مختبرين للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال اليابانيين الذين تم تطعيمهم ضد التهاب الدماغ. ستسمح طريقة التوحيد القياسي لتجارب مقياس التدفق الخلوي بإجراء مشاريع بحثية بفعالية في مراكز متعددة.

Abstract

يحتاج عدد متزايد من المختبرات إلى جمع البيانات من أجهزة قياس التدفق الخلوي المتعددة ، خاصة للمشاريع البحثية التي يتم إجراؤها عبر مراكز متعددة. تشمل تحديات استخدام مقياسين خلويين للتدفق في مختبرات مختلفة نقص المواد الموحدة ، ومشكلات توافق البرامج ، وعدم الاتساق في إعداد الأدوات ، واستخدام تكوينات مختلفة لأجهزة قياس التدفق الخلوي المختلفة. لإنشاء تجربة قياس التدفق الخلوي الموحدة لتحقيق اتساق وقابلية مقارنة النتائج التجريبية عبر مراكز متعددة ، تم إنشاء طريقة توحيد سريعة ومجدية لنقل المعلمات عبر مقاييس التدفق الخلوي المختلفة.

سمحت الطرق التي تم تطويرها في هذه الدراسة بنقل الإعدادات التجريبية وقوالب التحليل بين مقياسين للتدفق الخلوي في مختبرات مختلفة للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الأطفال الذين تم تطعيمهم بالتهاب الدماغ الياباني (JE). تم الحصول على شدة مضان متسقة بين اثنين من أجهزة قياس الخلايا باستخدام حبات قياسية مضان لتحديد إعدادات مقياس الخلايا. تم الحصول على نتائج قابلة للمقارنة في مختبرين بأنواع مختلفة من الأدوات. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا توحيد التحليل لتقييم الوظيفة المناعية للأطفال الذين تم تطعيمهم في JE في مختبرات مختلفة بأدوات مختلفة ، وتقليل الاختلافات في البيانات والنتائج بين أجهزة قياس التدفق الخلوي في مراكز متعددة ، وتوفير نهج عملي للاعتماد المتبادل لنتائج المختبر. ستضمن طريقة التوحيد القياسي لتجارب مقياس التدفق الخلوي الأداء الفعال للمشاريع البحثية عبر مراكز متعددة.

Introduction

يعد توحيد قياس التدفق الخلوي مفيدا لمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من أجهزة قياس الخلايا المختلفة عبر المختبرات ومراكز الدراسة المختلفة ، ويؤدي إلى الاعتراف المتبادل بالنتائج لتحسين كفاءة العمل. وهناك عدد متزايد من السيناريوهات التي تتطلب توحيدا. أثناء عملية تطوير الدواء ، يعد توحيد قياس التدفق الخلوي أمرا مهما ، حيث أن الفحص المطور والمعتمد سيدعم عملية تطوير الدواء بأكملها من التحليل قبل السريري إلى التحليل السريري. كثيرا ما يتم نقل طرق قياس التدفق الخلوي بين صناعة الأدوية والمختبرات المتعاونة¹. علاوة على ذلك ، من الضروري الحصول على بيانات قابلة للمقارنة من الدراسات السريرية متعددة المراكز. على سبيل المثال ، تم تطوير سير عمل التوحيد القياسي في مشروع الأبحاث السريرية متعددة المراكز لأمراض المناعة الذاتية الجهازية للحصول على بيانات قابلة للمقارنة من قياس التدفق الخلوي متعدد المراكز².

توحيد طرق قياس التدفق الخلوي يمثل تحديا. تعزى التحديات التي تواجهها المختبرات إلى نقص المواد الموحدة ، ومشكلات توافق البرامج ، وعدم الاتساق في إعداد الأدوات ، واستخدام تكوينات مختلفة بين مقاييس التدفق الخلوي المختلفة واستراتيجيات البوابات المتباينة بين المراكز ^3,4. لذلك ، من المهم إجراء تحليل الفجوة بين المختبرات. يجب مراجعة الوصول إلى العينات وأنظمة الجودة ومؤهلات الموظفين وتكوين الأداة لضمان تلبية المتطلبات.

