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Résumé

Ce protocole décrit un modèle d’accumulation de lipofuscine dans des cultures épithéliales de pigment rétinien humain (EPR) hautement différenciées et polarisées et un test de phagocytose du segment externe (SG) amélioré pour détecter la capacité totale de consommation/dégradation de la SG de l’EPR. Ces méthodes surmontent les limites des modèles précédents de lipofuscine et des tests classiques de phagocytose du segment externe par impulsions.

Résumé

La phagocytose quotidienne des segments externes du photorécepteur par l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) contribue à l’accumulation d’un pigment de vieillissement intracellulaire appelé lipofuscine. La toxicité de la lipofuscine est bien établie dans la maladie de Stargardt, la dégénérescence rétinienne héréditaire la plus courante, mais est plus controversée dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de cécité irréversible dans le monde développé. Déterminer la toxicité de la lipofuscine chez l’homme a été difficile, et les modèles animaux de Stargardt ont une toxicité limitée. Ainsi, des modèles in vitro qui imitent l’EPR humain in vivo sont nécessaires pour mieux comprendre la génération, la clairance et la toxicité de la lipofuscine. La majorité des modèles de lipofuscine de culture cellulaire à ce jour ont été dans des lignées cellulaires ou ont impliqué l’alimentation en EPR d’un seul composant du mélange complexe de lipofuscine plutôt que de fragments / pointes de l’ensemble du segment externe du photorécepteur, ce qui génère un modèle lipofuscine plus complet et physiologique. La méthode décrite ici est une méthode pour induire l’accumulation de matériel de type lipofuscine (appelé matériau d’autofluorescence non digestible, ou UAM) dans l’EPR prénatal primaire humain hautement différencié (hfRPE) et l’EPR induite dérivée de cellules souches pluripotentes (CSPi). L’UAM s’est accumulée dans les cultures par des alimentations répétées de fragments de SG traités à la lumière ultraviolette absorbés par l’EPR par phagocytose. Les principales façons dont UAM se rapproche et diffère de la lipofuscine in vivo sont également discutées. Parallèlement à ce modèle d’accumulation de type lipofuscine, des méthodes d’imagerie permettant de distinguer le large spectre d’autofluorescence des granules UAM de la coloration simultanée des anticorps sont introduites. Enfin, pour évaluer l’impact de la MNA sur la capacité de phagocytose de l’EPR, une nouvelle méthode de quantification de l’absorption et de la dégradation des fragments et des pointes du segment externe a été introduite. Appelée « capacité totale de consommation », cette méthode permet de surmonter les erreurs potentielles d’interprétation de la capacité de phagocytose de l’EPR inhérentes aux tests classiques de « chasse au pouls » du segment externe. Les modèles et les techniques présentés ici peuvent être utilisés pour étudier les voies de génération et de clairance de la lipofuscine et la toxicité putative.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) fournit un soutien essentiel pour les photorécepteurs sus-jacents, y compris l’absorption quotidienne et la dégradation des extrémités ou des fragments du segment externe du photorécepteur (dans ce protocole, l’abréviation OS signifie embouts ou fragments OS plutôt que segments externes entiers). Cette absorption quotidienne de l’EPR post-mitotique finit par surcharger la capacité phagolysosomale et conduit à l’accumulation de matériel intracellulaire autofluorescent non digestible, appelé lipofuscine. Fait intéressant, plusieurs études ont également démontré que la lipofuscine RPE peut s’accumuler sans phagocytoseOS 1,2. La lipofuscine a de nombreux composants, y compris des adduits réticulés dérivés des rétinoïdes du cycle visuel, et peut occuper près de 20% du volume des cellules EPR pour les personnes de plus de 80 ans3.

La question de savoir si la lipofuscine est toxique a fait l’objet de vifs débats. La maladie de Stargardt est une dégénérescence autosomique récessive des photorécepteurs et de l’EPR dans laquelle une mutation d’ABCA4 déclenche un traitement incorrect des rétinoïdes du cycle visuel contenus dans les segments externes des photorécepteurs. Un traitement inadéquat des rétinoïdes conduit à une réticulation aberrante et à la formation d’espèces bis-rétinoïdes, y compris le bis-rétinoïde N-rétinylidène-N-rétinyléthanolamine (A2E). Des études ont démontré de multiples mécanismes de toxicité A2E 4,5. La lipofuscine contribue aux signaux d’autofluorescence du fond d’œil lors de l’imagerie clinique, et les patients de Stargardt et les modèles animaux présentent une autofluorescence accrue du fond d’œil avant la dégénérescence rétinienne, suggérant une corrélation entre les niveaux de lipofuscine et la toxicité 6,7. Cependant, avec l’âge, la lipofuscine s’accumule chez tous les humains sans déclencher de dégénérescence de l’EPR. De plus, dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), où la dégénérescence de l’EPR ne survient que chez les patients âgés, les personnes atteintes de formes précoces et intermédiaires de la maladie ont moins de signaux d’autofluorescence du fond d’œil que les humains non malades appariés selon l’âge8. Ces résultats cliniques ont également été vérifiés au niveau histologique 9,10.

Les modèles animaux de l’accumulation de lipofuscine RPE ont également laissé une certaine ambiguïté sur la toxicité de la lipofuscine. La souris knockout ABCA4 ne présente pas de dégénérescence rétinienne sur un fond pigmenté, alors qu’elle le fait sur un fond albinos ou lorsqu’elle est exposée à la lumière bleue11,12. De plus, la toxicité de la lipofuscine dérivée via ABCA4 knockout diffère probablement de la lipofuscine à accumulation plus lente qui se produit avec le vieillissement naturel, comme on le voit dans AMD13.

