Ottimizzazione della procedura di allevamento delle vespe prive di germi

Riepilogo

Gli embrioni di vespa Nasonia sono stati sezionati dalle pupe Lucillia sericata dopo parassitazione per 12-24 ore e lavati con alcool e soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per ottenere embrioni privi di germi. Dopo aver allevato gli embrioni privi di germi e aver fornito loro il terreno di allevamento di Nasonia per crescere e svilupparsi in vitro, sono stati ottenuti adulti di Nasonia privi di germi.

Abstract

La tecnologia di allevamento asettico è un metodo di coltura di insetti in condizioni sterili o quasi sterili, che può eliminare efficacemente l'influenza di microrganismi esterni sul microbiota degli insetti e quindi promuovere il rapido sviluppo della ricerca sul microbiota degli insetti. Nasonia (genere vespa) è un insetto vespa parassita che ha molti vantaggi, come una breve durata della vita, un'elevata variazione genetica, un funzionamento facile, ecc., Ed è ampiamente usato come sistema modello di insetti. A differenza del trattamento antibiotico, che può solo ridurre il numero di microrganismi negli animali, le tecniche di allevamento asettico possono controllare sia la composizione che la quantità di microrganismi negli animali, facilitando ulteriormente lo studio delle interazioni ospite-microbo. Tuttavia, le versioni precedenti del terreno di allevamento Nasonia (NRM) presentano alcuni difetti e problemi, come un processo di preparazione complesso e dispendioso in termini di tempo, una facile contaminazione da batteri o funghi e un breve tempo di conservazione. Pertanto, questo studio risolve questi problemi ottimizzando gli strumenti utilizzati nel processo di preparazione NRM, le condizioni di stoccaggio e i rapporti dei componenti. Il mezzo ottimizzato potrebbe consentire la conservazione a -20 °C per almeno 3 mesi ed eliminare la possibilità di contaminazione da NRM durante l'alimentazione di vespe sterili. Ciò migliora ulteriormente il tasso di sopravvivenza e il livello di salute della nasonia asettica , che è importante per l'utilizzo della nasonia come modello per la ricerca microbica.

Introduzione

Gli animali privi di germi sono animali che non hanno microrganismi viventi e parassiti rilevabili¹. Gli embrioni privi di germi possono essere ottenuti sezionando la madre in condizioni asettiche e successivamente allevati in sistemi di barriera². Tali animali possono essere utilizzati per studiare gli effetti dei microrganismi sugli animali, come sul microbiota intestinale, sul sistema immunitario e sul metabolismo¹. Con alcuni mezzi tecnici, molti insetti e persino mammiferi possono essere resi sterili ^3,4. Gli animali privi di germi hanno un ruolo unico e sono stati ampiamente utilizzati in vari aspetti della ricerca microbiologica⁵. Ad esempio, l'uso di vespe Nasonia prive di germi ha rivelato che i microrganismi possono aiutare gli ospiti ad adattarsi a nuovi ambienti sotto stress ambientale esogeno a lungo termine ^6,7.