في الوقت الحاضر ، الأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح التهاب الدماغ الياباني (JE) لديهم انخفاض كبير في حدوث JE⁵. يمكن أن تساعد مراقبة الخلايا المناعية للدم المحيطي في فهم التغيرات في المناعة التكيفية بوساطة الخلايا بعد التطعيم ، والعلاقة بين التغيرات في المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي وتأثيرات التطعيم. نظرا للاستقرار المحدود لعينات الدم الكاملة ، غالبا ما يتم إجراء تقييمات لفعالية اللقاح في مراكز متعددة. في هذا التحليل ، حددنا خلايا CD8 + أو CD4 + T الساذجة على أنها CD27 + CD45RA+ ، وخلايا الذاكرة التائية المركزية (T_CM) على أنها CD27 ⁺ CD45RA- ، والخلايا التائية للذاكرة المستجيبة (T_EM) على أنها CD27- CD45RA- ، والخلايا التائية للذاكرة المستجيبة المتمايزة نهائيا (T_EMRA) على أنها CD27^- CD45RA⁺. يمكن فصل خلايا CD19 + B إلى مجموعات تعبر عن CD27 مقابل IgD ^6,7 ، ويمكن تحديد الخلايا البائية الساذجة التي تعبر عن خلايا الذاكرة البائية CD27n (mBCs) بناء على تعبير IgD⁶ ، ويمكن تحديد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) على أنها CD4 + CD25 ^{+ + CD127 منخفضة 8}. لإنشاء تجربة موحدة لقياس التدفق الخلوي لتحقيق اتساق وقابلية مقارنة النتائج التجريبية في مراكز متعددة ، تم إنشاء طريقة توحيد سريعة ومجدية لتسهيل نقل البروتوكولات عبر أجهزة قياس التدفق الخلوي المختلفة للكشف عن الخلايا الليمفاوية في الدم الكامل للأطفال الذين تم تطعيمهم ب JE. تم تجنيد ستة أطفال أصحاء (2 سنة) من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية. بعد تلقي التطعيم الأولي والتطعيم المعزز بلقاح JE SA14-14-2 الموهن الحي قبل أقل من 6 أشهر ، تم جمع عينات الدم المحيطية من المتطوعين. تم الحصول على بيانات قابلة للمقارنة بدرجة كبيرة من أدوات مختلفة باتباع إجراءات موحدة ، وهو أمر مفيد للتقييمات متعددة المراكز.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية (رقم الموافقة: 2020-k-85). تم التنازل عن الموافقة المستنيرة للمواضيع البشرية حيث تم استخدام العينات المتبقية فقط بعد الاختبارات السريرية في هذه الدراسة. يشارك مختبران في هذه الدراسة. مختبر النقل هو المكان الذي تم فيه تطوير الطريقة الموحدة باستخدام مقياس تدفق خلوي واحد. يشار إلى مقياس الخلايا في هذا المختبر فيما يلي باسم مقياس المقياس الخلوي A. مختبر طريقة الاختبار هو المختبر الذي يستقبل الطرق باستخدام مقياس تدفق خلوي آخر ، ويشار إلى مقياس الخلايا في هذا المختبر فيما يلي باسم مقياس التدفق الخلوي B.