Les modèles in vitro d’accumulation de lipofuscine offrent une alternative à l’étude des effets de l’accumulation de lipofuscine sur la santé des EPR. De tels modèles permettent de manipuler des composants de lipofuscine, de l’alimentation de composants rétinoïdes simples à l’alimentation de la SG, et permettent d’étudier l’EPR humaine plutôt qu’animale. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs méthodes ont été développées pour modéliser la lipofuscine RPE en culture. Avec d’autres groupes, le groupe du Dr Boulton a nourri quotidiennement la SG bovine pendant une période allant jusqu’à trois mois sur le passage de 4 à 7 cellules primaires humaines EPR provenant de donneurs âgés de 4 à 85 ans14. Alternativement, l’inhibition de l’autophagie a également conduit à l’accumulation de lipofuscine dans les passages 3 à 7 cultures primaires d’EPR humaines15. Cependant, l’inhibition lysosomale sublétale dans des cultures hautement différenciées de RPE prénatale humaine primaire (hfRPE) de passage 1 n’a pas réussi à induire la lipofuscine, même avec l’ajout répété de SG sur une base quotidienne16.

Comme approche plus réductionniste, d’autres ont donné des composants simples de lipofuscine aux cultures, en particulier le bis-rétinoïde A2E 4,17. De telles études sont précieuses en ce qu’elles définissent des mécanismes directs potentiels de toxicité pour les composants individuels de la lipofuscine, impliquant, par exemple, le cholestérol lysosomal et l’homéostasie des céramides18. Dans le même temps, il y a un débat sur la toxicité de l’A2E19, et l’alimenter directement aux cellules contourne la voie typique d’accumulation de lipofuscine, qui implique la phagocytose du système d’exploitation photorécepteur. Dans une tentative d’administrer tous les composants de la lipofuscine aux cultures d’EPR, Boulton et Marshall ont purifié la lipofuscine à partir d’yeux humains et l’ont transmise au passage 4 à 7 cultures humaines primaires d’EPR dérivées de donneurs humains fœtaux et âgés20. Bien qu’innovante, cette méthode représente une source limitée de lipofuscine pour des expériences répétées.

Alors que l’alimentation répétée de cultures OS à RPE produit de la lipofuscine dans de nombreux systèmes, elle ne le fait pas dans les cultures RPE primaires hautement différenciées16. La SG photo-oxydante induit des réactions de réticulation comme la formation de bis-rétinoïdes qui se produit naturellement lors de la formation de lipofuscine in vivo. Cela peut accélérer la formation de granules de type lipofuscine dans les systèmes de culture EPR, même ceux qui sont très différenciés et résistants à l’accumulation de lipofuscine16. Ici, une méthode pour induire l’accumulation de granules de type lipofuscine dans l’hfRPE hautement différencié et l’iPSC-RPE humain est introduite, modifiée à partir du protocole publié par Wihlmark21. Cette méthode a l’avantage d’induire des granules de type lipofuscine utilisant la même source (système d’exploitation photorécepteur) et la même voie (absorption de la SG phagolysosomale) que pour la lipofuscinogenèse in vivo. De plus, il est effectué sur des cultures humaines d’EPR hautement différenciées et validées dans de multiples études pour reproduire l’EPR humaine in vivo22,23,24. Ces granules de type lipofuscine sont appelés matériaux autofluorescents non digestibles (UAM) et fournissent des données et une discussion dans ce protocole comparant UAM à la lipofuscine in vivo. Outre les méthodes de construction et d’évaluation des cultures chargées d’UAM dans l’EPR humaine hautement différenciée, une méthode mise à jour pour évaluer la phagocytose de la SG EPR est également introduite. Plusieurs excellentes méthodes de chasse par impulsions pour quantifier la phagocytose OS ont été introduites, y compris le transfert Western, l’immunocytochimie et FACS25,26,27. Cependant, au début de la chasse au pouls du système d’exploitation, les conditions qui conduisent à une mauvaise adoption de la SG peuvent être confondues avec des conditions qui favorisent la dégradation rapide du système d’exploitation internalisé. La méthode présentée ici mesure la quantité totale de SG introduits qui est entièrement consommée/dégradée par l’EPR (« Capacité de consommation totale »), ce qui aide à éliminer cette ambiguïté. On s’attend à ce que des informations sur la toxicité de la lipofuscine à l’aide de ces protocoles, y compris les effets sur les taux de phagocytose de la SG à l’aide de la méthode de la « capacité totale de consommation », soient utilisées pour faire la lumière sur la toxicité de la lipofuscine in vivo.

Protocole

Le présent protocole concernant l’acquisition et l’utilisation de tissus humains a été examiné et approuvé par le comité d’examen institutionnel de l’Université du Michigan (HUM00105486).

1. Préparation des extrémités et des fragments du segment extérieur photo-oxydés

REMARQUE : Des rétines bovines adaptées à l’obscurité ont été achetées et expédiées sur glace (voir le tableau des matières). À partir de ces rétines, les OS ont été purifiés selon un protocole23 publié précédemment.

  1. Réticulation du segment extérieur avec une lampe UV
    1. Plonger complètement les lames revêtues de polytétrafluoroéthylène (voir le tableau des matières) dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes dans une enceinte de biosécurité pour stériliser les lames. Laisser sécher les lames à l’air libre dans une boîte de culture cellulaire stérile de 100 mm.
    2. Placer chaque lame dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 100 mm et ajouter 200 μL de milieu de culture cellulaire contenant du sérum (quel que soit le milieu généralement utilisé pour les cultures EPR à portée de main) dans chaque rectangle, puis placer une lumière UV portative de 254 nm (voir le tableau des matériaux) sur la boîte de culture cellulaire de 100 mm (sans couvercle) avec l’ampoule directement face à la lame, et exposer pendant 20 min. Les supports spécifiquement utilisés pour cette étude et les numéros de produit spécifiques pour les composants des milieux ont déjà été publiés22,23. Ce média est appelé « média RPE » dans ce protocole.
      REMARQUE: Le traitement UV du support bloque la surface du verre et empêche le système d’exploitation de coller lors des étapes suivantes.
    3. Décongeler les aliquotes congelées de SG à 37 °C (à la main ou au bain-marie). La quantité de système d’exploitation nécessaire dépend de l’application. En général, on peut traiter jusqu’à 500 μL de 2 x 108 OS/mL par rectangle sur la lame.
    4. Une fois décongelé, faire tourner l’OS à 2400 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer immédiatement le surnageant dans l’enceinte de biosécurité à l’aide d’une pipette plutôt que d’un vide pour éviter la perte accidentelle de la pastille.
    5. Remettez délicatement la pastille en suspension avec du PBS stérile.
      REMARQUE: Gardez une trace du volume remis en suspension et de la concentration prévue. p. ex., la remise en suspension de la pastille à partir d’un tube de 1 mL de 1 x 10 8 OS/mL avec 500 μL de PBS donne 2 x 108 OS/mL. Le volume et la concentration maximaux par rectangle sur la lame revêtue de polytétrafluoroéthylène sont de 500 μL de 2 x 108 OS/mL.
    6. Aspirer le média des lames et placer jusqu’à 500 μL de solution PBS 2 x 108 OS/mL sur chaque rectangle de la lame. Placez la lumière UV portative sur la boîte de culture cellulaire (sans couvercle) avec l’ampoule directement face au système d’exploitation. Exposez la solution du système d’exploitation à une lumière de 254 nm pendant 40 min.
      REMARQUE: Pendant l’exposition de 40 minutes, couvrez la lampe UV et le plat avec une serviette ou un tampon absorbant, fermez le châssis de l’armoire de biosécurité et éteignez le ventilateur. Cela empêchera toute évaporation significative de se produire. Si la lampe UV utilisée dans ce protocole n’est pas disponible pour un chercheur, il existe deux alternatives pour s’assurer que la quantité appropriée de réticulation est atteinte. La première consiste à suivre l’exposition quantitative aux UV décrite à l’étape 1.2, soit avec le dispositif décrit à l’étape 1.2, soit avec un autre dispositif pouvant fournir la même exposition radiante quantitative que ledit dispositif en 1.2. Une autre alternative consiste à exposer l’OS à l’irradiation UV pendant un temps qui induit le degré de réticulation sur la coloration de Coomassie observé sur la figure 1C.
    7. Recueillir la solution de PBS OS traitée dans des tubes de microcentrifugation stériles, relaver le rectangle de la lame revêtue avec 200-500 μL de PBS (2-3x) et recueillir chaque lavage dans le tube de microcentrifugeuse. Une fois cela fait, examinez la lame au microscope d’une salle de culture tissulaire pour confirmer que presque tous les systèmes d’exploitation ont été retirés de la lame.
    8. Faire tourner la solution PBS du système d’exploitation à 2400 x g pendant 5 minutes à température ambiante, aspirer le PBS dans l’enceinte de biosécurité à l’aide d’un pipetor et remettre en suspension dans un milieu standard de 500 μL qui sera utilisé pour les cultures d’EPR (p. ex. « milieu EPR » défini à la section 1.1.2). Le volume de remise en suspension peut être ajusté en fonction de la concentration souhaitée de SG photo-oxydé (OxOS).
    9. Placez 10 μL de la suspension dans un nouveau tube à microcentrifugation, diluez 50-100x avec plus de milieux de culture cellulaire et comptez les systèmes d’exploitation avec un hémocytomètre.
    10. En fonction du nombre de SG, diluer la suspension d’OxOS jusqu’à une concentration finale dans le stock. Pour l’alimentation de cultures d’EPR très matures dans des puits trans à 24 puits (surface de 0,33 cm 2; voir le tableau des matériaux), une concentration finale dans le milieu de2 x 107 OS/mL est recommandée.
      1. Pour ce faire, répartir l’OxOS dans des aliquotes de 25 μL à une concentration de 5,6 x 107 OS/mL, en suspension dans des milieux de culture RPE standard. Après avoir décongelé une aliquote de 25 μL, mélanger l’aliquote entière avec 45 μL de milieu de culture RPE standard, en obtenant un volume final de 70 μL et une concentration OS de 2 x 107 OS/mL pour chaque alimentation OxOS Transwell.
    11. Avant d’aliquoter l’OxOS, ajoutez des ligands de transition de phagocytose (protéine S et MFG-E8, voir le tableau des matériaux), qui facilitent l’absorption de la SG et l’accumulation de lipofuscine. Les concentrations de travail des ligands pontants dans un Transwell à 24 puits sont de 4 μg/mL pour la protéine S purifiée humaine et de 1,5 μg/mL pour le MFG-E8 recombinant humain. Ainsi, pour 25 μL d’aliquotes d’OxOS à 5,6 x 107 OS/mL, la concentration stock-mère pour la protéine S est de 11,2 μg/mL, et pour MFG-E8 est de 4,2 μg/mL.
      REMARQUE : Les concentrations de ligands pontants ont été optimisées pour les cultures hfRPE sur des puits trans à 24 puits, avec un nombre approximatif de cellules de 320 000 cellules par puits de 0,33cm2 . Les concentrations de ligands peuvent devoir être ajustées pour d’autres types d’EPR et densités cellulaires, car les ligands présents au-delà de la disponibilité des récepteurs de phagocytose peuvent paradoxalement bloquer l’absorption de la SG28.
    12. Congeler les aliquotes dans de l’azote liquide.
      REMARQUE: Les gels-dégels multiples sont très préjudiciables à l’intégrité du système d’exploitation.
  2. Réticulation du segment externe avec un dispositif de réticulation UV
    REMARQUE : Suivez l’étape 1.1, à l’exception des étapes ci-dessous, qui remplacent les étapes 1.1.2 et 1.1.6, respectivement :
    1. (remplace l’étape 1.1.2) Placez chaque lame dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 100 mm et ajoutez 200 μL de milieu de culture cellulaire contenant du sérum (par exemple, un « média EPR » ou tout autre substitut) dans chaque rectangle, puis placez les lames dans un dispositif de réticulation ultraviolette (voir le tableau des matériaux), en traitant avec des UV de 254 nm à une exposition radiante de 3-6 J/cm2 pour bloquer la surface du verre et empêcher le SG de coller pendant les étapes suivantes.
    2. (remplace l’étape 1.1.6) Aspirer le média des lames et placer jusqu’à 500 μL de 2 x 108 OS/mL dans du PBS stérile sur chaque rectangle de la lame. Placez les lames dans le dispositif de réticulation ultraviolette, réglez l’exposition radiante au traitement au besoin (3-9 J/cm2) et traitez à 254 nm.
      NOTE: L’exposition radiante nécessaire peut être soigneusement déterminée en titrant l’exposition radiante entre 3-9 J/cm2 jusqu’à ce que le degré d’autofluorescence et la réticulation des protéines (comme le montrent les figures 1B et 1C) soient atteintes.
      ATTENTION : La manipulation de la SG à l’extérieur d’une enceinte de biosécurité peut entraîner une contamination. Après l’exposition de la SG au dispositif de réticulation UV, collecter le système d’exploitation avec des pointes de pipette stériles, transférer dans des tubes de microcentrifugation stériles et gérer toutes les étapes ultérieures de la hotte de biosécurité.
  3. Caractérisation de la SG oxydée
    1. Quantifier le spectre d’émission d’autofluorescence par imagerie
      1. Placer 20 à 50 μL de solution mère provenant de SG et d’OxOS non traités dans deux tubes microcentrifugés distincts. Centrifuger à 2400 x g pendant 5 min à température ambiante, remettre en suspension la pastille dans du paraformaldéhyde tamponné (p. ex. PBS) à 4 % et fixer pendant 15 min à température ambiante.
      2. Après la fixation, faire tourner vers le bas comme ci-dessus, laver avec PBS x 2 (filer vers le bas entre les lavages), puis remettre en suspension dans moins de 30 μL de PBS.
      3. Placez quelques microlitres de la remise en suspension sur une lame de microscope, ajoutez un support de montage (voir Tableau des matériaux) et enfin une lamelle de couverture.
      4. Image OxOS sur un microscope confocal (voir Tableau des matériaux).
        REMARQUE: L’autofluorescence OxOS peut être excitée par une large gamme de longueurs d’onde laser, mais une raie laser 405 nm ou 488 nm est généralement utilisée. Les émissions sont également larges, mais une configuration typique de filtre d’excitation/émission GFP/FITC est adéquate pour visualiser l’autofluorescence.
      5. Pour mesurer le spectre d’émission d’OxOS, utilisez le λ-balayage sur un microscope confocal. Les paramètres de balayage λ typiques incluent l’excitation avec 405 nm ou 488 nm, et la détection d’émissions allant de 10 nm décalées vers le rouge de la ligne d’excitation laser jusqu’à environ 800 nm, avec une taille de pas λ de 10 nm. Chaque système de microscopie a ses propres instructions sur la façon d’utiliser le mode λ, et le lecteur doit se référer au manuel pour leur confocale spécifique.
    2. Comme alternative, quantifier l’autofluorescence par cytométrie en flux.
      1. Faire tourner 2 x 10 7 OS non traités et séparément 2 x 107 OxOS dans des tubes à microcentrifugeuses et remettre en suspension dans 1 mL de PBS.
        REMARQUE: La fixation n’est pas nécessaire si la cytométrie en flux est effectuée directement après la décongélation.
      2. Charger des échantillons OS et OxOS non traités sur un cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux). Ajustez la diffusion vers l’avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC) à un écart acceptable dans le graphique de dispersion FSC-SSC. Utilisez le PBS comme contrôle pour exclure toute petite particule contaminante. Notez que les systèmes d’exploitation sont considérablement plus petits que les cellules.
      3. Utilisez le canal FITC standard du cytomètre en flux pour la quantification de l’autofluorescence. Comptez au moins 10 000 événements. Utilisez la valeur de la zone d’impulsion de l’histogramme FITC pour représenter l’intensité de fluorescence.
        REMARQUE : Pour la présente étude, toutes les données sont analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse par cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux), conformément aux instructions du fabricant.
    3. Évaluer le degré de réticulation dans OxOS
      1. Faire tourner 2 x 10 7 OS non traités et séparément 2 x 107 OxOS dans des tubes à microcentrifugation. Retirer le surnageant et lyser directement la pastille en ajoutant 1,2x tampon d’échantillon Laemmli (assez pour couvrir; voir le tableau des matériaux). Vortex, conserver à température ambiante pendant 30 min, tourner vers le bas à température ambiante à température égale ou supérieure à 12000 x g pendant 10 min, et collecter le surnageant.
        NOTE: L’évaluation du degré de réticulation des protéines dans OxOS donne une idée de l’adéquation du traitement UV. Une comparaison est faite entre la SG non traitée et OxOS, et une réticulation adéquate se produit lorsque la bande de rhodopsine monomère qui domine la coloration de Coomassie (Figure 1C, flèche) est juste perceptible, avec l’émergence d’agrégats d’ordre supérieur et un frottis protéique au sommet du gel.
        ATTENTION : Lorsque vous utilisez Sample Buffer pour lyser le système d’exploitation, ne chauffez pas par la suite la solution de lyse, car cela peut déclencher l’agrégation de rhodopsine. Évitez également de refroidir le système d’exploitation lysé jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le stockage, car cela précipiterait le SDS. Les lysats non utilisés peuvent être conservés à -20 °C. En cas de décongélation, assurez-vous que les lysats sont complètement décongelés à température ambiante avant utilisation.
      2. Quantifier la concentration en protéines à l’aide d’un dosage des protéines tolérant aux FDS élevées et aux concentrations réductrices29. Voir le tableau des matériaux pour des suggestions sur les réactifs d’essai protéique appropriés et suivre le protocole du fabricant pour ces réactifs.
      3. Exécutez des échantillons SG et OxOS non traités par électrophorèse SDS-PAGE30 sur un gel à gradient de 4% à 15%, en utilisant un tampon SDS tris-glycine standard. Le gel est appliqué à 80 V jusqu’à ce que les échantillons pénètrent dans la pile, puis à 120 V pendant 50-60 min à température ambiante.
      4. Colorer le gel avec du bleu de Coomassie en utilisant les protocoles standard31. La coloration de Coomassie démontrera l’adéquation de la réticulation induite par le traitement UV.

2. Construction de granules de type lipofuscine (UAM) dans les cultures d’EPR

  1. Alimentation OxOS : quantité, fréquence et phagocytose reliant les ligands
    REMARQUE : L’alimentation se produit sur des cultures humaines d’iPSC-RPE ou d’hfRPE au passage 1, cultivées selon le protocole décrit par le laboratoire Bharti (pour iPSC-RPE)32 ou notre protocole précédemment décrit pour l’hfRPE, adapté du laboratoire Sheldon Miller22,23. Tous les calculs ci-dessous sont basés sur l’alimentation d’OxOS ou d’OS dans un Transwell de 24 puits (6,5 mm de diamètre, 0,33 cm2 de zone de croissance).
    1. Décongeler 25 μL de 5,6 x 107 OxOS/mL à 37 °C et ajouter 45 μL de milieu de culture cellulaire à l’aliquote OxOS, ce qui donne un volume final de 70 μL.
      NOTE: Les aliquotes OxOS préparées à l’étape 1 contiendront des ligands de phagocytose reliant MFG-E8 et Protein S. Cependant, si ces ligands n’ont pas été ajoutés aux aliquotes avant la congélation, ils peuvent être ajoutés à cette étape, garantissant ainsi que la concentration finale des ligands dans les milieux à nourrir les cellules est de 4 μg/mL pour la protéine S et de 1,5 μg/mL pour le MFG-E8. Comme indiqué à l’étape 1.1.11, il peut être nécessaire de modifier les concentrations de ligands pontants pour d’autres types d’EPR ou densités cellulaires.
    2. Retirer le milieu apical de Transwell et ajouter 70 μL de 2 x 107 OxOS/mL avec les ligands de pontage de phagocytose à la chambre apicale. Après 24 h, retirez et remplacez par une nouvelle alimentation OxOS. L’alimentation a lieu quotidiennement pendant les jours de semaine, en sautant les week-ends, jusqu’à ce que 20 tétées soient terminées (~ 1 mois). Changer les milieux de culture cellulaire basolatérale (400-550 μL) 2-3x/semaine.
    3. À la fin de 20 tétées, reprendre les changements normaux de milieu pour le puits.
      REMARQUE: Il faut plusieurs changements de milieux supplémentaires pour éliminer OxOS collant de la surface apicale RPE, de sorte que les expériences avec les cultures chargées d’UAM doivent être effectuées au moins 1 à 2 semaines après la fin des repas d’OxOS.
      ATTENTION: Il est important d’avoir des contrôles appropriés pour l’accumulation d’UAM via les aliments OxOS. Comme les changements quotidiens du milieu peuvent affecter la biologie de l’EPR, les puits témoins suivants sont recommandés : Contrôle 1 : Remplacer le milieu quotidiennement pendant les jours de semaine pour le même nombre d’aliments que le groupe traité par OxOS. Témoin 2 : Nourrir quotidiennement les SG EPR non traitées pendant les jours de semaine à la même concentration et au même volume que les aliments OxOS, pour le même nombre d’aliments.
  2. Surveillance de la santé des cultures chargées de granules de type lipofuscine par résistance électrique trans-épithéliale (TEER) et tests de mort cellulaire
    REMARQUE : Pendant et après l’alimentation d’OxOS, la santé des cultures d’EPR peut être mesurée en évaluant l’intégrité des jonctions serrées de l’EPR et la mort cellulaire. Il a déjà été démontré que l’évaluation de l’intégrité des jonctions serrées, via la mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER), est un marqueur sensible pour la santé cellulaire générale33. Des marqueurs non invasifs plus traditionnels de la mort cellulaire, tels que la libération de lactate déshydrogénase (LDH), peuvent également être utilisés.
    1. Effectuer TEER
      NOTE: TEER est testé avec un compteur de résistance électrique transépithéliale (TEER) et une électrode TEER, généralement en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
      1. Pour stériliser l’électrode TEER, utilisez un essuie-glace imbibé d’éthanol à 70% pour nettoyer l’électrode, puis immergez les extrémités de la sonde d’électrode dans de l’éthanol à 70% pendant 10 min.
      2. Laissez l’électrode sécher complètement, puis immergez-la dans un milieu stérile.
      3. Retirer la sonde du milieu stérile et insérer les deux sondes de l’électrode TEER dans les chambres apicale et basolatérale d’un Transwell en culture; L’extrémité de sonde la plus longue s’insère dans la chambre basolatérale.
        REMARQUE: Il est facile de gratter le fond de la chambre apicale avec l’électrode TEER sans pratique, et un tel grattage modifiera considérablement les lectures TEER car la monocouche RPE confluente est perturbée. Ainsi, il est recommandé aux débutants de s’entraîner sur des Transwell non importants avant de tester sur des cultures expérimentales d’EPR. De plus, après que chaque plaque de cultures d’EPR a été testée, l’expérimentateur doit vérifier tout grattage de la monocouche d’EPR à l’aide d’un microscope de culture tissulaire standard.
      4. Une fois que les sondes apicales et basolatérales sont en place dans le Transwell, appuyez sur le bouton de lecture ou appuyez sur l’interrupteur au pied du compteur pour enregistrer le TEER. Entre les plaques ou les groupes de cellules, laver la sonde de l’électrode avec un milieu stérile. Si l’infection est très préoccupante, stériliser à nouveau entre les plaques.
      5. Calculez TEER en prenant la lecture de résistance du compteur, en soustrayant la valeur d’un Transwell vierge avec un support mais pas de cellules (généralement 100-110 Ω pour un Transwell à 24 puits avec une surface de 0,33 cm2 ), puis en multipliant par la surface du Transwell.
        REMARQUE : Les valeurs TEER doivent être déclarées normalisées à la surface de la cellule. Les valeurs typiques pour des cultures hfRPE saines vont de 350 à 1100 Ωcm2. Les valeurs TEER augmentent à mesure que la température diminue. Ainsi, lors du retrait des cultures d’un incubateur à 37 °C vers une hotte à température ambiante, les valeurs TEER auront tendance à augmenter dans toute la plaque. Pour vous prémunir contre cette variabilité, travaillez rapidement (si vous en avez l’expérience) ou attendez 10 à 15 minutes que la température de la plaque s’équilibre avec la température ambiante.
    2. Effectuer un test de libération de LDH
      REMARQUE : La libération de LDH dans le surnageant de culture cellulaire se produit pendant la mort cellulaire et doit être mesurée à l’aide d’une trousse standard (voir le tableau des matériaux).
      1. Recueillir le surnageant au-dessus des cellules après une incubation de 24 heures et le diluer à 1:100 à l’aide d’un milieu standard.
      2. Induire la libération totale possible de LDH, ce qui est important pour normaliser toutes les valeurs de l’étape 2.2.2.1, en ajoutant 2 μL de triton X-100 à 100% aux 100 μL de milieux apical provenant de cellules témoins dans un Transwell à 24 puits. Après avoir incubé le mélange triton/surnageant cellulaire pendant 15 minutes à 37 °C, mélanger le milieu au-dessus des cellules maintenant lysées et recueillir pour mesurer la libération totale possible de LDH.
      3. Une fois les surnageants collectés, effectuez le test en utilisant les instructions standard du fabricant, en mesurant la luminescence après une incubation de 30 minutes à l’aide de la solution tampon du kit.
        NOTE: Toutes les valeurs de LDH sont normalisées à la quantité totale possible de LDH libérée.
  3. Caractérisation du spectre granulaire de type lipofuscine et composition
    1. Acquisition de quantification et de spectres d’autofluorescence
      1. Fixer les cultures chargées d’UAM avec 4% de PFA à température ambiante pendant 15 min, suivi d’un lavage PBS 5x.
      2. Gardez une petite quantité de PBS dans la chambre apicale, puis retournez le Transwell à l’envers. À l’aide d’un microscope à dissection et d’une lame de rasoir, couper la membrane semi-poreuse du Transwell, en appliquant une force de coupe à la jonction de la membrane et du Transwell.
        REMARQUE: Restez cohérent quant à la proximité de la lèvre du Transwell où la coupe est faite, car la membrane Transwell a tendance à se déformer et à se froisser lorsque les coupes ne sont pas cohérentes.
      3. Une fois la membrane Transwell coupée, placez-la immédiatement sur une lame de microscope à l’aide d’une pince, en prenant soin d’éviter de toucher des parties de la membrane Transwell avec des cellules. Évacuez l’excès de PBS avec un nettoyage de tâche, tout en évitant de toucher les cellules. Ajoutez un support de montage et un bordereau de couverture. Assurez-vous de garder une trace de quel côté du Transwell est « côté droit vers le haut » lorsque vous couvrez le Transwell.
      4. Acquérir l’intensité et les spectres d’autofluorescence en utilisant les mêmes réglages et procédures que les étapes 1.3.1.4 et 1.3.1.5.
        REMARQUE: Lors de l’imagerie UAM, un facteur de confusion important est que les OxOS sont autofluorescents et collent souvent à la surface apicale RPE pendant des jours et parfois même des semaines après la fin de l’alimentation OxOS. Par conséquent, lors de la quantification de l’UAM, une méthode doit être utilisée pour s’assurer que l’autofluorescence mesurée provient de l’UAM et non d’OxOS. La méthode la plus simple consiste à co-colorer les cultures de lipofuscine avec un anticorps de rhodopsine. Par exemple, l’anticorps anti-rhodopsine 4D2 peut être utilisé à une dilution de 1:1000 et avec un protocole standard d’immunocytochimie de fixation de PFA34. L’anticorps secondaire de la rhodopsine devrait être un anticorps conjugué à un colorant rouge lointain (par exemple avec un maximum d’excitation proche de 647 nm), car l’autofluorescence UAM et OxOS a tendance à être la plus faible dans cette longueur d’onde. Les images confocales peuvent ensuite être acquises séquentiellement dans deux canaux, excitant l’autofluorescence UAM et OxOS avec un laser de 405 nm et une émission de 415 nm à 550 nm, tandis que la rhodopsine résiduelle, indiquant OxOS non digérée, peut être excitée avec des paramètres d’imagerie de colorant rouge lointain standard dans un canal séparé. Après l’acquisition, le canal de la rhodopsine peut être utilisé comme masque soustractif dans un programme comme ImageJ pour supprimer l’autofluorescence provenant de l’OxOS collant restant, ne laissant derrière lui que l’autofluorescence UAM à quantifier.
        ATTENTION: Même les systèmes d’exploitation qui ne sont pas photo-oxydés présentent une certaine autofluorescence, et même avec un lavage rigoureux, certains OS et OxOS adhèrent à la surface RPE. Ainsi, sans générer un masque soustractif à l’aide de l’immunomarquage à la rhodopsine, comme suggéré dans la note ci-dessus, il n’est pas possible de quantifier avec précision les niveaux d’autofluorescence UAM dans les cultures nourries avec OxOs ou OS standard.
    2. Effectuer la détection simultanée de granules de type lipofuscine et d’autres marqueurs d’immunofluorescence
      NOTE: Comme détaillé à l’étape 2.3.1, le large spectre d’autofluorescence de la lipofuscine limite les choix pour la co-coloration par fluorescence. Les méthodes suivantes peuvent être envisagées pour faciliter la cocoloration.
      1. Utilisez un fluorophore rouge lointain. L’autofluorescence de la lipofuscine est faible dans le proche infrarouge. Ainsi, l’utilisation d’un colorant rouge lointain pour la détection de fluorescence d’un antigène d’intérêt, combinée à des ajustements minutieux des réglages des canaux sur un microscope confocal, peut généralement distinguer l’autofluorescence de la fluorescence co-colorante.
      2. Profitez de la longue queue d’émission de fluorescence de la lipofuscine.
        REMARQUE: Comme la lipofuscine a un spectre d’émission de fluorescence très large, elle peut souvent être excitée à une longueur d’onde faible nm (par exemple laser 405 nm) et avoir une émission encore détectée dans la partie orange / rouge du spectre (par exemple 585-635nm). Cette combinaison unique de longueurs d’onde d’excitation et d’émission peut souvent être adaptée autour d’un autre fluorophore co-colorant.
        1. Détecter l’antigène d’intérêt à l’aide d’un fluorophore dont l’excitation maximale est d’environ 488 nm, avec une détection d’émission à 500-530 nm. Configurez un canal séparé pour la détection par autofluorescence avec excitation de 405 nm et émission de 585 à 635 nm. Ce deuxième canal ne détectera que l’UAM, tandis que le premier canal détectera l’antigène d’intérêt plus la lipofuscine.
        2. En utilisant un programme gratuit comme ImageJ, utilisez ce deuxième canal UAM uniquement comme masque soustractif pour supprimer le signal UAM du premier canal (qui contient à la fois le signal antigénique et le signal UAM).
      3. Utilisez le démixage spectral. La plupart des microscopes confocaux modernes contiennent une option de démélange spectral. Cela permet d’acquérir le spectre d’un échantillon avec seulement UAM et un autre échantillon avec juste le fluorophore co-colorant d’intérêt. L’échantillon expérimental, qui contient à la fois UAM et le fluorophore co-colorant, peut ensuite être acquis et soumis à des méthodes de démélange linéaire pour calculer quel pourcentage du signal provient de l’autofluorescence par rapport à la co-coloration.
        REMARQUE: Des guides complets sur le démixage spectral sont disponibles avec la plupart des microscopes confocaux modernes.
      4. Utilisez l’imagerie de la durée de vie de fluorescence. Bien que le spectre d’émission entre UAM et un fluorophore co-colorant d’intérêt puisse être similaire, il est probable que leurs durées de vie de fluorescence diffèrent considérablement. En général, l’UAM présente des durées de vie de fluorescence plus courtes que la plupart des fluorophores spécifiques. Avec l’accès à un microscope confocal qui permet une imagerie à vie, on peut porter des signaux de fluorescence pour détecter ceux qui sont plus longs que la durée de vie typique de la lipofuscine.
        REMARQUE: En général, la durée de vie de la fluorescence de contrôle à des signaux de plus de 2 ns réduit considérablement la contamination UAM, bien qu’elle n’élimine pas entièrement le signal.
      5. Utilisation d’un suppresseur d’autofluorescence. Traditionnellement, le noir de Soudan a été utilisé pour éteindre l’autofluorescence avant la coloration par immunofluorescence spécifique35. Plusieurs produits d’autofluorescence disponibles dans le commerce permettent d’améliorer les résultats du Sudan Black, et ces produits sont détaillés dans le tableau des matériaux. La trempe par autofluorescence, bien sûr, détruira la capacité de détecter la lipofuscine.
    3. Déterminer la composition des granules de type lipofuscine
      1. Évaluer les lipides neutres
        1. Fixer l’EPR chargé d’UAM et les puits de contrôle (alimentés en OS non traité) dans 4% PFA à température ambiante pendant 15 min, et laver avec du PBS 5x.
        2. Coloration pour lipides neutres à l’aide de 10 μg/mL de rouge du Nil ou de 3,33 μg/mL de Bodipy 493/503 dans une solution de PBS BSA à 3 % à température ambiante pendant 1 h, suivie d’un lavage au PBS pendant 5 min 3x.
        3. Découpez et montez Transwell comme dans les étapes 2.3.1.2 et 2.3.1.3 et image. En général, utilisez les largeurs de bande d’excitation et d’émission suivantes pour l’imagerie: Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm et Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Évaluer le cholestérol estérifié et non estérifié
        1. Suivez l’étape 2.3.3.1.1
        2. Filipin est un colorant fluorescent qui reconnaît le cholestérol non estérifié, mais pas le cholestérol estérifié36. Ainsi, pour évaluer la quantité de cholestérol total (non estérifié et estérifié) dans l’UAM, prétraiter d’abord l’échantillon avec de la cholestérol estérase pour convertir le cholestérol estérifié en cholestérol non estérifié. Traiter les cellules avec 20 U/mL de cholestérol estérase dans un tampon phosphate de potassium 0,1 M (pH 7,2) (voir le tableau des matières) à 37 °C pendant 3,5 h, suivi d’un lavage au PBS pendant 5 min 3x.
        3. Colorer avec 50 μg/mL de filipine (voir le tableau des matières) dans du PBS à température ambiante pendant 1 h, et laver avec du PBS pendant 5 min 3x. Gardez les échantillons couverts, à l’abri de la lumière, car les photoblanchissages philippins se font facilement.
          NOTE: Si seul le cholestérol non estérifié doit être quantifié, le cholestérol estérase à l’étape 2.3.3.2.2 peut être ignoré. Si la quantité de cholestérol estérifié doit être quantifiée, elle peut être déduite de la différence entre le cholestérol total et le cholestérol non estérifié dans l’échantillon.
        4. Découpez et montez Transwell comme dans les étapes 2.3.1.2 et 2.3.1.3 et image.
          REMARQUE: Lors de l’imagerie de la filipine, il photoblanchit très rapidement. Il faut minimiser l’intensité et la durée de l’excitation, et s’attendre à ce qu’un certain photoblanchiment puisse même se produire en regardant l’échantillon à travers les oculaires. Par conséquent, lors de l’imagerie, il faut : (1) rechercher une zone appropriée à imager en utilisant un canal de fluorescence autre que le canal filipin, (2) imager la filipine sur un microscope à grand champ plutôt que confocal (pour limiter l’intensité de l’exposition à la lumière), et (3) éviter l’imagerie répétée d’une zone. En général, utiliser les largeurs de bande d’excitation et d’émission suivantes pour l’imagerie de la filipine - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Évaluation des effets des granules de type lipofuscine sur la phagocytose de l’EPR : capacité totale de consommation

REMARQUE: La justification de la mesure de la phagocytose de la SG via le protocole OS pulse only ci-dessous est détaillée dans la section des résultats représentatifs. La méthode, appelée « capacité totale de consommation », évite les ambiguïtés sur l’efficacité de la phagocytose qui peuvent émerger avec les tests traditionnels de phagocytose par impulsions OS chase. Les essais sont effectués sur des plaques Transwell à 24 puits en utilisant 50 μL de milieu contenant 4 x 106 OS/mL.

  1. Calculer le nombre de puits nécessaires pour l’expérience, puis décongeler une quantité appropriée de SG ordinaire, faire tourner à 2400 x g pendant 5 minutes à température ambiante et remettre en suspension dans un milieu de culture cellulaire RPE standard à 4 x 106 OS/mL. Ajouter des ligands de pontage pour faciliter les taux de phagocytose.
    REMARQUE : La concentration finale des ligands de pontage dans les milieux à alimenter en cellules est de 4 μg/mL pour la protéine S et de 1,5 μg/mL pour le MFG-E8. Comme indiqué à l’étape 1.1.11, il peut être nécessaire de modifier les concentrations de ligands pontants pour d’autres types d’EPR ou densités cellulaires.
  2. Retirer le milieu apical et ajouter 50 μL 4 x 106 OS/mL, idéalement avec des concentrations appropriées de ligands pontants.
  3. À divers moments après l’ajout de la SG (p. ex. - 0 h, 1 h, 4 h et 24 h), ajouter 16,67 μL 4x tampon d’échantillon Laemmli avec des inhibiteurs de protéase pour lyser les deux cellules et le surnageant sus-jacent contenant la SG. Utilisez une pipette P-200 pour gratter la surface du Transwell, en prenant soin de ne pas percer la membrane Transwell ou détacher la membrane du Transwell, et de recueillir le surnageant cellulaire combiné et le lysat cellulaire ensemble. Tourbillonner, tourner vers le bas et laisser à température ambiante pendant 30 minutes pour une dénaturation complète.
    ATTENTION: Malgré l’utilisation de Sample Buffer pour lyser le système d’exploitation, ne chauffez pas par la suite la solution de lyse, car cela peut déclencher l’agrégation de rhodopsine. Évitez également de refroidir le système d’exploitation lysé jusqu’à ce qu’il soit prêt à être stocké, car cela précipiterait les protéines. Congeler les lysats inutilisés à -20 °C, en s’assurant que les lysats sont totalement décongelés avant utilisation.
  4. Exécutez les lysats sur SDS PAGE en utilisant les mêmes paramètres qu’à l’étape 1.3.3, en chargeant des volumes égaux de lysats par puits. GAPDH, β-actine ou une autre protéine d’entretien devrait être utilisé pour normaliser le nombre de cellules, car les taux de phagocytose dépendent du nombre de cellules.
  5. Sonder les transferts Western avec des anticorps dirigés contre l’extrémité N ou C de la rhodopsine. Utilisez des conditions standard de transfert Western et les dilutions d’anticorps sont énumérées dans le tableau des matières.
    REMARQUE: Sous la bande principale de rhodopsine, il y aura plusieurs fragments de rhodopsine. Ces fragments représentent la rhodopsine partiellement digérée, un processus qui commence avant la fusion du phagosome avec le lysosome32,33. Une augmentation du nombre de fragments de rhodopsine dans l’EPR chargé d’UAM par rapport à l’EPR témoin pourrait indiquer un défaut en aval de la capacité des phagolysosomes, au niveau de la fusion phagosome-lysosome, de l’acidification lysosomale et/ou de la fonction enzymatique dégradante 16,34,35.

Résultats

La configuration pour la photo-oxydation de la SG est illustrée à la figure 1Ai. Les lames revêtues de polytétrafluoroéthylène permettent de charger un grand volume de SG en solution par rectangle ouvert sans se répandre sur le reste de la lame. La lame avec OS est contenue dans une boîte de Petri stérile avec le couvercle enlevé, et une lampe UV est placée sur la lame comme illustré à la figure 1Aii. La lame peut également être placée dans un di...

Discussion

Alors que la lipofuscine RPE a été étudiée pendant des décennies, sa toxicité est débattue 2,9,16,42. Compte tenu de l’ambiguïté sur la toxicité de la lipofuscine à partir de modèles animaux11, les modèles in vitro utilisant l’EPR humaine sont précieux. Une gamme de modèles d’accumulation de lipofuscine in vitro a été décrite, ma...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail est soutenu, en partie, par des subventions de la Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), de Fight for Sight (FFS) et de l’International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. est actuellement soutenu par une subvention K08 du National Eye Institute (EY033420). Aucun fonds fédéral n’a été utilisé pour la recherche sur le THF. Un soutien supplémentaire provient de la James Grosfeld Initiative for Dry AMD et des donateurs privés suivants : Barbara Dunn et Dee & Dickson Brown.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

Références

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