I parassitoidi di Nasonia sono piccole vespe parassite che iniettano le loro uova nelle pupe delle mosche⁴. Ci sono quattro specie conosciute di Nasonia, tra cui Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti e Nasonia oneida ⁸. N. vitripennis può essere trovato in tutto il mondo, mentre le altre tre specie hanno areali limitati in Nord America⁴. Le vespe parassitoidi della Nasonia sono considerate insetti modello ideali a causa delle loro caratteristiche, come la facile coltivazione, il breve ciclo di riproduzione, il genoma sequenziato e la diapausa a lungo termine ^8,9. Possono essere utilizzati per studiare vari aspetti dell'evoluzione degli insetti, della genetica, dello sviluppo, del comportamento e della simbiosi¹⁰. Inoltre, le vespe parassitoidi Nasonia possono anche aiutare a controllare le mosche nocive in agricoltura e malattia¹¹. Il successo della creazione di un sistema di insetti sterili comporta due fasi principali: (1) sterilizzazione degli embrioni e (2) fornitura di cibo sterile alle larve in vitro. Al fine di ottenere cibo sterile, Brucker e Bordenstein 12 hanno sviluppato il terreno di allevamento Nasonia (NRMv1) nel 2012 utilizzando sostanze chimiche come antibiotici, candeggina e siero fetale bovino per uccidere i batteri¹². Tuttavia, il metodo di sterilizzazione chimica ha portato a bassi tassi di sopravvivenza ed eclosion di N. vitripennis¹³. Poi, nel 2016, Shropshire et al. hanno sviluppato NRMv2 utilizzando un metodo di sterilizzazione con filtro invece di un metodo di sterilizzazione chimica per eliminare i pericoli di antibiotici e altre sostanze e hanno ottimizzato il processo di allevamento¹³. Sfortunatamente, questo metodo presenta ancora alcuni svantaggi, come le sfide associate alla preparazione e all'utilizzo del mezzo, nonché i rischi di annegamento, sottoalimentazione o disidratazione per gli embrioni, le larve e le pupe chiuse¹⁴. Wang e Brucker¹⁴ hanno recentemente migliorato i protocolli Nasonia rearing media versione 3 (NRMv3) e GFRv2 (germ-free rearing version 2). Questi miglioramenti hanno ridotto i costi e il consumo dei supporti. Tuttavia, NRMv3 ha un tempo di conservazione molto breve ed è altamente suscettibile alla contaminazione.

Basandosi su NRMv3, il metodo di conservazione dello strumento di preparazione NRM e il rapporto dei nutrienti sono stati ottimizzati in questo studio. Questo perfezionamento metodologico facilita l'utilizzo di N. vitripennis come modello per gli studi sul microbioma. Rispetto all'NRMv3 sviluppato da Wang et al.14, lo strumento migliorato per spremere la spremitura della scarpa di Sarcophaga bullata, una delle materie prime NRM, migliora notevolmente l'efficienza produttiva del fluido tissutale della pupa S. bullata rispetto alla siringa da 60 ml con un foro inferiore utilizzata da Wang et ^al.14. Abbiamo aggiustato il rapporto nutritivo del NRM, che ha portato ad un certo aumento del tasso di sopravvivenza delle vespe Nasonia prive di germi senza influire sul loro tempo di sviluppo. Inoltre, l'NRM è stato confezionato in provette da centrifuga di piccola capacità (1,5 ml) e congelato in un frigorifero a -20 °C per prolungare il tempo di conservazione. Vale la pena notare che mentre abbiamo usato la mosca domestica Lucilia sericata come ospite e fonte per la preparazione NRM, questo protocollo può probabilmente essere adattato per altri ospiti Nasonia disponibili in laboratorio.