1. جمع عينات الدم المحيطية وإعداد الخلايا

1. اجمع عينات الدم المحيطية (2 مل) من الأطفال الذين تم تطعيمهم في JE والأطفال غير الملقحين في أنابيب EDTA-K₂ المضادة للتخثر عن طريق بزل الوريد القياسي.
2. امزج عينة الدم بأكملها عن طريق قلب الأنابيب رأسا على عقب 10x. أضف 100 ميكرولتر من الدم الكامل إلى أنبوب 12 مم × 75 مم. اجعل كل عينة من نسختين.
3. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للبقع اللامع (BV buffer) إلى أنبوب 12 مم × 75 مم. أضف 5 ميكرولتر من كل جسم مضاد (CD45 ، CD3 ، CD4 ، CD8 ، CD127 ، CD27 ، CD19 ، IgD ؛ عامل التخفيف: 1:20) و 20 ميكرولتر من الجسم المضاد (CD25 ، CD45RA ؛ عامل التخفيف: 1: 5) إلى المخزن المؤقت BV. دوامة بلطف.
   ملاحظة: يتم عرض أحجام ومعلومات كواشف الأجسام المضادة في الجدول 1.
4. أضف كوكتيل الأجسام المضادة إلى الأنبوب مع عينة الدم بأكملها. دوامة بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام.
5. قم بتخفيف محلول التحلل 10x 1:10 بالماء المقطر لتحضير محلول تحلل 1x. تحلل عينات الدم بإضافة 2 مل من محلول التحلل 1x. دوامة بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
6. أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وصب طاف.
7. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وصب المادة الطافية.
8. أعد تعليق الحبيبات في 0.5 مل من 1x PBS واخلطها جيدا. يحفظ في درجة حرارة 2 إلى 8 درجات مئوية. إرسال العينات إلى المعملين لتحليل التدفق الخلوي.
   ملاحظة: يجب معالجة عينة التحكم السلبية والتحكم أحادي الخلية في وقت واحد.

2. إعداد حبات التعويض والتحكم في بقعة واحدة

1. التسمية V500-anti-CD45 أحادية اللون ، APC-H7-anti-CD3 أحادية اللون ، FITC-anti-CD4 أحادية اللون ، R718-anti-CD8 أحادية اللون ، BV605-anti-CD27 أحادية اللون ، APC-anti-CD45RA أحادية اللون ، PE-anti-CD25 أحادية اللون ، BV421-anti-CD127 أحادية اللون ، BB700-anti-CD19 أحادية اللون ، وأنابيب PE-CY7-anti-IgD أحادية اللون.
2. أضف 100 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) إلى أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع سعة 5 مل.
3. أضف 50 ميكرولتر من الخرز السالب و 50 ميكرولتر من حبيبات Ig المضادة للفأر ، κ إلى كل أنبوب ودوامة.
4. أضف 2 ميكرولتر من كل جسم مضاد مسمى (CD45 ، CD3 ، CD4 ، CD8 ، CD25 ، CD127 ، CD45RA ، CD27 ، CD19 ، IgD) إلى أنبوب مصبوغ واحد. يحوم المزيج برفق ويحتضنه لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية).
5. أعد تعليق الخرزات في 2 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وصب المادة الطافية.
6. أعد تعليق الخرزات في 0.5 مل من 1x PBS واخلطها جيدا. يحفظ في درجة حرارة 2 إلى 8 درجات مئوية.

