Crioconservazione e valutazione bioenergetica delle cellule mononucleate del sangue periferico umano

Riepilogo

Le cellule mononucleate isolate del sangue periferico possono essere utilizzate per l'analisi delle funzioni e dei disturbi immunitari, delle malattie metaboliche o delle funzioni mitocondriali. In questo lavoro, descriviamo un metodo standardizzato per la preparazione di PBMC da sangue intero e la successiva crioconservazione. La crioconservazione rende questo tempo e questo luogo indipendenti.

Abstract

Le funzioni fisiologiche delle cellule eucariotiche si basano sull'energia fornita principalmente dai mitocondri. La disfunzione mitocondriale è legata alle malattie metaboliche e all'invecchiamento. La fosforilazione ossidativa gioca un ruolo decisivo, in quanto è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi energetica. Le PBMC sono state identificate come un campione minimamente invasivo per misurare la funzione mitocondriale e hanno dimostrato di riflettere le condizioni della malattia. Tuttavia, la misurazione della funzione bioenergetica mitocondriale può essere limitata da diversi fattori nei campioni umani. I limiti sono la quantità di campioni prelevati, il tempo di campionamento, che spesso è distribuito su più giorni, e le posizioni. La crioconservazione dei campioni raccolti può garantire una raccolta e una misurazione coerenti dei campioni. È necessario prestare attenzione per garantire che i parametri misurati siano comparabili tra le cellule crioconservate e quelle appena preparate. Qui, descriviamo i metodi per isolare e crioconservare le PBMC da campioni di sangue umano per analizzare la funzione bioenergetica dei mitocondri in queste cellule. Le PBMC crioconservate secondo il protocollo qui descritto mostrano solo lievi differenze nel numero di cellule e nella vitalità, nei livelli di adenosina trifosfato e nell'attività della catena respiratoria misurata rispetto alle cellule appena raccolte. Per i preparati descritti sono necessari solo 8-24 ml di sangue umano, il che consente di raccogliere campioni durante gli studi clinici in modo multicentralizzato e di determinarne la bioenergetica in loco.

Introduzione

Le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono utilizzate per varie applicazioni in molti campi scientifici, tra cui lo studio di problematiche immunologiche e bioenergetiche, come quelle legate ai processi di invecchiamento o alle malattie degenerative ^1,2. Le PBMC hanno una composizione eterogenea e sono costituite da linfociti (cellule B, cellule T e cellule NK), monociti e cellule dendritiche. Le cellule a volte mostrano grandi differenze e variazioni individuali all'interno di un soggetto, quindi sono necessarie procedure standardizzate per la gestione di queste cellule. Parametri importanti come la vitalità e la purezza dell'isolamento sono i requisiti di base per la sua manipolazione e sono inoltre influenzati da fattori ambientali come l'ora di raccolta, il livello di melatonina, se il soggetto è a digiuno e altri ^3,4.

Sulla base di studi sulla bioenergetica delle PBMC, descriviamo qui un metodo per l'isolamento, la crioconservazione e la coltivazione delle PBMC che è adatto anche ad altri metodi. Mentre la biopsia muscolare è considerata il gold standard per il metabolismo energetico mitocondriale⁵, l'esame delle cellule del sangue è una procedura rapida e minimamente invasiva. Oltre a questo, sempre più studi suggeriscono che i cambiamenti nella funzione mitocondriale nell'invecchiamento e nella malattia di Alzheimer (AD) si verificano non solo nel cervello ma anche nella periferia 6,7,8,9,10. Il metodo consente anche di indagare altre condizioni e malattie, tra cui il diabete mellito e l'obesità 11,12,13. Possono essere analizzati i modelli di espressione genica nei pazienti affetti da sclerosi multipla, o la funzione immunitaria e le influenze su di essa in generale 14,15,16.

Le PBMC si basano generalmente sulla fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per generare adenosina trifosfato (ATP)^17,18. Pertanto, le PBMC coprono un'ampia gamma di applicazioni come surrogati. In precedenti rapporti, il metabolismo energetico delle PBMC è stato utilizzato per affrontare le disfunzioni d'organo, come nell'insufficienza cardiaca precoce¹⁹, nello shock settico²⁰ o nelle differenze associate al sesso⁴ nella funzione mitocondriale. Un metodo generalizzato per la crioconservazione, l'isolamento e la coltivazione di PBMC avrebbe vantaggi nella comparabilità dei risultati ottenuti in diversi istituti. C'è una grande variazione nei protocolli per ogni fase^21,22, l'obiettivo di questo metodo è quello di fornire una linea guida per le misurazioni bioenergetiche nelle PBMC.

In questo articolo descriviamo un metodo per misurare i parametri bioenergetici nelle PBMC. Spieghiamo i metodi per isolare, crioconservare e misurare la bioenergetica delle PBMC dal sangue umano. Questo metodo può essere utilizzato per determinare i parametri bioenergetici nei pazienti e valutarli in un contesto clinico. Per applicare queste misurazioni, i ricercatori hanno bisogno di accedere a una popolazione di pazienti da cui è possibile ottenere campioni di sangue fresco.

Protocollo

Tutti i protocolli descritti in questo manoscritto per la raccolta, l'isolamento e l'analisi del sangue sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Giessen, in Germania. È stato ottenuto il consenso dei pazienti per includere i loro campioni nello studio. Tutte le fasi per l'isolamento e la coltura cellulare vengono eseguite in una cabina di sicurezza biologica.

1. Puntura venosa

1. Preparare tutta l'attrezzatura necessaria per la raccolta del sangue, tra cui spray disinfettante, tampone sterile, cannula per la raccolta del sangue con tubo da 80 mm e adattatore multiplo, laccio emostatico/bracciale per la pressione sanguigna, Monovette 9 mL di litio-eparina.
   NOTA: Anche l'EDTA come anticoagulante è efficace.
2. Prelevare il sangue dalla vena del braccio più appropriata, di solito la vena mediana cubiti o la vena cefalica.
3. Applicare un laccio emostatico/bracciale per la pressione sanguigna con una leggera pressione, intorno a 80 mm/Hg.
4. Disinfettare i guanti e il sito di puntura con uno spray disinfettante contenente alcol. Lasciare asciugare all'aria il sito di puntura disinfettato.
5. Le vene sporgono a causa della pressione del bracciale di pressione. Inserire l'ago (diametro della cannula (esterna) 21G / 0,8 mm, lunghezza 19 mm) con un angolo di 15°-20° della vena, cercando di evitare traumi e riducendo al minimo il sondaggio.
6. Prelevare il sangue con un sistema appropriato, 4 provette contenenti 9 mL di sangue (più di 7-8 provette sono problematiche da isolare correttamente per uno sperimentatore).
7. Dopo il prelievo di sangue, posizionare le provette di raccolta al buio per 5 minuti per garantire un'anticoagulazione uniforme.

2. Isolamento PBMC

1. Preparare tutte le soluzioni necessarie come descritto di seguito.
2. Portare la soluzione salina bilanciata di Dulbecco (DPBS; concentrazione 1x) e il terreno di isolamento linfocitario (1,077 g/mL) a temperatura ambiente (20-25 °C).
3. Preparare il siero fetale bovino (FBS) a temperatura ambiente e conservare una provetta conica sterile da 50 ml con FBS su ghiaccio. Per ogni campione di sangue sono necessari 2 mL di FBS.
4. Conservare il contenitore di congelamento a 4 °C e preraffreddare i criotubi a 4 °C.
5. Terreno di coltura cellulare caldo a 37 °C, il terreno è costituito da RPMI 1640 con 50 mL di FBS e penicillina 50 U/mL streptomicina 50 U/mL. Questa soluzione può essere conservata a 3 °C per un massimo di 2 mesi.
6. Aggiungere 8 mL di DPBS in provette coniche sterili da 50 mL. Aggiungere 15 mL di terreno di isolamento linfocitario in una provetta conica sterile da 50 mL (il terreno è sensibile alla luce, aggiungerlo prima di iniziare l'isolamento).
7. Aggiungere 8 mL di sangue a 8 mL di DPBS e miscelare con cura con una pipetta Pasteur in plastica da 3 mL.
8. Stratificare delicatamente la miscela sangue/DPBS con una pipetta Pasteur in plastica da 3 mL sopra il terreno di isolamento dei linfociti. Per applicare il primo strato sul terreno, inclinare il tubo di 20°-30°, il che si tradurrà in una minore penetrazione della miscela sangue-PBS nello strato del mezzo.
9. Stratificare con cura la miscela sangue-PBS sulla parete laterale della provetta sul terreno di isolamento dei linfociti. Usa una velocità costante per mantenere costante il flusso sanguigno.
10. Nella fase successiva, portare lentamente il tubo in posizione verticale, il sangue rimanente viene accuratamente stratificato sulla parete laterale del tubo sullo strato sanguigno.
11. Centrifugare per 10 minuti a 1000 x g a temperatura ambiente in una centrifuga con rotore a secchiello oscillante con freni disattivati. Dopo la centrifugazione, la miscela sangue/PBMC viene separata in quattro strati. Lo strato superiore è costituito da plasma e piastrine, il secondo strato è lo strato PBMC, seguito da uno strato medio di isolamento linfocitario e, infine, eritrociti e granulociti nello strato inferiore. I diversi livelli sono mostrati nella Figura 1.
12. Rimuovere 2/^{3 dello strato} di plasma con una pipetta Pasteur in plastica.
13. Utilizzando una pipetta da 1 ml, raccogliere le PBMC sullo strato di terreno di isolamento dei linfociti facendo attenzione a non far entrare alcun terreno nel campione.
14. Posizionare la punta 1 mm sopra lo strato PBMC. Lo strato PBMC non deve essere perforato, altrimenti il mezzo scorrerà sulle cellule. L'aspirazione della pipetta tira i PBMC fino a questo punto in modo che possano essere raccolti più volte in questo punto.
    NOTA: Per massimizzare il numero di PBMC raccolte, alla fine della procedura cercare il resto sulla superficie e cercare di raccogliere le cellule anche lì. Per stabilizzare la procedura, il tubo può essere posizionato su una superficie.
15. Trasferire le PBMC passo dopo passo in una nuova provetta da 50 ml fino a quando lo strato non è completamente raccolto. Aggiungere DPBS fino a 25 mL, lavare via il terreno di isolamento dei linfociti e altri residui.
16. Centrifugare per 10 minuti a 100 x g a temperatura ambiente con i freni tirati. Rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto o simile, facendo attenzione a non danneggiare il pellet cellulare.
17. Risospendere il pellet in 1 mL di DPBS e aggiungere DPBS al segno di 25 mL. Ripetere il lavaggio ancora una volta e poi risospendere in un mezzo appropriato per i passaggi successivi.

Figura 1: Rappresentazione schematica di una centrifugazione a gradiente di densità per illustrare i diversi strati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Crioconservazione

1. Raffreddare un contenitore per congelare a 4 °C, raffreddare FBS su ghiaccio.
2. Risospendere il pellet PBMC in 1 mL di FBS con una pipetta da 1 mL, l'FBS deve essere a temperatura ambiente.
3. Miscelare il DMSO con l'FBS preraffreddato su ghiaccio 1:5, concentrazione finale 20% DMSO, quindi rimettere la miscela FBS: DMSO sul ghiaccio. Preparare sempre la soluzione fresca.
4. Trasferire la sospensione cellulare PBMC in FBS in criotubi da 2 mL ben etichettati. Utilizzare un criotubo per provetta di raccolta. Regolare il numero di cellule tra 1 x 10⁷ e 5 x 10⁷ per ml. Utilizza un contatore di cellule automatizzato per determinare il numero di cellule e la vitalità.
5. Aggiungere 1 mL di miscela FBS: DMSO goccia a goccia con una pipetta da 1 mL, circa 1-2 gocce per s, nella provetta. L'aggiunta goccia a goccia porta a una miscelazione continua e coerente.
6. Mettere le provette nel contenitore di congelamento preraffreddato. Mettere il contenitore di congelamento in un congelatore a -80 °C per 24 ore. Il contenitore di congelamento fornisce un raffreddamento controllato di -1 °C al minuto.
7. Rimuovere i tubi dal congelatore a -80 °C. Dopo la rimozione dal congelatore, conservare le provette in fase gassosa di azoto liquido. Documentare la posizione di ogni campione.