Protocollo

1. Preparazione delterreno di allevamento dellaNasonia privo di germi 

1. Posizionare le pupe di L. sericata disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali) su una superficie che possa ospitare tutte le pupe, come un vassoio o un foglio di carta. Scartare eventuali larve sottosviluppate, vecchie pupe scure, gusci vuoti, segatura o altre impurità. Tenere solo le giovani pupe di colore rosso-brunastro e trasferirle in un becher (circa 3.000-4.000 pupe).
   NOTA: Dopo aver condotto molti esperimenti, è stato scoperto che il mezzo ricavato dalle vecchie pupe scure diventava facilmente scuro e fermava lo sviluppo di vespe prive di germi. Questo fenomeno non si è verificato quando si usano le giovani pupe rosso-brunastre per produrre terreno. La ragione di ciò non è ancora chiara e richiede ulteriori indagini per verificarlo.
2. Aggiungere abbastanza acqua deionizzata al becher per coprire l'intera superficie delle pupe. Avvolgere la bocca del becher con carta stagnola o garza, scuotere il becher per pulire le impurità sulla superficie delle pupe, quindi versare l'acqua. Ripeti da tre a cinque volte.
3. Mettere le pupe di L. sericata pulite nel serbatoio del filtro di una pressa per aglio, spremere forte e raccogliere il fluido tissutale delle pupe di L. sericata in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml. Quindi, versare la feccia di pupa e mettere nuove pupe nel serbatoio del filtro della pressa per aglio fino a quando tutti sono schiacciati.
   NOTA: Rispetto al dispositivo di estrusione ad ago utilizzato da Wang et ^al.14, la pressa per aglio è più conveniente e può separare il liquido interstiziale più accuratamente. Questo progresso pone le basi per la produzione su larga scala e lo stoccaggio a lungo termine di NRM.
4. Centrifugare la miscela a 4 °C (25.000 x g) per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, la miscela sarà separata in tre strati dal basso verso l'alto: strato di sedimento, strato proteico e strato di grasso (Figura 1).
5. Per evitare l'intasamento durante la filtrazione, aspirare lo strato proteico utilizzando un ago sterile da 18 G e trasferirlo in una nuova provetta conica sterile in polipropilene da 50 ml.
6. Aggiungere il mezzo di Drosophila liquido commerciale (vedi Tabella dei materiali) all'estratto proteico in rapporto 1: 1.
   NOTA: L. sericata commercializzato più conveniente è stato utilizzato come materia prima ospite e NRM, rispetto a NRMv3. Pertanto, il rapporto nutrizionale è stato regolato da 1: 2 a 1: 1 in base a NRMv3, che era più adatto per la crescita e lo sviluppo della nasonia sterile (Figura 2).
7. Filtrare il mezzo miscelato (terreno di Drosophila ed estratto proteico di L. sericata pupa) utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto con diverse dimensioni dei pori (8, 1,2, 0,8 e 0,45 μm; vedi Tabella dei materiali) per rimuovere particelle di diverse dimensioni. Per evitare l'intasamento, cambiare la carta da filtro quando il flusso rallenta.
   NOTA: Per ogni filtrazione è necessario utilizzare una nuova provetta sterile da centrifuga da 50 ml.
8. Centrifugare nuovamente il liquido a 4 °C (15.000 x g) per 10 minuti e sterilizzare il mezzo surnatante attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm. Ripeti i passaggi precedenti una volta.
9. Conservare il terreno di coltura a -20 °C dopo l'aliquotazione (Figura 3A) per la conservazione a lungo termine.
   NOTA: Per evitare contaminazioni e ripetuti congelamenti e scongelamenti, si raccomanda di aprire ogni tubo di NRM solo una volta quando si utilizza il terreno di coltura dopo il confezionamento (Figura 3A).

2. Raccolta di uova senza germi

1. Per garantire un rapporto maschio / femmina stabile nella prole, porre le pupe in una fiala di Drosophila durante lo stadio pupale con un rapporto di 50 femmine per 15 maschi a causa delle loro caratteristiche genetiche aploidi (i maschi si sviluppano da cellule aploidi, mentre le femmine si sviluppano da cellule diploidi che derivano da uova fecondate)^4,15.
   1. Dopo essere emersi agli adulti, lasciare che i maschi e le femmine si accoppiano per 1,5 giorni, quindi inserire circa 40 L. sericata pupe nella fiala. Entro 12-24 ore dopo la parassitizzazione, utilizzare un ago da dissezione sterile per aprire con attenzione un'estremità del guscio della pupa sotto uno stereomicroscopio (Figura 4).
   2. Tieni l'altra estremità a mano e trova gli embrioni di vespa. Utilizzare un ago da dissezione per trasferire gli embrioni dalla superficie del tessuto della pupa di L. sericata a un filtro a cellule sterili con soluzione salina tamponata fosfato (PBS)¹⁴.
      NOTA: Le vecchie pupe di L. sericata devono essere utilizzate per il parassitismo perché il tessuto secco di L. sericata pupa è più facile da trasferire gli embrioni . Al fine di garantire il regolare trasferimento delle uova dalla superficie del tessuto della pupa di L. sericata , cercare di fare attenzione a non perforare il tessuto quando l'ago dissecante apre la custodia della pupa in modo che il liquido interstiziale non defluisca.
2. Porre 20-30 embrioni su un filtro cellulare e lavarli uniformemente con 1.000 μL di soluzione commerciale di ipoclorito di sodio al 10% (vedere Tabella dei materiali), seguito da un altro lavaggio con 1.000 μL di 1x PBS sterile. Quindi, lavare una volta con 1.000 μL di soluzione di etanolo al 70% e lavare tre volte con 1.000 μL di 1x PBS sterile.
3. Innanzitutto, posizionare un foglio di rete in polipropilene di 5 mm di diametro (vedi Tabella dei materiali) che è stato pre-bagnato con 1x PBS in una piastra da 24 pozzetti. Quindi, utilizzando una piccola spazzola sterilizzata, spazzolare delicatamente gli embrioni di vespa sul filtro cellulare sul foglio di rete di polipropilene. Questo può essere fatto per tutti e quattro i pozzetti in una colonna verticale della piastra a 24 pozzetti.