3. استخدام أسماء تكوين متطابقة على أجهزة قياس الخلايا المختلفة في مختبرين

1. قم بإنشاء تكوين جديد في برنامج مقياس الخلايا A. انقر فوق الزر Cytometer واختر عرض التكوينات لعرض نافذة التكوين.
2. في قائمة التكوين، انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد التكوينات الأساسي، واختر مجلد جديد، وأعد تسميته.
3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق التكوين الأساسي واختر نسخ.
4. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المجلد الجديد والصق التكوين الأساسي لإنشاء تكوين جديد. إعادة تسمية التكوين الجديد "نقل الطريقة الموحدة".
5. اسحب اسم المعلمة، مثل FITC، من قائمة المعلمات إلى الكاشف المناسب (530/30).
6. قم بتحرير معلمات إضافية (PE و BB700 و PE-CY7 و APC و R718 و APC-H7 و BV421 و V500 و BV605) إلى التكوين الجديد.
7. اتبع هذه الطريقة لإنشاء تكوين جديد على نموذج مقياس تدفق خلوي مختلف باستخدام نفس الاسم "نقل الطريقة الموحدة". تأكد من أن التكوين يتضمن نفس المعلمات لكل كاشف.
   ملاحظة: لتحديد قالب التجربة بنجاح على نموذجي مقياس التدفق الخلوي المختلفين، تأكد من تناسق الاسم.
8. تحت تكوينات مقياس الخلايا ، استخدم خرز إعداد مقياس الخلايا وتتبعه (CST) لتحديد خط الأساس لمقياس الخلايا وتتبع أداء مقياس الخلايا. انقر فوق الزر Cytometer واختر CST لعرض إعداد مقياس الخلايا ومساحة عمل التتبع.
9. أضف ثلاث قطرات (150 ميكرولتر) من حبات الإعداد إلى 0.5 مل من 1x PBS في أنبوب اختبار البوليسترين المستدير القاع سعة 5 مل. ضع أنبوب الخرز على مقياس الخلايا.
10. في نافذة التحكم في الإعداد ، اختر تعريف الأساس، وانقر فوق تشغيل.

4. توحيد التجربة باستخدام مقياس الخلايا A في مختبر النقل

1. قم بإجراء فحص أداء باستخدام إعداد مقياس الخلايا وتتبع الخرز للتحقق من أن مقياس الخلايا يعمل بشكل جيد.
2. في نافذة مستعرض البرامج، انقر بزر الماوس الأيمن فوق إعدادات مقياس الخلايا واختر إعدادات التطبيق لإنشاء ورقة عمل.
3. باستخدام عينة غير ملوثة ، اضبط جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) ل FSC و SSC وجميع معلمات التألق. FSC: 260 ؛ SSC: 460 ؛ FITC: 490 ؛ PE: 575 ؛ BB700: 620 ؛ PE-CY7: 640 ؛ APC: 600 ؛ R718: 620 ؛ APC-H7: 620 ؛ BV421: 466 ؛ V500: 420 ؛ و BV605: 505.
4. انقر بزر الماوس الأيمن فوق إعدادات مقياس الخلايا التجريبي واختر إعدادات التطبيق لحفظه.
5. انقر على زر التجربة واختر قائمة إعداد التعويض . ثم اختر إنشاء عناصر تحكم في التعويض لإضافة عناصر التحكم في التعويض تلقائيا.
6. تسجيل البيانات لجميع حبات التحكم في التعويض.
7. انقر على التجربة واختر إعداد التعويض. ثم احسب التعويض تلقائيا.
8. تسجيل البيانات لعناصر التحكم أحادية اللون للخلية.
9. استخدم CD45RA APC لتعديل قيمة التعويض من R718 إلى 15٪ APC. استخدم CD19 BB700 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 14٪ BB700. استخدم CD8 R718 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 60٪ R718.
10. سجل البيانات لخرز CST.
11. قم بإنشاء ورقة عمل عمومية لقالب القيمة الهدف للخرز اللامع CST.
12. باستخدام مخطط FSC / SSC ، ارسم بوابة المضلع للخرز اللامع CST. احصل على مخططات الرسم البياني ل 10 قنوات مضان للخرز اللامع CST: FITC و PE و BB700 و PE-Cy7 و APC و R718 و APC-H7 و BV421 و V500 و BV605. إنشاء بوابات الفاصل الزمني في مخططات الرسم البياني. قم بإنشاء طريقة عرض الإحصائيات من خلال إظهار وسيط بوابات الفاصل الزمني.
13. تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي ؛ جمع ما مجموعه 25000 الخلايا الليمفاوية.
14. إنشاء ورقة عمل عمومية لقالب التحليل للعينات.
15. استخدم نموذج استراتيجية البوابة التالية:
    1. باستخدام مخطط نقطي CD45 / منطقة التشتت الجانبية (SSC-A) ، ارسم بوابة المضلع لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة مع استبعاد الحطام.
    2. باستخدام مخطط نقطي CD3 / CD19 ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد خلايا CD3 + T وخلايا CD19 ⁺ B.
    3. باستخدام مخطط نقطي CD4 / CD8 ، ارسم بوابة رباعية لتحديد خلايا CD4 + أو CD8 ⁺ T (خلايا ذات مضان عالي لهذه العلامات ، على التوالي).
    4. باستخدام مخطط نقطي CD45RA/CD27، ارسم بوابة رباعية لتقسيم خلايا ^CD8+ أو CD4+ T إلى خلايا ساذجة (CD27+CD45RA+) وT_CM (CD27⁺ CD45RA-) وT _EM (CD27-CD45RA^-) وT_EMRA (CD27-CD45RA⁺).
    5. باستخدام مخطط نقطي CD25 / CD127 ، ارسم بوابة رباعية لتقسيم خلايا CD4 + T إلى خلايا Treg (CD4 + CD25 + ^{+ CD127 منخفضة}).
    6. باستخدام مخطط نقطي CD27 / IgD ، ارسم بوابة رباعية لتقسيم خلايا CD19 + B إلى خلايا B ساذجة (CD27-IgD +) وخلايا ذاكرة B (CD27 ⁺ IgD^-).
16. احفظ القالب التجريبي على مقياس الخلايا A.
17. استخدم القرص المضغوط لتصدير القالب التجريبي.

