Una procedura controllata dalla stimolazione per la valutazione delle funzioni diastoliche dipendenti dalla frequenza cardiaca in modelli murini di insufficienza cardiaca

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'ottenimento della relazione pressione-volume attraverso la stimolazione transesofagea, che funge da strumento prezioso nella valutazione della funzione diastolica in modelli murini di insufficienza cardiaca.

Abstract

L'insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata (HFpEF) è una condizione caratterizzata da disfunzione diastolica e intolleranza all'esercizio fisico. Mentre i test emodinamici da sforzo o la risonanza magnetica possono essere utilizzati per rilevare la disfunzione diastolica e diagnosticare l'HFpEF nell'uomo, tali modalità sono limitate nella ricerca di base che utilizza modelli murini. Un test da sforzo su tapis roulant è comunemente usato per questo scopo nei topi, ma i suoi risultati possono essere influenzati dal peso corporeo, dalla forza muscolare scheletrica e dallo stato mentale. Qui, descriviamo un protocollo di stimolazione atriale per rilevare i cambiamenti dipendenti dalla frequenza cardiaca (HR) nelle prestazioni diastoliche e convalidare la sua utilità in un modello murino di HFpEF. Il metodo prevede l'anestesia, l'intubazione e l'esecuzione dell'analisi del circuito pressione-volume (PV) in concomitanza con la stimolazione atriale. In questo lavoro, è stato inserito un catetere di conduttanza tramite un approccio apicale ventricolare sinistro e un catetere di stimolazione atriale è stato posizionato nell'esofago. I loop fotovoltaici al basale sono stati raccolti prima che l'HR fosse rallentato con ivabradina. I loop fotovoltaici sono stati raccolti e analizzati con incrementi di FC compresi tra 400 bpm e 700 bpm tramite stimolazione atriale. Utilizzando questo protocollo, abbiamo chiaramente dimostrato la compromissione diastolica HR-dipendente in un modello di HFpEF indotto metabolicamente. Sia la costante di tempo di rilassamento (Tau) che la relazione pressione-volume telediastolica (EDPVR) sono peggiorate con l'aumentare della frequenza cardiaca rispetto ai topi di controllo. In conclusione, questo protocollo controllato dalla stimolazione atriale è utile per rilevare le disfunzioni cardiache HR-dipendenti. Fornisce un nuovo modo per studiare i meccanismi alla base della disfunzione diastolica nei modelli murini di HFpEF e può aiutare a sviluppare nuovi trattamenti per questa condizione.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca rappresenta una delle principali cause di ospedalizzazione e morte in tutto il mondo e l'insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata (HFpEF) rappresenta circa il 50% di tutte le diagnosi di insufficienza cardiaca. L'HFpEF è caratterizzata da disfunzione diastolica e ridotta tolleranza all'esercizio fisico e le anomalie emodinamiche associate, come la disfunzione diastolica, possono essere chiaramente rilevate attraverso test emodinamici da sforzo o scansioni MRI ^1,2.

Nei modelli sperimentali, tuttavia, le modalità disponibili per valutare le anomalie fisiologiche correlate all'HFpEF sono limitate ^3,4. Il test da sforzo su tapis roulant (TMT) viene utilizzato per determinare il tempo di corsa e la distanza, che potrebbero riflettere l'emodinamica cardiaca da sforzo da sforzo; Tuttavia, questo metodo è suscettibile di interferenze da parte di variabili estranee come il peso corporeo, la forza muscolare scheletrica e lo stato mentale.

Per aggirare queste limitazioni, abbiamo ideato un protocollo di stimolazione atriale che rileva cambiamenti sottili ma cruciali nelle prestazioni diastoliche in base alla frequenza cardiaca (FC) e ne abbiamo convalidato l'utilità in un modello murino di HFpEF⁵. Diversi fattori fisiologici contribuiscono alla funzione cardiaca correlata all'esercizio, tra cui la risposta del nervo simpatico e delle catecolamine, la vasodilatazione periferica, la risposta endoteliale e la frequenza cardiaca⁶. Tra questi, tuttavia, la relazione HR-pressione (chiamata anche effetto Bowditch) è nota come determinante critico delle caratteristiche fisiologiche cardiache ^7,8,9.

Il protocollo prevede l'esecuzione di un'analisi pressione-volume convenzionale al basale per valutare la funzione sistolica e diastolica, compresi parametri come la velocità di sviluppo della pressione (dp/dt), la relazione pressione-volume telesistolica (ESPVR) e la relazione pressione-volume telediastolica (EDPVR). Tuttavia, va notato che questi parametri sono influenzati dalla frequenza cardiaca, che può variare tra gli animali a causa delle differenze nella loro frequenza cardiaca intrinseca. Inoltre, dovrebbero essere considerati anche gli effetti dell'anestesia sulla frequenza cardiaca. Per affrontare questo problema, la frequenza cardiaca è stata standardizzata somministrando la stimolazione atriale in concomitanza con ivabradina e le misurazioni dei parametri cardiaci sono state eseguite a frequenze cardiache incrementali. In particolare, la risposta cardiaca dipendente dall'HR ha distinto i topi HFpEF dai topi del gruppo di controllo, mentre non sono state osservate differenze significative nelle misurazioni del loop PV al basale (utilizzando la frequenza cardiaca intrinseca)⁵.

Sebbene questo protocollo di stimolazione possa sembrare relativamente complicato, il suo tasso di successo supera il 90% quando è ben compreso. Questo protocollo fornirebbe un modo utile per studiare i meccanismi alla base della disfunzione diastolica nei modelli murini di HFpEF e aiuterebbe nello sviluppo di nuovi trattamenti per questa condizione.

Protocollo

Questo protocollo sugli animali è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali e ha seguito i regolamenti per gli esperimenti sugli animali e le attività correlate presso l'Università di Tokyo. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57/Bl6J di età compresa tra 8 e 12 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi la tabella dei materiali). Un modello di HFpEF è stato stabilito somministrando una dieta ricca di grassi per 15 settimane in combinazione con l'estere metilico NG-nitro-L-arginina, come descritto in precedenza¹⁰.

1. Preparazione del catetere e calibrazione pressione/volume

1. Posizionare un catetere di conduttanza in soluzione fisiologica normale e collegarlo a un modulo composto da PowerLab 8/35 e da un'unità di pressione-volume (modulo MPVS, vedere la tabella dei materiali).
2. Calibrare elettronicamente la pressione e il volume attraverso la registrazione dei parametri di pressione (0 mmHg e 100 mmHg) e volume predeterminati (che variano tra i moduli MPVS) sul modulo MPVS ^3,11 (vedere anche le istruzioni del produttore).

2. Preparazione di un animale per il cateterismo

1. Anestesia e ventilazione
   1. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di 5 mg/kg di etomidato e 500 mg/kg di uretano (vedere la tabella dei materiali) 5-10 minuti prima dell'intubazione.
      NOTA: L'uretano, sebbene efficace come agente anestetico negli studi sugli animali, è sospettato di essere cancerogeno per l'uomo. Pertanto, quando l'uretano è necessario per il raggiungimento degli obiettivi sperimentali e non sono sufficienti agenti alternativi, deve essere maneggiato con cautela. Sono obbligatorie misure di protezione adeguate, come l'uso di guanti e maschere e l'utilizzo di una cappa aspirante durante la preparazione. Come possibile alternativa, potrebbe essere impiegata la ketamina (80 mg/kg, ip).
   2. Posizionare il topo in una camera di anestesia precedentemente saturata con isoflurano al 2% e trasferire l'animale in un termoforo preriscaldato mantenuto tra 38 °C e 40 °C dopo l'induzione dell'anestesia.
   3. Radere l'area chirurgica. Quindi, disinfettare il sito chirurgico con tre cicli alternati di betadine e alcol.
   4. Praticare un'incisione orizzontale (1-2 cm) nel collo, asportare il muscolo tracheale ed esporre la trachea. Passare una sutura chirurgica di seta 2-0 sotto la trachea, sollevarla e praticare una piccola incisione (1-2 mm) per aprirla.
   5. Inserire un tubo endotracheale nella trachea e collegarlo a un ventilatore che eroga una miscela di ossigeno al 100% e isoflurano al 2% (ridotta allo 0,5% all'1% in seguito).
2. Inserimento del catetere venoso centrale (CV) e iniezione di fluido
   1. Localizzare la vena giugulare interna sotto il muscolo sternocleidomastoideo³.
   2. Inserire il catetere venoso centrale, costituito da un tubo silastico in PE-10 (vedere la tabella dei materiali) collegato a un ago da 30 G, nella vena giugulare.
   3. Somministrare un'infusione in bolo di 5-6 μL/g di peso corporeo al 10% di albumina/NaCl nell'arco di 3 minuti, seguita da una velocità di infusione costante di 5-10 μL/min.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale per prevenire l'ipotensione derivante dalla vasodilatazione periferica causata dall'anestesia. La vena giugulare interna si trova tra il muscolo sternocleidomastoideo e l'arteria carotide e appare di colore più scuro rispetto all'arteria.

3. Procedura chirurgica per cateterismo ventricolare sinistro (approccio a torace aperto)

1. Rasare l'area chirurgica del topo anestetizzato. Quindi, disinfettare il sito chirurgico con tre cicli alternati di betadine e alcol.
2. Confermare la profondità dell'anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi. Quindi, fai un'incisione orizzontale (2-3 cm) sotto il processo xifoideo e separa la pelle dalla parete toracica usando forbici smussate.
3. Tagliare lateralmente la parete toracica su entrambi i lati utilizzando cauterizzazione elettrica (vedere la tabella dei materiali).
4. Esporre il cuore tagliando il diaframma e rimuovere delicatamente il pericardio dal cuore usando una pinza.
5. Inserire un ago da 27 G nell'apice del ventricolo sinistro (LV) e inserire retrogradamente un catetere di conduttanza nel LV attraverso il foro di puntura.
6. Regolare la posizione del catetere in modo da ottenere un circuito pressione-volume di forma quadrata.
7. Verificare che il catetere non entri in contatto con il muscolo papillare quando si verificano cambiamenti nelle condizioni di carico controllando la forma dell'ansa PV durante l'occlusione della vena cava inferiore (IVC).
   NOTA: Un'adeguata esposizione del cuore facilita la procedura e aiuta a ottenere una visione chiara.

4. Registrazione dei dati del circuito fotovoltaico e determinazione della relazione pressione-volume telesistolico (ESPVR) e della relazione pressione-volume telediastolica (EDPVR)

NOTA: La riduzione del precarico mediante occlusione IVC consente la determinazione dell'ESPVR e dell'EDPVR.

1. Registra e analizza il loop pressione-volume (PV) di base con il software LabChart (vedi la Tabella dei Materiali), PowerLab e il modulo MPVS dopo la stabilizzazione del segnale (5-10 minuti dopo la canulazione).
2. Eseguire l'occlusione IVC comprimendo l'IVC con una pinza e registrare l'ansa PV per almeno 20 cicli cardiaci durante l'occlusione IVC. Determinare l'ESPVR inserendo una linea di regressione lineare attraverso i punti terminali sistolici dell'ansa FV e l'EDPVR inserendo una linea curvilinea attraverso i punti diastolici terminali dell'ansa FV utilizzando il software LabChart.
   NOTA: Arrestare il ventilatore durante l'occlusione dell'IVC per prevenire artefatti da movimento polmonare. Un agente paralitico come il pancuronio (0,5-1 mg/kg) può essere utile quando il movimento polmonare è eccessivo e deve essere utilizzato solo dopo aver confermato un piano anestetico stabile.

5. Stimolazione transesofagea

1. Inserire un catetere con elettrodo tetrapolare 2-Fr nell'esofago, collegare il catetere a uno stimolatore di impulsi (vedere la tabella dei materiali) e determinare la soglia di cattura atriale (normalmente, l'ampiezza dello stimolo è di 3 mA e l'ampiezza dell'impulso è di 1 ms).
2. Rallentare la frequenza cardiaca al di sotto di 400 battiti/min utilizzando 20 mg/kg di ivabradina (vedere la tabella dei materiali) somministrata per via intraperitoneale.
3. Dopo la stabilizzazione, acquisire 20 cicli cardiaci continui di loop PV a diverse frequenze di stimolazione da 400 battiti/min a 700 battiti/min, con un incremento di 100 battiti/min; Acquisisci i cicli nell'arco di 5 minuti ad ogni velocità di stimolazione.

6. Calibrazione salina e calibrazione del flusso aortico

1. Inattivare il ventilatore e somministrare 5-10 μL di soluzione salina ipertonica per via endovenosa attraverso il catetere cardiovascolare.
2. Documentare le fluttuazioni di pressione e volume durante l'iniezione salina e calcolare il valore Vp utilizzando PowerLab ^3,11.
3. Ripetere la calibrazione della soluzione salina per migliorare l'accuratezza e la riproducibilità.
4. Ruotare il mouse sul lato sinistro per non disturbare il segnale del volume.
5. Eseguire una toracotomia laterale tra Th3 e Th5 verso la colonna vertebrale e sezionare delicatamente una piccola parte dell'aorta discendente con una pinza.
6. Posizionare una sonda di flusso vascolare (vedere la tabella dei materiali) sopra l'aorta per misurare la gittata cardiaca.
   NOTA: Il calcolo accurato del volume assoluto richiede l'utilizzo di due tipi di calibrazione: calibrazione salina e calibrazione del flusso aortico. È importante riconoscere i potenziali rischi associati a un'infusione salina ipertonica nei soggetti animali, poiché un eccessivo carico di sale può comportare un calo della contrattilità.

7. Eutanasia

1. Dopo lo studio, sopprimere i topi sotto un sovradosaggio di anestetico tramite lussazione cervicale.
   NOTA: Per garantire la completa cessazione della funzione vitale, viene impiegato un metodo secondario di eutanasia, come il dissanguamento in anestesia con successivo prelievo di tessuto cardiaco.

Risultati

I dati del circuito fotovoltaico di base sono visualizzati nella Figura 1 e nella Tabella 1. Al basale (in assenza di stimolazione), non ci sono state differenze significative nei parametri diastolici come la costante di tempo di rilassamento (Tau), la velocità minima di variazione della pressione (dP/dt min) e l'EDPVR tra i topi di controllo e HFpEF. Tuttavia, i topi HFpEF hanno mostrato una pressione sanguigna e un'elastanza arteriosa (Ea) più elevate, come mostrato nell...

Discussione

Presentiamo una metodologia per valutare le relazioni pressione-volume con l'applicazione della stimolazione transesofagea. L'intolleranza all'esercizio fisico è una delle caratteristiche chiave dell'HFpEF, ma non sono disponibili tecniche per la valutazione della funzione cardiaca nei topi durante l'esercizio. Il nostro protocollo di stimolazione offre uno strumento prezioso per rilevare la disfunzione diastolica, che potrebbe non essere evidente in condizioni di riposo.

Per ottenere un circ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk suture, sterlie	Alfresa Pharma Corporation, Osaka, Japan	62-9965-57	Surgical Supplies
2-Fr tetrapolar electrode catheter	Fukuda Denshi, Japan and UNIQUE MEDICAL, Japan	custom-made	Surgical Supplies
Albumin Bovine Serum	Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan	01859-47	Miscellaneous
C57/BI6J mouse	Jackson Laboratory		animals
Conductance catheter	Millar Instruments, Houston, TX	PVR 1035
Electrical cautery, Electrocautery Knife Kit	ellman-Japan,Osaka, Japan	1-1861-21	Surgical Supplies
Etomidate	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	E0897	Anesthetic
Grass Instrument S44G Square Pulse Stimulator	Astro-Med, West Warwick, RI		Pacing equipment
Isoflurane	Viatris Inc., Tokyo, Japan	8803998	Anesthetic
Ivabradine	Tokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokyo Japan	I0847	Miscellaneous
LabChart software	ADInstruments, Sydney, Australia	LabChart 7	Hemodynamic equipment
MPVS Ultra	Millar Instruments, Houston, TX	PL3516B49	Hemodynamic equipment
Pancronium bromide	Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO	15500-66-0	Anesthetic
PE10 polyethylene tube	Bio Research Center  Co. Ltd., Tokyo, Japan	62101010	Surgical Supplies
PowerLab 8/35	ADInstruments, Sydney, Australia	PL3508/P	Hemodynamic equipment
PVR 1035	Millar Instruments, Houston, TX	842-0002	Hemodynamic equipment
Urethane (Ethyl Carbamate)	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	050-05821	Anesthetic
Vascular Flow Probe	Transonic, Ithaca, NY	MA1PRB	Surgical Supplies