3. Allevamento di vespe senza germi

1. Aggiungere 50 μL di NRM a ciascun pozzetto in una cappa a flusso laminare. Per mantenere un ambiente umido per la crescita, aggiungere 1 ml di acqua sterile tra ciascun pozzetto nella piastra a 24 pozzetti. Un piccolo becher contenente 30 ml di acqua sterile può anche essere inserito nella scatola di plastica sterile da 5 litri con la piastra a 24 pozzetti.
   1. Durante l'intero esperimento, conservare la scatola di plastica sterile e la piastra a 24 pozzetti in una camera climatica a una temperatura costante di 25 ± 2 °C e sotto luce costante.
2. Prima di trasferire e aggiungere NRM ogni giorno, scongelare l'NRM congelato su un banco a flusso laminare. In un ambiente sterile, utilizzare una pinzetta disinfettata con alcool per trasferire la rete in polipropilene con le larve su di essa da un pozzetto all'altro. Infine, aggiungere 50 μL di NRM che è stato equilibrato a temperatura ambiente (Figura 3B). Ripeti le operazioni di cui sopra ogni giorno fino a quando non si osservano le pupe.
   NOTA: Con lo sviluppo delle vespe, la quantità di NRM dovrebbe essere aumentata in modo appropriato per garantire che le vespe prive di germi abbiano un'alimentazione sufficiente. Ad esempio, le larve del quarto stadio sono state fornite con 60-70 μL di NRM. Poiché diverse fasi di sviluppo possono coesistere nello stesso pozzo, utilizzare una spazzola sterilizzata per trasferire le pupe. Aggiungi una piccola quantità di NRM alle larve rimanenti. Utilizzare tecniche asettiche per evitare l'invasione microbica e l'inquinamento.
3. Dopo aver mangiato per 9-11 giorni, oltre l'80% delle larve si sviluppa in pupe bianche o gialle. A questo punto, spostare il filtro su una piastra pulita e interrompere l'aggiunta di terreno di coltura per attendere l'eclosione.

Risultati

L'efficienza di preparazione di NRM è stata notevolmente migliorata migliorando gli strumenti di preparazione. Inoltre, il problema dell'inquinamento NMR nel processo di alimentazione è stato eliminato ottimizzando la strategia e il metodo di conservazione. Allo stesso tempo, l'NRM aggiustato aveva un rapporto nutrizionale più adatto per la crescita e lo sviluppo di vespe prive di germi con L. sericata come ospiti. Il tasso di sopravvivenza delle vespe prive di germi dalle larve alle pupe è stato significati...

Discussione

Con l'applicazione di tecnologie di rilevamento ad alto rendimento come la genomica e la metabolomica, i ricercatori hanno gradualmente capito che esiste un'enorme diversità genetica e complessità metabolica nel microbiota intestinale¹⁶. Questi batteri simbionti sono strettamente correlati a vari stati fisiologici o patologici, come il metabolismo nutrizionale dell'ospite, i tumori, l'immunità e l'invecchiamento attraverso complesse interazioni con l'ospite¹⁷. Tuttavia, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56