5. نقل القالب التجريبي إلى مقياس الخلايا B في مختبر طريقة الاختبار

ملاحظة: يتضمن القالب التجريبي إعدادات الجهاز وقالب التحليل وقالب القيمة المستهدفة لمتوسط شدة التألق (MFI).

1. قم بإجراء فحص الأداء باستخدام حبات CST للتحقق من أن مقياس الخلايا يعمل بشكل جيد.
2. استيراد القالب التجريبي وإنشاء تجربة لمقياس الخلايا B باستخدام القالب.
3. استخدم نفس الكمية من حبات CST لضبط جهد معلمة الفلورسنت لكل قناة مضان لتتناسب مع أداة MFI السابقة.
   ملاحظة: تختلف قيم MFI في حدود ±5٪ (يظهر في الجدول 2 MFI للخرز اللامع قبل وبعد النقل).
4. اضبط الجهد ل FSC باستخدام العينة غير الملوثة ، إذا لزم الأمر.
5. انقر بزر الماوس الأيمن فوق إعدادات مقياس الخلايا التجريبي واختر إعدادات التطبيق لحفظ إعدادات التطبيق .
6. استخدم CD45RA APC لتعديل قيمة التعويض من R718 إلى 15٪ APC. استخدم CD19 BB700 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 24٪ BB700. استخدم CD8 R718 لتعديل قيمة تعويض APC-H7 إلى 60٪ R718.
7. تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي ؛ جمع ما مجموعه 25000 الخلايا الليمفاوية.

6. الاتساق بين النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها على اثنين من أجهزة القياس الخلوي

1. تقييم الاختلافات في المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية بين الأدوات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه (p < 0.05).

النتائج

يوضح الشكل 1 ورقة عمل عالمية لقالب القيمة المستهدفة للخرز اللامع CST. باستخدام مخطط FSC / SSC ، يتم رسم بوابة مضلعة لتحديد حبات CST الساطعة. تم الحصول على مخططات الرسم البياني ل 10 قنوات مضان للخرز اللامع CST: FITC و PE و BB700 و PE-Cy7 و APC و R718 و APC-H7 و BV421 و V500 و BV605. يتم عرض القيمة المستهدفة لكل م...

Discussion

يمكن أن يساعد التنميط المناعي للمجموعات الفرعية من الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي في فهم التغيرات في المناعة التكيفية بوساطة الخلايا بعد التطعيم لدى الأطفال. في التطبيقات السريرية ، تحدث حالات غير متوقعة ، مثل الفشل في اكتشاف العينات في الوقت المناسب أو استبدال مقياس التدفق الخلوي ؛...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube