Detecção de anticorpos IgG e IgM antirrábicos pelo teste de imunofluorescência indireta da raiva

Resumo

O objetivo deste artigo é examinar o uso do teste de imunofluorescência indireta da raiva para a detecção de anticorpos IgG e IgM específicos para raiva.

Resumo

O teste de imunofluorescência indireta (RIFI) antirrábica foi desenvolvido para detectar vários isotipos de anticorpos específicos contra a raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. Este teste fornece resultados rápidos e pode ser usado para detectar anticorpos antirrábicos em vários cenários diferentes. O teste de IFA antirrábica é especialmente útil para a detecção rápida e precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune em um paciente que desenvolveu raiva. Embora outros métodos para o diagnóstico antemortem da raiva tenham precedência, este teste pode ser utilizado para demonstrar a exposição recente ao vírus rábico através da detecção de anticorpos. O teste de IFA não fornece um título de anticorpos neutralizantes do vírus (VNA), mas a resposta de profilaxia pré-exposição (PrEP) pode ser avaliada através da presença de anticorpos positivos ou negativos. Este teste pode ser utilizado em várias situações e pode fornecer resultados para vários alvos diferentes. Neste estudo, usamos várias amostras de soro pareadas de indivíduos que receberam PrEP e demonstramos sua presença de anticorpos antirrábicos ao longo do tempo usando o teste de RIFI.

Introdução

O teste de anticorpos fluorescentes indiretos (RIFI) antirrábicos é usado para detectar vários isotipos de anticorpos específicos da raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. É um dos muitos testes disponíveis para o acompanhamento de um paciente antirrábico antemortem. É especialmente útil para a detecção precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune de um paciente à infecção por raiva. Quando usado em conjunto com outros testes, história do caso e status de vacinação do paciente, o teste de IFA pode ajudar a determinar a exposição ao vírus da raiva ou a uma vacina¹. Como o teste de RIFI mede IgM e/ou IgG, os valores do anticorpo específico podem indicar um período de tempo aproximado da exposição ao antígeno¹. Esse teste pode ser útil nos aplicativos listados ou em outros ainda não explorados.

Existem vários ensaios sorológicos para raiva disponíveis. O teste rápido de inibição de foco fluorescente (RFFIT), o teste de neutralização do vírus de imunofluorescência (FAVN) ou modificações destes são os principais métodos para medir anticorpos neutralizantes contra o vírus da raiva (RNVR)¹. No entanto, esses testes não diferenciam anticorpos IgM e IgG. Quando diferenciar o isotipo de anticorpos é importante no monitoramento da resposta imune da raiva, os testes de IFA antirrábica e ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) da raiva são usados, mas não medem RVNAs. Embora os testes de RIFI e ELISA possam ser usados para determinar a presença de anticorpos específicos contra a raiva em uma amostra, existem algumas diferenças na forma como são executados. O teste de IFA utiliza um vírus vivo cultivado em células como substrato antigênico, enquanto um ELISA típico para detecção de raiva utiliza uma ou mais proteínas virais. Em um ambiente de laboratório onde o vírus da raiva pode ser cultivado, o teste de IFA pode ser mais facilmente realizado em vez de comprar ou cultivar proteínas virais individuais para o ELISA. A finalidade do teste e as informações obtidas a partir dos resultados de qualquer ensaio sorológico antirrábico devem ser consideradas ao determinar qual escolher².

A IgM é a primeira a responder, aumentando até que a mudança de classe seja observada por volta do 28º dia, quando a IgG se torna o anticorpo circulante predominante³. Assim, a IgM só seria esperada por um período limitado de tempo após a exposição ao vírus da raiva ou à vacinação. O teste do soro e do líquido cefalorraquidiano (LCR) pode indicar se a exposição foi por meio de vacinação, na qual os anticorpos seriam vistos apenas no soro, ou de uma infecção viral, que potencialmente mostraria anticorpos no LCR¹.

Foi estabelecido que os anticorpos antirrábicos persistem por vários anos após a profilaxia pré-exposição (PrEP)⁴. O teste de IFA pode ser uma ferramenta útil para demonstrar isso em diferentes momentos após a vacinação ou exposição.

Protocolo

O seguinte protocolo foi aprovado para o uso ético de amostras humanas pelo New York State Department of Health Wadsworth Center para desenvolvimento de ensaios, número de aprovação do protocolo #03-019.

1. Segurança

1. Use equipamentos de proteção individual (EPIs), no mínimo proteção ocular (óculos ou face shield), máscara cirúrgica e luvas sem látex.
2. Certifique-se de que o pessoal está vacinado contra a raiva e que um título de ≥0,5 UI/mL foi demonstrado nos últimos 6 meses.

2. Preparação da lâmina de antígeno

NOTA: Execute todas as manipulações de vírus, LCR e soro em um gabinete de biossegurança (BSC) usando precauções universais.

1. Preparar 20 mL de neuroblastoma de camundongo ou células BHK-21 para uma concentração de 3,0 x 10⁵ células/mL em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 10% de soro fetal bovino (EGM) e manter frio até o uso.
2. Preparar o vírus CVS-11 diluindo em EGM para uma diluição de trabalho de 1,0 x 10^6,5 50% dose infecciosa de cultura de tecido (TCID₅₀) por mililitro e manter frio até estar pronto para uso.
   NOTA: TCID₅₀ é determinado pelo método de Reed e Muench publicado anteriormente⁵.
3. Limpe uma câmara de lâmina de umidade e lâminas de microscópio revestidas de politetrafluoretileno (PTFE) com etanol 70% e deixe secar ao ar no BSC.
4. Adicione água destilada (dH₂O) a tiras de papel absorvente na câmara deslizante para garantir que a umidade permaneça constante durante todo o procedimento.
5. Usando um lápis, rotule cada slide a ser usado com o número do lote, data, tipo de célula e quaisquer outras informações de identificação necessárias para o armazenamento e coloque na câmara do slide.
   NOTA: A maioria dos marcadores, canetas ou etiquetas não resistirá à futura etapa de fixação da acetona (passo 2.9).
6. Aplicar 50 μL de diluição viral em cada poço nas lâminas do microscópio com uma pipeta de repetição. Em seguida, aplique 50 μL de diluição celular em cada poço, tomando cuidado para não contaminar a ponta da pipeta com o vírus já no poço.
7. Feche a câmara deslizante de umidade e coloque-a na incubadora úmida a 34-36 °C. Avaliar a infectividade celular após 24 h.
   Observação : execute as etapas 2.8-2.12 em apenas um slide.
8. Retire a lâmina da câmara de umidade e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Lave a lâmina em um frasco de Coplin preenchido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 2 minutos e, em seguida, deixe a lâmina secar ao ar.
9. Coloque a lâmina no frasco Coplin e fixe a lâmina em acetona fria por um mínimo de 1 h em um freezer de -20 °C aprovado para materiais inflamáveis. Execute todos os procedimentos de derramamento de acetona e secagem ao ar em uma capela de fumaça.
10. Deixe a acetona piscar e deslize para secar. Aplicar o conjugado de anticorpos fluorescentes diretos (IFD) contra a raiva preparado de acordo com as instruções do fabricante nos poços da lâmina e incubar por 30 min em uma incubadora úmida de 34-36 °C.
11. Lave a lâmina em frascos Coplin de PBS duas vezes por 2 min cada. Seque o escorregador ao ar.
12. Monte uma lamínula com Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M (pH 9,0) e suporte de glicerol a 20% e leia a lâmina usando um microscópio fluorescente em aumento de 200x para avaliar a infectividade. Se as células não estiverem aproximadamente 50% infectadas, repita os passos 2.7-2.12 no dia seguinte até que a infectividade desejada seja atingida.
    NOTA: A infectividade celular é aproximada com base na avaliação visual da proporção de células negativas para células positivas para raiva no poço da lâmina. As células negativas aparecem na cor vermelha, enquanto as células positivas mostram coloração fluorescente verde.
13. Remova as lâminas restantes da incubadora e da câmara de umidade. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante de cada poço e, em seguida, colocar as lâminas em um frasco Coplin com PBS por 1-2 min. Seque as lâminas ao ar por aproximadamente 30 min. Conservar as lâminas a -80 °C até estarem prontas a utilizar.

3. Preparo da amostra

1. Preparar diluições de amostras de soro ou LCR do paciente para teste. Preparar o conjugado necessário para uma concentração de trabalho adequada diluída em PBS com 0,05% de azul de Evans.
   NOTA: Mantenha o conjugado no escuro para manter a integridade do fluoróforo antes da aplicação

4. Procedimento IFA

1. Remova o número necessário de lâminas de antígeno preparadas necessárias para cada ensaio e deixe as lâminas descongelarem e secarem completamente.
2. Coloque as lâminas em um (s) frascos Coplin e fixe as lâminas em acetona fria por entre 2 h a pernoite em um freezer de -20 °C aprovado para materiais inflamáveis. Retire as lâminas da acetona e deixe secar ao ar.
3. Coloque as lâminas em uma caixa de câmara de umidade dentro do BSC com tiras absorventes embebidas em dH₂O para manter a umidade. Aplicar 50 μL de cada diluição da amostra, amostra de controle ou PBS no poço pré-determinado.
   NOTA: Cada lâmina deve conter um número apropriado de poços de amostra do paciente, controle positivo, controle negativo e poço de controle celular PBS.
4. Coloque a câmara deslizante de umidade fechada em uma incubadora úmida de 37 °C, 5% CO₂ . Incube as lâminas por 30 min, retire a câmara de deslizamento de umidade da incubadora e coloque-a em um BSC.
5. Use uma ponta aspiradora para aspirar cuidadosamente o sobrenadante de cada poço, garantindo que não perturbe a monocamada celular. Use uma pipeta conta-gotas estéril para aplicar uma gota de PBS em cada poço.
6. Repita a aspiração cuidadosa, em seguida, coloque cada lâmina em um frasco Coplin cheio de PBS e lave duas vezes por um total de 15 min.
7. Coloque as lâminas de volta na caixa da câmara de umidade e aplique 50 μL de conjugado de anticorpos anti-humanos apropriados em cada poço. Repita as etapas 4.4 a 4.6.
8. Deixe as lâminas secarem ao ar, monte uma tampa com mídia de montagem e leia as lâminas sob microscópio fluorescente.

5. Análise de slides

1. Amostras de grau com base no padrão de coloração e intensidade de fluorescência em comparação com amostras de controle positivas com alto título de anticorpos antirrábicos confirmado.
2. Classificar as amostras em uma escala negativa, 1+, 2+, 3+ e 4+, com um resultado negativo mostrando ausência de coloração fluorescente e 4+ representando uma fluorescência de cor verde brilhante da maçã com um padrão de coloração semelhante às amostras controle positivas¹.
   NOTA: A cor verde da maçã aplica-se apenas aos anticorpos marcados com FITC; A cor varia dependendo da seleção de fluoróforos.
3. Atribua às amostras um valor de ponto final representado pelo fator de diluição no qual a amostra exibe uma classe 1-2+. Ensaiar as amostras com um factor de diluição mais elevado se o ponto final não for atingido no ensaio inicial.

Resultados

Todas as amostras de soro foram coletadas dos pacientes aproximadamente nos mesmos períodos de tempo após a PrEP. As amostras foram testadas de cinco pacientes diferentes nos seguintes momentos: 2 semanas após a inoculação final da vacina antirrábica, 6 meses após a série de vacinas antirrábicas e 18 meses após a série de vacinas antirrábicas. Cada amostra de soro foi diluída em série e graduada para presença de IgM e IgG, conforme descrito nas etapas 5.2 e 5.3 do protocolo. O valor de anticorpos atribuíd...

Discussão

O teste de IFA aproveita um complexo antígeno-anticorpo, permitindo um local de marcação para visualizar anticorpos específicos da raiva. Células de neuroblastoma ou BHK são semeadas em lâminas de microscópio revestidas com PTFE multipoço e inoculadas com a cepa CVS-11 de laboratório do vírus da raiva. Uma vez confluente a monocamada e atingida a infectividade desejada de aproximadamente 50%, as lâminas são armazenadas até ficarem prontas para uso⁶.

O soro...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM