בידוד ושימור בהקפאה של תאים חד-גרעיניים אנושיים היקפיים בעלי יכולת קיימא גבוהה מדם שלם: מדריך למתחילים

Summary

פרוטוקול זה מציג מדריך נגיש לאיסוף, אחסון והפשרה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים המתאימים לניתוחים ותהליכי עבודה במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. קולקציות פלזמה ומעילים באפי מודגמות גם כן.

Abstract

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) משמשים בדרך כלל במחקר ביו-רפואי על מערכת החיסון ותגובתה למחלות ופתוגנים. פרוטוקול מפורט זה מתאר את הציוד, האספקה והצעדים לבידוד, שימור הקפאה והפשרה של PBMCs באיכות גבוהה ובת קיימא ביותר מתאי דם שלמים המתאימים ליישומים במורד הזרם כגון ציטומטריית זרימה וריצוף RNA. מתוארים גם פרוטוקולים לעיבוד פלזמה ופרווה באפי מכל הדם במקביל ובמקביל למרכזיות. פרוטוקול שלב אחר שלב קל לביצוע, המשתמש בצנטריפוגות שיפוע צפיפות כדי לבודד PBMCs, מלווה ברשימת תיוג של אספקה, ציוד ושלבי הכנה. פרוטוקול זה מתאים לאנשים עם ניסיון קודם בטכניקות מעבדה וניתן ליישמו במעבדות קליניות או מחקריות. איכות גבוהה של קיום תאים וריצוף RNA נבעו ממרכזיות שנאספו על ידי מפעילים ללא ניסיון מעבדה קודם בשימוש בפרוטוקול זה.

Introduction

פרוטוקול זה מדגים שיטה וזרימת עבודה נגישה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדם שלם. פרוטוקול זה מיועד במיוחד לטכנאי מחקר מתחילים, סטודנטים וצוות מעבדה קלינית במטרה להקל על איסוף ושימור בהקפאה של PBMCs מבלי להניח הכשרה מוקדמת בטכניקות מעבדה.

פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה כדי להפריד את מרכיבי הדם המלא לפי צפיפות. דם שלם מורכב מארבעה מרכיבים עיקריים המפורטים לפי סדר ירידת הצפיפות: תאי דם אדומים/אריתרוציטים (~45% מהנפח), תאי דם לבנים (<1% מהנפח), טסיות דם (<1% מהנפח) ופלזמה (~55% מהנפח)1,2,3,4,5,6.

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי UCSD ו- KUMC Human Protections Program ותואם את הצהרת הלסינקי. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתפות ואיסוף דם.

1. עיבוד ושימור בהקפאה של PBMCs

1. יום לפני איסוף הדם, הדפיסו את רשימת החומרים והריאגנטים המפורטים בטבלה 2 והכינו ותייג?.......

Discussion

פרוטוקול זה לאיסוף PBMC ושימור בהקפאה יושם בהצלחה על ידי אנשים עם וללא הכשרה קודמת במעבדת מחקר. ביישום שלנו, FACS וריצוף RNA של מונוציטים בני קיימא ביותר שטוהרו מ- PBMCs מאוחסנים הביאו לרצפים באיכות גבוהה.

חוזקה עיקרית של פרוטוקול זה היא נגישותו. הטכניקה המוצגת בפ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL Tips	Gilson	F174501	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
15 mL tube	Biopioneeer	CNT-15	To hold Solutions 2/3 2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Approximately 40 cryovials needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µL Tips	Gilson	F174201	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used. 1 tip is needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
50 mL Conical Tube	CEM Corporation	50-187-7683	2 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CD14 Antibody	Biolegend	325621
CD16 Antibody	Biolegend	360723
CD19 Antibody	Biolegend	363007
CD3 Antibody	Biolegend	300405
CD56 Antibody	Biolegend	318303
CD66b Antibody	Biolegend	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
CPT Mononuclear Cell Preparation Tube	BD Biosciences	362753	6 tubes needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Holds 81 tubes 1 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Holds up to 50 cryovials
DMSO	Invitrogen	15575020	Approximately 2.5 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977015	Approximately 2 mL needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 9 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR Antibody	Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Approximately 25 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	For use in Mr. Frosty
Label Printer	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Holds up to 18 tubes. 2 Mr. Frostys needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Multidispense Pipette	Brandtech	705110
Multidispense Pipette Tips	Brandtech	705744	Approximately 3 tips needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000 Pipette	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	For use in cell counting; volume needed is dependent on method of cell counting used.
Printer Labels	Phomemo	PM-M110-3020	Approximately 45 labels needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Approximately 5 labels needed per 1 mL of unpooled frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free EDTA (0.5 M)	Invitrogen	AM9260G	Approximately 40 µL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Approximately 1 mL needed per 1 mL of frozen PBMCs to be defrosted
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Approximately 80 mL needed per patient or treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-7M	Approximately 5 needed per patient/treatment condition for PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Tube Holder	Endicott-Seymour	14-781-15	Holds up to 80 CPT/EDTA Tubes