En anpassad optisk densitetsbaserad mikroplattanalys för att karakterisera aktinobakteriofaginfektion

Summary

En optisk densitetsbaserad mikroplattmetod beskrivs för att kvantifiera långsiktig bakterietillväxt i närvaro av bakteriofager, lämpliga för aktinomyceter och andra långsamt växande bakterier. Denna metod inkluderar modifieringar för att minska avdunstning och lockkondensation och R-kod för att beräkna virusinfektionsmått, inklusive arean under kurvan, tillväxtmaximum och relativ virulens.

Abstract

Bakteriofager är en viktig del av naturliga miljöer, och de har en kraftfull förmåga att forma bakteriepopulationer. För att förstå hur enskilda fager interagerar med långsamt växande bakterievärdar som aktinomyceter behövs en enkel och pålitlig metod för att kvantifiera långsiktig bakterietillväxt i närvaro av fager. Spektrofotometriska mikroplattläsare möjliggör upprepade mätningar med hög genomströmning, men inkubation av en liten volym under en längre tid kan ge tekniska utmaningar. Denna procedur anpassar en standard 96-brunns mikroplatta för att möjliggöra samodling av fager och bakterier utan delprovtagning i 96 timmar, med bakterietillväxten registrerad var 8: e timme med spektrofotometriska absorbansvärden. Dessa optiska densitetsvärden analyseras med R för att ge infektionsmått, inklusive procentuell tillväxthämning, relativ virulens och Stacy-Ceballos-indexet. Metoderna som beskrivs här ger ett effektivt sätt att genomföra och analysera experiment med mikroplattans tillväxtkurva med förlängd varaktighet och inkluderar modifieringar för att minska avdunstning och lockkondensation. Dessa protokoll underlättar mikroplattbaserade analyser av interaktioner mellan långsamt växande bakterievärdar och deras bakteriofager.

Introduction

Bakteriofager eller fager är virus som infekterar bakterier. De är de mest talrika biologiska enheterna på planeten¹, och det är allmänt accepterat att bakteriofager påverkar bakteriell utveckling och ekosystemprocesser ^2,3,4. Flera metoder finns för att beskriva, mäta och analysera bakteriofagvärdområde 8 och infektionsdynamik^5,6, inklusive agarbaserade metoder såsom dubbelskiktagarmetoden⁷ och optiska densitetsbaserade mikroplattmetoder^8,9,10,11,12. Varje metod har sina egna fördelar och nackdelar. På grund av deras effektivitet är pläteringstester med dubbelskiktagarmetoden "guldstandarden" för värdområdesanalyser, men denna metod är tids- och arbetsintensiv⁹. Snabba mikroplattmetoder, som returnerar resultat inom 24 timmar eller mindre, ger utmärkta resultat för snabbväxande bakterievärdar som Escherichia coli 9,10,11,12 men är för korta för att visa bakteriofaginfektionsprogression i långsammare växande bakterievärdar som aktinomyceter^7,13,14,15.

En optisk densitetsbaserad mikroplattanalys utformad för snabbväxande bakterier kan inte köras under de flera dagar som krävs för att karakterisera infektionsdynamiken i en långsamt växande värdbakterie utan att avdunstning inträffar och ger artificiellt höga bakterietätheter. För att erhålla jämförbara data med hög genomströmning om bakteriofaginfektionsdynamik för långsamt växande bakteriearter krävs således specialiserade tekniker anpassade för dessa bakterier.

Mikroplattmetoden som presenteras här minskar avdunstningen, vilket gör att långsamt växande bakterier kan samodlas med en under en förlängd 96-timmarsperiod och möjliggöra undersökningar av faginfektionsdynamik och värdområde. Denna metod visar också Stacy-Ceballos index¹⁶, ett optiskt densitetsbaserat mått som möjliggör virulensjämförelser mellan olika värdvirussystem.

Protocol

Även om detta protokoll är skrivet för Gordonia terrae, har det också framgångsrikt använts för Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta och Gordonia westfalica.

1. Beredning av bakterier

1. Använd god mikrobiologisk praxis¹⁷ i ett biosäkerhetsskåp för att inokulera en enda koloni av Gordonia terrae CAG3 i en 1 L steril förbryllad kolv med 200 ml peptonjästkalciumbuljong¹⁸ (PYCa) innehållande 0,01 mg/ml cykloheximid (se materialtabellen).
2. Inkubera kolven vid 30 °C genom skakning vid 250 rpm tills kulturen är mättad eller i 3 dagar⁷.
3. Späd den mättade G. terrae-kulturen seriellt i PYCa-buljong och sprid plattan 100 μL var och en av 10-4, 10-5 och 10-6 utspädningarna på ^{PYCa-plattorna 19,20}. Kyl den outspädda mättade kulturen vid 4 °C.
4. Inkubera de spridda plattorna upp och ned i 3 dagar vid 30 °C.
5. Efter inkubation, identifiera en "räknebar platta", en platta med 20-200 kolonier. Räkna antalet kolonier på plattan och beräkna de kolonibildande enheterna per milliliter (cfu/ml)^19,20.
6. Späd den mättade kulturen med PYCa-buljong till 4,0 x 10⁶ cfu / ml bakterier.

2. Fagberedning

OBS: De representativa resultaten som rapporterades erhölls med Gordonia-fagen DelRio²¹, en tempererad bakteriofag isolerad på G. terrae. Dessa metoder har också framgångsrikt använts med andra Gordonia-fager .

1. Börja med en isolerad bakteriofag, späd seriellt fagprovet i fagbuffert⁷ till en 1 x ^10-8 utspädning. Utför en dubbelskikts agarfagtiteranalys⁷ genom att infektera 0,3 ml av den mättade G. terrae-kulturen med 10 μL av varje fagutspädning. Efter en 5-10 min rumstemperaturinkubation, kombinera bakteriefagblandningen med 3 ml PYCa-toppagar och häll på PYCa-agarplattorna.
2. Inkubera plattorna upp och ned vid 30 °C i 3 dagar eller tills plack bildar⁷.
3. Efter inkubation, identifiera en "räknebar platta", en platta med 20-200 plack. Räkna antalet plack på plattan och beräkna plackbildande enheter per milliliter (pfu / ml)⁷.

3. Förberedelse av mikroplatta

OBS: Flatbottnade 96-brunns mikroplattor (se materialtabellen) bör användas för denna metod. All plåtberedning och lastning måste utföras i ett biosäkerhetsskåp, och god mikrobiologisk praxis¹⁷bör användas.

1. Bered den imfria lockbeläggningslösningen genom att kombinera 100 μL Triton-X 100, 40 ml 100% isopropanol och 160 ml avjoniserat vatten²². Rör om för att blanda och förvara vid rumstemperatur.
2. I ett biosäkerhetsskåp, tillsätt 6 ml lockbeläggningslösning på insidan av ett sterilt 96-brunns mikroplattlock, håll locket i kanterna och rotera det för att säkerställa att det täcks av lösningen. Låt lösningen sitta på locket i 20 sekunder, häll sedan av lösningen och vänd locket på en autoklaverad pappershandduk i en vinkel tills locket är helt torrt, vilket vanligtvis tar 35-45 minuter. Var noga med att hålla locket i kanterna.
3. Förbered 20 ml 0,1% agaros i vatten för varje 96-brunns mikroplatta, mikrovågsugn för att smälta agarosen.
4. När agarosen har svalnat till 50–60 °C pipett 100 μl av 0,1 % agaros i alla utrymmen mellan plattans brunnar och 200 μl agaros i brunnarna i rad A och rad H och kolumn 1, kolumn 2, kolumn 11 och kolumn 12²³ (figur 1).

4. Ladda plattan med bakterier och

OBS: All plåtberedning och laddning måste slutföras i ett biosäkerhetsskåp, och god mikrobiologisk praxis¹⁷ bör användas.

1. Plattan med 96 brunnar kommer att innehålla 75 μL 2,0 x 10⁶ cfu/ml bakterier i varje brunn⁹. Späd bakteriekulturen 4,0 x 10 6 cfu / ml 1: 1 med 2x PYCa-buljong till 2,0 x 10⁶ cfu / ml. Förbered 5 ml per 96-brunnsplatta.
2. Späd faglysatet med fagbuffert⁷ för att göra 1 ml vardera av 2,0 x 10⁶ pfu / ml, 2,0 x 10⁵ pfu / ml och 2,0 x 10⁴ pfu / ml koncentrationer. Detta möjliggör en multiplicitet av infektion (MOI) på 1, 0,1 och 0,01 inom mikroplattan⁹.
3. För att ladda mikroplattan, ta en platta som beretts med antidimlösning och agaros och pipettera 75 μL av 2,0 x 10⁶ cfu / ml bakterier i kolumnerna 3-10, enligt figur 1.
4. Till kolumn 3 och kolumn 4, tillsätt 75 μl steril fagbuffert till varje brunn för att fungera som en positiv kontroll utan, enligt figur 1, och pipettera upp och ner för att blanda efter varje tillsats. Tillsätt 75 μl av fagen 2,0 x 10 6 pfu/ml till kolumn 5 och kolumn⁶ , 75 μl av fagen 2,0 x 10⁵ pfu/ml till kolumn 7 och kolumn 8 och 75 μl av fagen 2,0 x 10⁴ pfu/ml till kolumn 9 och kolumn 10, pipettera upp och ner för att blanda efter varje tillsats.
5. Tejpa båda kortsidorna av plattan med 0,5 i märkningstejp för att delvis täta plattan samtidigt som gasutbyte tillåts.

5. Inkubations- och absorbansmätning

1. När plattorna är laddade med bakterier och, placera dem på en mikroplattskakare vid 250 rpm och inkubera vid 30 °C.
2. Inkubera plattorna i 96 timmar med en optisk densitetsmätning vid 600 nm på en mikroplattläsare var 8:e timme med början vid timme 16. Sätt tillbaka plattorna i skakapparaten mellan mätningarna.
   OBS: Mätperioder på 4, h 6 h, 8 h och 12 h bedömdes, med början vid timme 0, och det bestämdes att en provtagningsperiod på 8 timmar som började vid 16 timmar efter infektion bäst fångade Gordonia-faginteraktionerna.
3. Övervaka locket för kondens under hela experimentet. Om kondens observeras, byt ut locket mot ett annat lock som är belagt enligt steg 3.2.
4. Generera kontroll- och infekterade tillväxtkurvor enligt protokollavsnitt 6.

6. Analys av data

1. Använd ett kalkylprogram för att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för varje fagutspädning, enligt kalkylbladslayouten i Stacy-Ceballos-Index GitHub-arkivet (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
2. Skapa kontroll- och infekterade tillväxtkurvor och beräkna infektionsmått med R (se materialtabellen) med paketen DescTools 24, dplyr 25, ggplot2²⁶ och readxl²⁷ och följ R-skriptet i Stacy-Ceballos-Index GitHub-lagringsplatsen (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
   1. AUC_con är arean under den oinfekterade kontrollkurvan, medan AUC_inf är arean under den infekterade kurvan¹⁶. Beräkna AUC och beräkna sedan procentuell tillväxthämning baserat på arean under kurvvärdena, PI_AUC¹⁶, med hjälp av följande ekvation:
      (1 - [AUC_inf/AUC_con]) × 100
   2. De streckade horisontella linjerna på varje kurva visar topptillväxten, med den oinfekterade tillväxttoppen märkt N asymptote (con) och den infekterade tillväxttoppen märkt N_{asymptote (inf).} Identifiera_{N-asymptotvärdena} och beräkna sedan procentuell tillväxthämning baserat på dessa topptillväxtvärden, PI_max¹⁶, med hjälp av följande ekvation:
      (1 - [N asymptote(inf)/ N_{asymptote(con})]₎ × 100
   3. Beräkna Stacy-Ceballos-indexet, I_SC¹⁶, från PI_AUC och PI_max-värdena enligt följande:
      (PI_AUC ×_{PI max}) ^0.5
      Beräkna relativ virulens genom att integrera Stacy-Ceballos index över tid¹⁶.

Discussion

Denna optiska densitetsbaserade mikroplattmetod möjliggör undersökning av bakteriofagvärdområde och infektionsdynamik¹¹ och visar användbarheten av Stacy-Ceballos index¹⁶ som ett mått på bakteriofagvirulens. Även om denna metod kan användas med vilket bakteriofagvärdsystem som helst, utformades den speciellt för att anpassa snabba mikroplatttillväxtanalyser 9,10,11 för användning med långsammare växande bakterier såsom aktinomyceter. Snabba mikroplattanalyser kan inte användas för långsamt växande bakterier utan modifieringar för att hantera avdunstning och lockkondensation. Denna metod beskriver dessa nödvändiga modifieringar och demonstrerar för första gången användningen av Stacy-Ceballos-indexet och relaterade mätvärden¹⁶ för att beskriva bakteriofaginfektion.

Avdunstning kan vara en betydande utmaning i flerdagars 96-brunns platttillväxtkurvanalyser; Denna metod löser det problemet genom att lägga till agaros till gränsbrunnarna och utrymmena mellan brunnarna. Agarosmarginalen, i kombination med imskyddslockets behandling²², ger den nödvändiga fuktigheten i mikroplattan och möjliggör tillförlitliga optiska densitetsmätningar. Utan den extra fuktigheten sker betydande kanteffektavdunstning²³ under den långa inkubationsperiod som krävs, vilket leder till artificiellt höga optiska densitetsavläsningar. Anti-dimma lockbehandling är en nödvändig modifiering eftersom lockkondensation också artificiellt kan höja de optiska densitetsvärdena. Att skaka plattorna under inkubationsperioden är en rekommenderad modifiering, eftersom aktinomycetebakterier kan klumpa sig under tillväxt, vilket ger artificiellt höga optiska densitetsvärden och effektivt minskar infektionsmångfalden.

Förhållandet mellan bakterier och i experiment som karakteriserar infektionsdynamik är kritiskt, eftersom det måste finnas tillräckligt med för att visa en infektionseffekt men inte så många att värdbakteriepopulationen omedelbart kraschar⁹ eller frekvensen av lysogeni ökar dramatiskt²⁸. I denna metod var det förhållande som befanns vara mest effektivt för att erhålla konsekventa resultat en MOI på 1, men användbara resultat erhölls också med MOI på 0,1 och 0,01. Vid implementering av denna metod rekommenderas att välja en koncentration av bakterier och testa flera fagkoncentrationer i MOI-intervallet 0,01-1 9,10,11.

Denna teknik som beskrivs här gör det möjligt att bedöma bakteriofag-värdinteraktioner för långsamt växande bakterier i mikroplattanalyser med hög kapacitet snarare än med delprovtagning från en större odlingskolv vid varje mätintervall²⁹. Vidare, genom att visa hur mikroplatttillväxtanalyser 9,10,11 kan anpassas, ökar denna teknik användbarheten av andra mikroplattbaserade bakteriofaganalyser för långsammare växande bakterier, inklusive fagkarakterisering^5,6,12 och evolutionsstudier ^30,31. Slutligen demonstrerar denna metod användningen av Stacy-Ceballos index¹⁶ för att beskriva bakteriofaginfektion. Detta mått utvecklades ursprungligen med data från ett arkealt virusmodellsystem och beräknas från optiska densitetsvärden, vilket ger det utbredd användbarhet över olika virussystem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Omni-Pur	2090	for filling border wells of microplate
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch	Corning	3931	replacement microplate lid
Isopropanol	Fisher Chemical	A461-4	for lid coating
Microplate reader	Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform	Thermo Fisher Scientific	88-861-023	to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well	Falcon (a Corning Brand)	351172	microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth	Homemade, from Reference 16		1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose
Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer	Homemade, from Reference 7		10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O
R software	https://www.r-project.org/	version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure	Thermo Fisher Scientific	4116-1000	for bacterial culture
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	for lid coating