4. Scongelamento

1. Preparare tutte le soluzioni necessarie: terreno di coltura cellulare RPMI 1640 con 50 mL di FBS e penicillina 50 U/mL, streptomicina 50 U/mL. Questa soluzione può essere conservata a 3°C per un massimo di 2 mesi.
2. Preriscaldare il terreno di coltura cellulare a 37 °C. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato in provette coniche sterili da 50 mL.
3. Rimuovere il campione dal serbatoio dell'azoto liquido. Scongelare i campioni a bagnomaria a 37 °C per circa 3,5 minuti, quindi rimuoverli dal bagnomaria non appena l'ultimo ghiaccio si scioglie. Un pezzo di ghiaccio delle dimensioni di una capocchia di spillo dovrebbe essere ancora visibile nel tubo.
   NOTA: Il DMSO è dannoso per il funzionamento dei PBMC il più rapidamente possibile.
4. Rimuovere la miscela cell:FBS:DMSO con una pipetta da 1 mL dal criotubo. Miscelare i campioni PBMC con il terreno di coltura cellulare nelle provette da 50 mL preparate. Lavare le provette con 5 mL di terreno di coltura in tre fasi da 2 mL, 2 mL e 1 mL.
5. Trasferire il mezzo nelle provette. Questo viene eseguito per trasferire eventuali residui cellulari. Centrifugare per 10 min a 100 x g a temperatura ambiente.
6. Scartare il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno appropriato per l'uso previsto. Le cellule sono pronte per i successivi esperimenti.
   NOTA: Tuttavia, con i test funzionali su cellule fresche o congelate, un periodo di riposo in un'incubatrice (in genere durante la notte) è spesso raccomandato dopo l'isolamento basato sul terreno di isolamento dei linfociti o lo scongelamento cellulare.

5. Colture cellulari

1. Dopo l'isolamento o lo scongelamento delle cellule di coltura per una notte a 37 °C in aria al 5% di CO₂/95%.
2. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno RPMI integrato con FBS al 10%, penicilina 50 U/mL, streptomicina 50 U/mL. Per un ulteriore utilizzo ci sono molte possibilità, trattare le cellule secondo necessità per i saggi.
3. Per la conservazione generale, utilizzare piastre sterili per colture cellulari a 6 pozzetti e raccogliere cellule dopo il periodo di riposo. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare con una pipetta da 1 mL in un pozzetto e aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare.
   NOTA: La quantità di PBMC isolate varia notevolmente da individuo a individuo, un pozzetto con 5 mL di terreno di coltura cellulare è sufficiente per ogni 8 mL di sangue isolato. Tuttavia, quando si isolano le PBMC dai buffy coat, la quantità di PBMC è significativamente superiore rispetto ai campioni di sangue intero e le cellule devono quindi essere suddivise in diversi pozzetti.
4. Lasciare riposare le cellule 24 ore in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO₂ a 37 °C. Questa incubazione viene eseguita sia per le cellule appena isolate che per le cellule crioconservate.

6. Dosaggio dell'ATP

1. Risospendere le PBMC scongelate in 1 mL di terreno RPMI integrato con FBS al 10%, penicillina 50 U/mL, streptomicina 50 U/mL.
2. Prelevare un campione e determinare il numero di cellule, quindi eseguire una discriminazione tra vivi e morti con il blu di tripano. Prelevare 10 μL dalle cellule risospese e miscelare con terreno di coltura cellulare da 90 μL. Quindi prelevare 10 μL e mescolare con 10 μL di blu di tripano. Posizionare le cellule in una camera di conteggio delle cellule o in un contatore automatico di cellule e determinare il numero di cellule vive/morte.
3. Piastra 100 μL di cellule a una densità di 1 x 10⁵ cellule/100 μL per pozzetto in una piastra di polistirene bianco a 96 pozzetti.
4. Lasciare riposare le cellule per 24 ore in atmosfera umidificata con il 5% di CO₂ a 37 °C.
5. Determinare le concentrazioni di ATP con un test ATP.
   1. Utilizzare l'emissione di luce che si verifica quando l'ATP è combinato con la luciferina. La luce emessa può essere valutata con un lettore di targhe. Rimuovere le piastre per far raffreddare l'incubatrice a temperatura ambiente per 15 minuti. Lisare le cellule e lasciarle agire per 5 minuti. Quindi applicare il reagente di monitoraggio alle cellule e misurare secondo le istruzioni del produttore. Uno standard interno viene utilizzato per determinare il livello di ATP.

7. Respirometria ad alta risoluzione

1. Accendere l'ossigrafo ad alta risoluzione e lasciarlo riscaldare per 30 minuti.
2. Trattare le cellule secondo un protocollo descritto nella Figura 1. Preparare tutte le scorte necessarie come indicato nella tabella 1.
3. Pipettare 2,1 mL di tampone respiratorio (Tabella 1) in entrambe le camere ossigrafiche ad alta risoluzione e agitare continuamente il tampone utilizzando una barra di agitazione magnetica presente nelle camere (750 giri/min) a 37 °C per 30 minuti fino a ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile del sensore di ossigeno polarografico.
   NOTA: Nelle camere dell'ossigrafo, il consumo di ossigeno in tempo reale (flusso) e la saturazione di ossigeno della camera vengono misurati con l'ausilio di elettrodi polarografici di ossigeno. La calibrazione di fondo deve essere eseguita per evitare il rumore di fondo e per garantire risultati affidabili.
4. Eseguire una calibrazione dell'aria del sensore polarografico di ossigeno secondo i protocolli del produttore²³.
5. Risospendere le PBMC isolate in 1 mL di mezzo respiratorio mitocondriale (MIR05 la composizione è mostrata nella Tabella 1) e diluire a 8 x 10⁶ cellule/mL.
6. Dopo la calibrazione dell'aria, aspirare il mezzo respiratorio dalla camera dell'ossigrafo e aggiungere 2,1 mL di sospensione cellulare in ciascuna campanatura del respirometro. Se necessario, durante la misurazione, riossigenare le camere (vedere Aprire al punto h nella Figura 2), la saturazione di ossigeno delle camere non deve scendere al di sotto di 100 μM.
7. Chiudere le camere inserendo i tappi, le camere sono progettate per contenere un volume di 2,0 mL. Aspirare la sospensione cellulare emergente.
8. Miscelare continuamente la sospensione cellulare a 37 °C con un agitatore magnetico (750 giri/min) situato nella camera. Attendere circa 20 minuti fino a ottenere un segnale stabile. Determinare la respirazione endogena ((a) nella Figura 2).
9. Per determinare le diverse attività complesse della catena respiratoria, iniettare i substrati e gli inibitori per la respirazione mitocondriale attraverso le porte di iniezione in titanio dei tappi. Utilizzare la seguente concentrazione finale nella camera.
10. Per rompere le membrane cellulari, aggiungere 5 μL di digitonina da 8,1 mM, attraverso la porta di iniezione in titanio del tappo della camera, per rimuovere i substrati naïve (b) nella Figura 2 mentre le membrane mitocondriali rimangono intatte.
11. Aggiungere substrati di glutammato 2 M e malato 800 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti.
    NOTA: È anche possibile utilizzare substrati aggiuntivi come il piruvato.
12. Aggiungere 8 μL di adenosina difosfato (ADP) 500 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (d) nella Figura 2.
13. Aggiungere 20 μL di succinato 1 M attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (e) nella Figura 2.
14. Titolare 1 M cianuro di carbonile p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP) gradualmente a 0,5 μL fino al punto in cui non si verifica alcun ulteriore aumento. Attendere 2-4 minuti fino a quando il segnale si stabilizza (f) nella Figura 2. Quando non c'è un ulteriore aumento della respirazione, continuare con il passaggio successivo.
    ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia FCCP in quanto presenta rischi per la salute umana.
15. Aggiungere 5 μL di rotenone 0,1 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (g) nella Figura 2.
    ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia il rotenone in quanto presenta rischi per la salute umana.
16. Aggiungere 1 μL di oligomicina 4 mg/mL attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (h) nella Figura 2.
    ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia l'oligomicina in quanto è un veleno che comporta rischi per la salute umana.
17. Aggiungere 1 μL di antimicina A 5 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a quando non viene raggiunto un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (i) nella Figura 2.
    ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia l'antimicina A in quanto è un veleno che comporta rischi per la salute umana.
18. Quando si valuta la corsa per escludere il consumo di ossigeno degli enzimi non coinvolti nella fosforilazione ossidativa, sottrarre i valori di antimicina A da tutti gli altri valori misurati.
19. Aggiungere 200 mM DI N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato (TMPD; donatore di elettroni) e 800 mM di ascorbato per mantenere il TMPD in uno stato ridotto. Iniettare i substrati attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a quando non viene raggiunto un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (j) nella Figura 2.
20. Il TMPD è soggetto ad autoossidazione, quindi sottrarre il consumo di ossigeno risultante dal valore misurato al Complesso IV.
21. Aggiungere NaN₃ ≥ 100 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti per inibire l'attività del complesso IV, rimane solo l'autoossidazione TMPD.
    ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia l'azide di sodio in quanto è un veleno che comporta rischi per la salute umana.

Figura 2: Andamento schematico del flusso di O₂ . Viene mostrato l'andamento schematico del flusso di ossigeno. La curva è suddivisa nelle diverse fasi dopo l'aggiunta di inibitori e substrati da a-k. a: respirazione endogena; b: cellule permeabilizzate; c: respirazione disaccoppiata del complesso I; d: respirazione accoppiata al complesso I; e: OXPHOS ; f: massima attività disaccoppiata di CI e CII; g: respirazione disaccoppiata del complesso II; h: perdita di respirazione; i: respirazione residua; j: CIV_(U) respirazione disaccoppiata e autoossidazione di TMPD; k: autoossidazione di TMPD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Attività della citrato sintasi

1. Misurare l'attività della citrato sintasi come parametro separato e utilizzarla per normalizzare le misurazioni dell'ossigrafo ad alta risoluzione.
2. Risospendere la PBMC isolata in 1 mL di terreno di respirazione mitocondriale (MIR05) e diluire a 8 x 10⁶ cellule/mL.
3. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a quando non vengono condotti esperimenti o per misurare cellule fresche.
4. Preparare tutte le soluzioni necessarie: tampone HCl trietanolammina 0,1 M pH 8,0, tampone Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, Tritone X-100 al 10%, ossalato 10 mM in tampone HCl trietanolammina 0,1 M pH 8,0, DTNB 1,01 mM in tampone Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, Acetil CoA 12,2 mM in H₂O bidistillato.
5. Preparare il terreno di reazione (tabella 1) contenente 5,5'-ditio-bis-(acido 2-nitrobezoico) (DTNB; 0,1 mM), acetil coenzima A (0,31 mM), EDTA (50 μM), trietanolammina HCl (5 mM) e Tris HCl (0,1 M).
6. Preparare il reagente di partenza (Tabella 1) con ossalacetato 0,5 mM disciolto in H₂O bidistillato.
7. Scongelare i campioni sul ghiaccio poiché la citrato sintasi è instabile se scongelata troppo rapidamente.
8. Aggiungere 40 μL dei campioni a una piastra da 96 pozzetti su ghiaccio prima di aggiungere 110 μL di mezzo di reazione con una multipipetta.
9. Terreno di reazione caldo e campione in un incubatore a 30 °C per 5 minuti. Reagente di avviamento a caldo a bagnomaria a 30 °C per 5 min.
10. Aggiungere 50 μL del reagente di partenza con una multipipetta a ciascun pozzetto. Misurare l'assorbanza a 30 °C a una lunghezza d'onda di 412 nm per 20 minuti tramite lettore di piastre.

Risultati

Vitalità e numero di cellule
Per ottenere il successo dell'isolamento e della crioconservazione, il numero di cellule e la vitalità devono essere i più alti possibile. Prima e dopo la crioconservazione, le cellule vengono contate e la loro vitalità viene determinata per garantire la salute e la qualità delle cellule. La Figura 3 è un'illustrazione rappresentativa delle PBMC prima e dopo la crioconservazione, la conta cellulare e la vitalità non differiscono molto. ...

Discussione

Questo protocollo fornisce un mezzo per isolare e crioconservare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue umano in modo adatto alle analisi bioenergetiche. Il metodo descritto offre la possibilità di isolare le PBMC in modo delicato e in grandi quantità, con un'elevata vitalità e un numero sufficiente di cellule per le misurazioni bioenergetiche. Ha lo svantaggio che anche con interruzioni minime, si verificano lunghi isolamenti, ma la successiva crioconservazione consente una misurazione della ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG