Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية الدورية المتعددة بالكشف في الموقع عن علامات متعددة في وقت واحد باستخدام حضانة الأجسام المضادة المستضدية المتكررة ، ومسح الصور ، ومحاذاة الصورة وتكاملها. هنا ، نقدم بروتوكول التشغيل لتحديد ركائز الخلايا المناعية بهذه التقنية في سرطان الرئة وعينات ورم خبيث في الدماغ المقترن.

Abstract

تتضمن البيئة المكروية للورم تفاعلات بين الخلايا المضيفة والخلايا السرطانية والخلايا المناعية والخلايا اللحمية والأوعية الدموية. يعد توصيف المجموعات الفرعية للخلايا المناعية والبروتينات المستهدفة وتنظيمها مكانيا أمرا بالغ الأهمية للأغراض التنبؤية والعلاجية. وقد أدى ذلك إلى تطوير طرق تلطيخ الكيمياء المناعية المتعددة. تسمح الكيمياء الهيستولوجية المناعية متعددة التألق بالكشف المتزامن عن علامات متعددة ، مما يسهل الفهم الشامل لوظيفة الخلية والتفاعلات بين الخلايا. في هذه الورقة ، نصف سير عمل لمقايسة الكيمياء المناعية الفلورية الدورية المتعددة وتطبيقها في التحليل الكمي للمجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية. يتبع تلطيخ الكيمياء المناعية الفلورية الحلقية المتعددة خطوات وكواشف مماثلة للكيمياء الهيستولوجية المناعية القياسية ، بما في ذلك استرجاع المستضد ، وحضانة الأجسام المضادة الدورية ، والتلوين على شريحة نسيج مدمجة بالبارافين مثبتة بالفورمالين (FFPE). أثناء تفاعل المستضد والجسم المضاد ، يتم تحضير خليط من الأجسام المضادة من أنواع مختلفة. يتم تحسين الظروف ، مثل وقت استرجاع المستضد وتركيز الأجسام المضادة ، والتحقق من صحتها لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذه التقنية قابلة للتكرار وتعمل كأداة قيمة لأبحاث العلاج المناعي والتطبيقات السريرية.

Introduction

تمثل نقائل الدماغ (BM) أكثر أورام الجهاز العصبي المركزي شيوعا (CNS) ، والتي تحدث في ما يقرب من نصف حالات سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) ، مع سوء التشخيص1. ما يقدر بنحو 10٪ -20٪ من مرضى NSCLC لديهم بالفعل BM في وقت التشخيص الأولي ، وحوالي 40٪ من حالات NSCLC ستتطور BM أثناء العلاج2. ترتبط البيئة المكروية للورم (TME) ارتباطا وثيقا بحدوث NSCLC و BM ، بما في ذلك المكونات المختلفة ، مثل الأوعية الدموية ، والخلايا الليفية ، والبلاعم ، والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والخلايا المناعية اللمفاوية ، والخلايا المناعية المشتقة من نخاع العظام ، وجزيئات الإشارة 3,4. تلعب الخلايا المناعية البيئية الدقيقة دورا حاسما في التأثير على نمو الخلايا السرطانية وتطورها. تقدم نقائل الدماغ العديد من أهداف العلاج المحتملة التي تتميز بالبيئات الدقيقة المناعية المعقدة وعمليات الإشارات. على سبيل المثال ، أظهرت مثبطات PD-1 فعالية سريرية للمرضى الذين يعانون من ورم خبيث في الدماغ بسرطان الرئة (LCBM) كمثبط لنقطة التفتيش المناعية (ICI). ومع ذلك ، فإن تواتر الاستجابات للعلاج PD-1 يختلف بين NSCLC الأساسي و LCBM5 ، مما يشير إلى أن البيئة الدقيقة المناعية للورم تعمل كمنظم حاسم ل ICI.

الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي أداة لا تقدر بثمن في مجالات علم الأحياء والطب التأسيسي وعلم الأمراض6. تصور طريقة الكشف هذه تعبير المستضد من خلال تفاعل الجسم المضاد للمستضد على شريحة الأنسجة7. يستخدم IHC لتشخيص العلامات التنبؤية ، وتقييم العلامات النذير ، وتوجيه العلاجات المستهدفة ، واستكشاف الوظائف البيولوجية للخلايا السرطانية8. ومع ذلك ، يمكن لطريقة IHC التقليدية اكتشاف علامة حيوية واحدة فقط في كل مرة. لمعالجة هذا القيد ، أدى ابتكار التكنولوجيا الكيميائية المناعية إلى تطوير الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية المتعددة (mfIHC) ، والتي تسمح بالتحديد المتزامن لعلامات البروتين المتعددة على نفس شريحة الأنسجة ، سواء في المجال الساطع أو المجال الفلوري9. يوفر هذا التقدم تحليلا دقيقا لتكوين الخلايا والتفاعلات الجزيئية بين الخلايا اللحمية والخلايا المناعية والخلايا السرطانية داخل TME.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا للكيمياء المناعية الحلقية المتعددة لتحليل التوزيع المكاني للخلايا المناعية. يتم اختيار اثنين من الأجسام المضادة الأولية من أنواع مختلفة ، مثل الأرانب والفئران ، للحضانة في وقت واحد ، تليها الأجسام المضادة الثانوية الموصوفة بالتألق. يتم إجراء استرجاع المستضد بعد كل جولة من تفاعل المستضد والجسم المضاد. يتم حظر التألق الذاتي ، ويتم استخدام 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لتلطيخ النوى. تتضمن اللوحة الكشف المتسلسل عن CD3 و CD8 و CD20 و CK ، ويتم تصنيف الخلايا وفقا للعلامات: الخلايا السرطانية (CK +) ، الخلايا التائية الناضجة (CD3 +) ، الخلايا التائية السامة للخلايا (CD3 + CD8 +) ، الخلايا البائية (CD20 +) 10,11.

Protocol

تمت الموافقة على البحث من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى يونان للسرطان / المستشفى الثالث التابع لجامعة كونمينغ الطبية. وقع جميع الأشخاص / الأوصياء القانونيين على الموافقة المستنيرة.

1. إعداد الشرائح

  1. قطع أجزاء من كتل البارافين المقترنة التي تحتوي على ورم رئوي أولي أو خلايا نقائل دماغية لسرطان الرئة بسمك 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. قم بإزالة الأقسام إلى الماء وفصلها بملاقط ، واختر أفضلها وألصقها على الشريحة المطلية بالبوليسين.
  2. ضع شرائح المناديل الورقية في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز التصاق الأنسجة.
  3. اغمر الشرائح في الزيلين من خلال ثلاثة تغييرات ، يدوم كل منها لمدة 10 دقائق.
  4. قلل تدريجيا من تركيز الكحول واحتضان الشرائح في 100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، و 90٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، و 75٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، وفي ماء منزوع الأيونات لمدة 3 دقائق.

2. استرجاع الحواتم المستحثة بالحرارة (HIER)

  1. قم بتخفيف محلول عازلة سترات الصوديوم 100x (درجة الحموضة 6.0) إلى 1x (10 mM) في الماء منزوع الأيونات ، وإعداد محلول عازل كاف لغمر الشرائح تماما.
  2. ضع الشرائح في قدر الضغط ، مع تعريضها للحرارة العالية (100 درجة مئوية) والضغط (~ 30 رطل / بوصة مربعة) لمدة 2 دقيقة. بعد التسخين ، اترك الشرائح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة في الماء المقطر لمدة 3 دقائق.
  3. قم بإذابة عبوة واحدة تحتوي على 52 جم من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ مسحوق) في 5 لتر من الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول عازلة PBS (درجة الحموضة 7.0). ضع الشرائح في محلول المخزن المؤقت PBS لمدة 5 دقائق ، مع 3 تغييرات.

3. حجب البيروكسيديز

  1. قم بتغطية الأقسام بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف الشرائح في PBS ، 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  2. استخدم ورق الترشيح لامتصاص الماء الزائد بعيدا عن محيط الأنسجة. وفي الوقت نفسه ، تأكد من أن الأنسجة رطبة.

4. حضانة الأجسام المضادة الأولية للجولة الأولى

  1. قم بإعداد خليط عامل من الأجسام المضادة الأولية ل CD8 (الجسم المضاد أحادي النسيلة للأرنب ، استنساخ SP16) و CD20 (الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ، استنساخ L26) ، مخفف 1:50 في مخفف الأجسام المضادة الأولية بوند.
  2. أضف مجمع الأجسام المضادة إلى الأقسام واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير محلول محلول ملحي بنسبة 0.1٪ توين / فوسفات مخزن: 1 مل من توين في 1 لتر من محلول عازلة PBS.
  4. اغسل الأجزاء بمحلول ملحي 0.1٪ توين / فوسفات ، 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. استخدم ورق الترشيح لسحب الماء الزائد بعيدا عن محيط الأنسجة ، وفي الوقت نفسه ، تأكد من رطوبة المنديل.

5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية للجولة الأولى

  1. قم بإعداد مزيج من الأجسام المضادة للأرانب للماعز المسمى بالفلورة (الإثارة (Ex): 495 نانومتر) والأجسام المضادة للفأر الماعز (على سبيل المثال: 578 نانومتر) ، مخففة 1:50 في محلول ملحي عازلة للفوسفات. يرتبط الجسم المضاد للأرانب الماعز بالجسم المضاد الأساسي ل CD8 ، ويرتبط الجسم المضاد للفأر الماعز بالجسم المضاد الأساسي ل CD20.
  2. أضف خليط الأجسام المضادة الثانوي بالتنقيط واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.

6. استرجاع الخاتمة المستحثة بالحرارة وحجب البيروكسيديز

  1. قم بتخفيف سترات الصوديوم 100x (درجة الحموضة 6.0) إلى 1x (10 mM) في الماء منزوع الأيونات ، وإعداد محلول عازل كاف لغمر الشرائح تماما.
  2. ضع الشرائح في قدر الضغط وعرضها للحرارة العالية (100 درجة مئوية) والضغط (~ 30 رطل / بوصة مربعة) لمدة 1 دقيقة. بعد التسخين ، ضع الشرائح في ماء مقطر لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  3. قم بإجراء حظر البيروكسيديز كما هو موضح في الخطوة 3.

7. حضانة الأجسام المضادة الأولية للجولة الثانية

  1. قم بإعداد خليط عمل من الأجسام المضادة الأولية ل CD3 (الجسم المضاد أحادي النسيلة للأرنب ، استنساخ SP7) و CK (الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ، MX005) ، المخفف 1:50 في مخفف الأجسام المضادة الأولية.
  2. أضف مجمع الأجسام المضادة إلى الأقسام واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. يغسل بمحلول ملحي 0.1٪ توين / فوسفات ، 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما. استخدم ورق الترشيح لسحب الماء الزائد بعيدا عن محيط الأنسجة ، وفي الوقت نفسه ، تأكد من رطوبة المنديل.

8. حضانة الأجسام المضادة الثانوية للجولة الثانية

  1. تحضير خليط الماعز المضاد للأرانب (مثال: 652 نانومتر) والجسم المضاد للفأر الماعز (مثال: 590 نانومتر) ، والتخفيف 1:50 في محلول ملحي عازلة للفوسفات. يرتبط الجسم المضاد للأرانب الماعز بالجسم المضاد الأساسي ل CD3 ، ويرتبط الجسم المضاد للفأر الماعز بالجسم المضاد الأساسي ل CK.
  2. أضف خليط الأجسام المضادة الثانوي قطرة قطرة ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يغسل بمحلول ملحي 0.1٪ توين / فوسفات ، 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.

9. التبريد الذاتي وتلطيخ DAPI

  1. أضف كاشفا (0.15 م / لتر KMnO4) إلى قسم الأنسجة لمدة 1 دقيقة. شطف بالماء الجاري لمدة 5 دقائق.
    تنبيه: KMnO4 سام ويضر الجلد. تأكد من ارتداء القفازات عند التعامل مع الشرائح. إذا كان السائل يقطر على الجلد ، امسحه بسرعة بمناديل نظيفة واغسله بالماء المتدفق.
  2. جفف الشريحة بتركيزات متزايدة من الكحول (70٪ ، 90٪ ، 100٪) ، لمدة 3 دقائق في كل تركيز.
  3. أضف DAPI و coverslip للتصوير متعدد الأطياف. كمية DAPI يعتمد على حجم الأنسجة. تأكد من تغطية الأنسجة بالكامل بواسطة DAPI بعد إضافة غطاء الغطاء.

10. مسح الشرائح

  1. ضع الشرائح على صينية وادفعها حتى لا يمكن دفعها أكثر.
  2. لبدء البرنامج ، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز البرنامج على سطح المكتب. أثناء بدء التشغيل ، يتم عرض نافذة تحديد الوضع. تعرض نافذة التحديد وضعين ساطعين وفلورسنت: الوضع التلقائي والوضع اليدوي. في وضع المسح الضوئي بالفلورسنت، انقر فوق الوضع التلقائي.
  3. حرك مؤشر الماوس فوق ؟ لعرض معلومات حول الإعدادات. انقر فوق إعداد التصفية > تصفية القناة لاختيار رقم القناة > اللون الزائف. تحديد اللون وحفظه.
  4. انقر فوق العمل الروتيني > وضع المسح الضوئي > تلقائي بالكامل. انقر فوق العمل الروتيني > اسم الشريحة لتعريف اسم الشريحة للإخراج. انقر فوق العمل الروتيني > إعدادات القناة لاختيار عوامل التصفية.
  5. انقر فوق خيارات الفحص > العمل الروتيني لتحديد الجودة الناتجة وموقع تخزين الشريحة الظاهرية.
  6. انقر فوق معاينة لإعداد العتبة وتحديد النطاق المراد مسحه ضوئيا.
  7. انقر فوق مرشحات > الأجهزة > Live > Auto Focus > Auto Exposure > Digital Gain > ضع علامة استخدم وقت التعرض اليدوي > حدد الحد > النطاق ضبط التيار.
  8. انقر فوق العمل الروتيني > بدء المسح الضوئي. حدد مستوى التكبير ك 20x أو 40x. اختر 20x لأحجام الملفات المناسبة. يتم تعريف تمديد MRXS بواسطة الماسح الضوئي 3D Pannoramic MIDI. يمكن أيضا تغيير امتداد الصورة إلى صورة TIFF.
  9. انقر فوق عارض الشرائح > مربع أدوات العرض المتعدد لاختيار الصورة للتركيز ، ثم محاذاة الصورة ودمجها.

11. التقييم الكمي لكثافات الخلايا

  1. حدد النسب المئوية للخلايا المناعية الإيجابية (CD3 + ، CD3 + CD8 + ، CD20 +) في مناطق الورم والسدى باستخدام برنامج Halo 10 Scanner. التحقق من صحة تلطيخ CK لتحديد أنسجة الورم.

النتائج

نقدم بروتوكولا للكشف عن المستضد الدوري باستخدام مضان متعدد الإرسال مكون من 5 ألوان على شريحة واحدة. من خلال تحسيننا للفحص ، نمكن حضانة جسمين مضادين من أنواع مختلفة (الشكل 1). تشمل الأجهزة اللازمة لإجراء التجربة طنجرة ضغط وصندوق تلطيخ مناعي (الشكل 2 أ).

Discussion

لقد وصفنا عملية تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية الدورية المتعددة. يعد اختيار الأجسام المضادة الأولية جانبا مهما من مقايسة الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية ، ويوصى باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لتحسين الخصوصية والتكرار. لتحسين تركيز العمل للجسم المضاد ال...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81860413 ، 81960455) ، صندوق قسم العلوم والتكنولوجيا في يوننان (202001AY070001-080) ، مؤسسة البحث العلمي التابعة لإدارة التعليم في مقاطعة يوننان (2019J1274).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15 mol/L KmnO4Maixin Biotechnology Co. Ltd.MST-8005
100x sodium citrate Maixin Biotechnology Co., LtdMVS-0100
3% hydrogen peroxideMaixin Biotechnology Co., LtdSP KIT-A1
3D Pannoramic MIDI3D histech LtdPannoramic MIDI 1.18
Alexa Fluor 488Abcamab150113
Alexa Fluor 568 Abcamab175701
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 647Abcamab150079
Bond primary antibody diluentLeciaAR9352
CD20Maixin Biotechnology Co., Ltdkit-0001
CD3Maixin Biotechnology Co., Ltd. kit-0003
CD8 Maixin Biotechnology Co., LtdRMA-0514
CKMaixin Biotechnology Co. Ltd.MAB-0671,
DAPIsig-maD8417
ethanolSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10009218
Histocore Multicutlecia2245
PBS(powder)Maixin Biotechnology Co., LtdPBS-0061
slide viwer 3D histech Ltd
xyleneSinopharm Group Chemical reagent Co., LTD10023418

References

  1. Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
  2. Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
  3. Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
  4. Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
  5. Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
  6. Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
  7. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
  8. Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
  9. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
  10. Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
  11. Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
  12. Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
  13. Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
  14. McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
  15. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  16. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
  17. Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
  18. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  19. Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
  20. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved