Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Özet

Biz bir bütün montaj immünohistokimya tanıtmak ve lazer fare embriyonik ekstremite cilt karmaşık damar ağı oluşumunu analiz etmek için birden fazla etiketleme ile konfokal mikroskopi tarama.

Özet

Tüm montaj immünohistokimyasal analiz görüntüleme için tüm damarsal morfolojilerinden dallanma hücresel mekanizmaları anlamak için çok önemlidir. Biz önceden varolan ilkel kapiller pleksus hiyerarşik dallı bir damar ağına yeniden organize olduğu damar gelişimini incelemek için ekstremite deri vaskülatürü modeli geliştirdik. Birden fazla etiketleme ile tüm montaj konfokal mikroskopi belirli floresan belirteçleri kullanarak, endotel hücreleri perisitlerden ve düz kas hücreleri de dahil olmak üzere, sağlam kan damarlarının yanı sıra hücresel bileşenleri, güçlü görüntüleme için izin verir. Genetik çalışmalar ile bu uzuv deri vaskülatürü modeli gelişmeler, vasküler gelişimi ve desenlendirme moleküler mekanizmaları anlamak düzeldi. Ekstremite deri vaskülatürü modeli, periferik sinirleri arterlerin farklılaşma ve desenlendirme için mekansal bir şablon nasıl çalışmak için kullanılır olmuştur. Bu video makalede, vasküler gelişim sürecini takip edebilecek vaskülarize embriyonik organları için geçerli olan vasküler spesifik antikorlar ve floresan ikincil antikorlar, sağlam kan damarları leke için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır.

Protokol

1. Toplama Fare Embriyonik Ekstremite Skin (E13.5 ~ E17.5)

1. Euthanize Onaylanan prosedür kadın takılı. Onaylı hayvan protokole göre, kadınlarda CO ₂ maruz tarafından ötenazi ve sonra servikal dislokasyon ile güvence altına. Emici kağıt havlu üzerine yatırın ve hayvan sıkmak şişeden% 70 EtOH / H ₂ O iyice ıslatın.
2. Rahim sağlam inceleyin ve kan yıkamak için buz Hanks 'Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren 100 x 15 mm Petri kabı yerleştirin.
3. Embriyo ayrı ve teşrih. Embriyo çok ince amniyon çıkarın.
4. Her embriyo genotip gerekiyorsa (Seçenek) 35 x 10 mm Petri kabında tek bir embriyo parçalara ayır. Disseke kuyruk genotipleme için 0,2 ml PCR tüpü aktarılır.
5. Embriyonun ön ayakları kesiliyor ve transferi 24 plaka 2 ml Phosphate Buffer Saline (PBS) buz gibi taze% 4 Paraformaldehit (PFA) içeren bir halka forseps ön ayakları.
6. 4 ° C gecede Nutator Mikser nazik karıştırma ön ayakları sabitleyin.
7. Ertesi gün, PFA çıkartın ve oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma ile 2 ml PBS 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
8. % 100 metanol (MeOH) ön ayakları transferi ve -20 ° C'de enzim dondurucu (kritik sıcaklık kontrolü ve otomatik buz çözme fonksiyonu olmadan dondurucu) saklayabilirsiniz. İlköğretim antikorlar% 100 MeOH tedaviden sonra Tablo 1 iş listelenmiştir.
9. Ince cımbız kullanarak ön ayakları kapalı cilt Peel. Ekstremite cilt, kurutulmuş, uzuv kolayca ayrılmalıdır. İlk uzuv yukarı bakacak ventral tarafı (avuç içi tarafında) yerleştirin. Sonra videoda gösterildiği gibi ince cımbız kullanarak, deri kesme. Sonraki herhangi bir zarar vermeden cildi nazikçe sıyrılarak, tüm bacak çevresinde teşrih.

2. Tüm montaj Ekstremite Skins İmmünohistokimyasal Boyama

1. MeOH / PBT (PBS +% 0.2 Triton X-100) (% 75,% 50,% 25) için her biri 5 dakika aşamalı bir dizi kuluçka 5ml polipropilen yuvarlak alt tüp bacak derileri rehidrate. Çözümler alışverişi ekstremite derileri zarar vermemek için dikkatli olunması gerektiğini unutmayın.
2. , Oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma PBT 5 dakika için iki kez yıkayın.
3. Nutator Mikser nazik karıştırma ile 2 saat eşek sekonder antikor için% 10 keçi sekonder antikorlar serum / PBS +0.2% TX100 engelleme tampon Keçi veya% 10 Eşek serum / PBS +0.2% TX100 engelleme tampon ya bacak derileri Blok oda sıcaklığında bekletin.
4. Engelleme tampon birincil antikor 800μl (Tablolarda listelenen uygun dilüsyon) (2ml mikrosantrifüj tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer bacak deriler% 10 ya da koyun keçi serum / PBS 0,2 % TX100 veya% 10 Eşek serum / PBS +0.2% TX100). 4 ° C gecede Nutator Mikser nazik karıştırma ile bacak derileri inkübe edin. Farklı türleri (örneğin, sıçan monoklonal antikor + tavşan poliklonal antikor) türetilen multipl primer antikorlar aynı anda kullanılabilir olabileceğini unutmayın.
5. Ertesi gün, yıkama tampon 4ml (ya% 2 Keçi serum / PBS +0.2% TX100 veya 2, yuvarlak alt 5ml polipropilen tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer ekstremite derileri yerde % Eşek serum / PBS +0.2% TX100).
6. Nazik oda sıcaklığında Nutator Mikser karıştırma ile 15 dakika süreyle beş kez yıkayın.
7. 800μl engelleme tampon sekonder antikor (ya% 10 Keçi serum / PBS +0.2% TX100 veya% 10 Eşek serum / 2ml-mikrosantrifüj tüp içine bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer bacak derileri koyun PBS +0.2% TX100). Genelde biz Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 dilüsyonları) veya Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 dilüsyon) ikincil antikorlar kullanır. 0.22μm PVDF membran şırınga filtreleri kullanarak sekonder antikor toplu parçacıkları çıkarmak için ikincil antikor çözüm Filtre. Oda sıcaklığında Nutator Mikser nazik karıştırma ile 1 saat karanlık veya alüminyum folyo ile sarılmış bacak derileri inkübe edin. Farklı türlerden elde edilen farklı floresan konjuge sekonder antikorlar aynı anda kullanılabilir olabileceğini unutmayın.
8. Bacak derileri koyun yıkama tampon 4ml (% 2 Keçi serum / PBS 0,2% ya TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS ile 5ml polipropilen yuvarlak alt tüpe bir halka forseps ile 35 x 10 mm Petri kabı ve transfer 0,2% TX100). Koyu veya yumuşak oda sıcaklığında Nutator Mikser karıştırma alüminyum folyo ile sarılmış 15 dakika süreyle beş kez yıkayın.
9. (Çekirdeği karşı counterstaining için Seçenek) yıkama tampon 4ml (ya% 2 Keçi serum / PBS 0,2% TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS +0.2% TX100) için-Pro-3 (Invitrogen T3605 ile bacak derileri inkübe , koyu veya oda sıcaklıklarda Nutator Mikser nazik karıştırma ile 10 dakika süreyle alüminyum folyo ile sarılır 1:3000 dilüsyon)yeniden. Daha sonra, nazik karıştırma ile alüminyum folyo ile karanlık veya sarılmış yıkama tampon 4ml (% 2 Keçi serum / PBS TX100 veya% 2 Eşek serum / PBS +0.2% +0.2% TX100 ya) ile 5 dakika boyunca üç defa yıkamak oda sıcaklığında Nutator Mikser. Çekirdekleri için güçlü ve spesifik boyanması için pro-3 için belirli bir emisyon (HeNe 633 nm eksitasyon) görülmektedir unutmayın.

3. Slayt Ekstremite Skins Montaj

1. 35 x 10 mm Petri kabında bacak derileri yerleştirin. Beyazlatma kapsamlı fotoğraf çekmemek için düşük aydınlatma stereomicroscope altında ince bir cımbız kullanarak derileri iç tabakası toz, kristaller, elyaf çıkarın.
2. Bir halka forseps yapışkan mikroskobik slayt bacak derileri aktarın. Slayt (yani lamel doğru) yukarı doğru uzanan iç tabakası ile derileri yerleştirin. Derileri titizlikle cımbız kullanarak Düzleştir'i kaldırmak ve Kimwipe tarafından tampon yıkama-over taşımak.
3. Hava kabarcıkları olmadan, anti-solmaya montaj medya monte edin. Biz 25 "x25" lamel kullanın. Karanlıkta düz bir yüzey üzerinde Cure (örneğin, örnekleri görüntülemeden önce oda sıcaklığında karanlık bir gece olarak yerleştirilir Altın reaktif uzatmak kullanılarak monte). Uzun süreli depolama için, 4 slayt lamel ve mağaza mühür ° C

4. Konfokal Mikroskop

1. Fluorophores için uygun lazerler kadar ayarlayın. Biz, Argon 488nm (Alexa Fluor 488 ve GFP), DPSS 561nm (Alexa Fluor 568 ve Cy3) ve HeNe 633nm (Alexa Fluor 633, Cy5 ve To-Pro-3 için) olmak üzere üç lazer kaynakları ile Leica TCS SP5 konfokal mikroskop .
2. Tüm boyalar, çift ya da üçlü lekeli örneklerinde aynı zamanda heyecanlı olacağı crosstalk önlemek veya azaltmak için sıralı tarama aracını kullanın. Sıralı tarama modu, sıralı olarak kaydedilir.
3. Uyarma için floresan boyalar ve lazer hakkında daha fazla genel bilgi Hibbs (2004) tarafından "Biyologlar için Konfokal Mikroskop" kurulmuş olabilir

5. Temsilcisi Sonuçlar

Pan-endotelyal hücre işaretleyici karşı antikorlar E15.5 fare ön ayakları deride Tüm montaj üç-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi PECAM-1 (Şekil 1A-C, D, mavi), nörofilaman işaretleyici 2H3 (Şekil 1A yeşil) ve ekstremite cilt 2H3 ⁺ periferik sinirleri ile uyumlu αSMA ⁺ arterlerin bir karakteristik dallanma deseni, düz kas hücre belirteci αSMA (Şekil 1A, B kırmızı) ortaya çıkardı. Dallanma kan damarı yanı sıra, bu uzuv deri vaskülatürü modeli lenfatik endotel hücre işaretleyici LYVE-1 (Şekil 1D, E kırmızı) ve Neuropilin2 (NRP2) (Şekil 1D, F yeşil antikorlar kullanılarak lenfatik damar dallanma desenlendirme incelemek için kullanılır. .)

Şekil 1 (AC) Arterler embriyonik ekstremite cilt periferik sinir ile aynı hizaya getirin. Pan-endotelyal hücre belirteci PECAM-1 (AC, mavi), nörofilaman işaretleyici 2H3 (A, yeşil) ve düz kas hücre işaretleyici αSMA (A ve B, kırmızı karşı antikorlar ile tüm montaj üçlü-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi ) gösterilir. E15.5, 2H3 ⁺ periferik sinirlerin (açık ok) αSMA tarafından karşılanmaktadır arterler (ok başları) ⁺ düz kas hücreleri ile ilişkilendirir. (DF) embriyonik ekstremite cilt Lenfatik damarsal. Pan-endotelyal hücre belirteci antikorlar PECAM-1 (D, mavi), lenfatik endotel hücre işaretleyici LYVE-1 (D ve E, kırmızı) ve Neuropilin2 (NRP2) (D ve F, yeşil Triple-etiket konfokal immnofluorescence mikroskopi ) gösterilir. LYVE-1 de makrofajlar (açık ok başları) bir alt kümesi ile ifade edilir ise, lenf damarları, LYVE-1 ve NRP2 her iki tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu: 100μm.

Tartışmalar

Organlara yeterli oksijen ve besin kaynakları nedeniyle vasküler sistem, embriyogenez sırasında yanı sıra yetişkinler organ bakım ve üreme fonksiyonları için organ gelişimi için çok önemlidir. Uygun damar ağı, önceden mevcut olan kapiller ağ çok dallı ve hiyerarşik yapıları ile yeniden düzenlenmiş olan anjiyogenez karmaşık ve çok adımlı işlemler ile kurulmuştur. Birçok eseri çeşitli moleküller bu süreçlere dahil olduğu gösterilmiş olsa da, organ veya bileşenleri vasküler dalla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
PECAM-1	Ermeni, hamster (M)	Chemicon	MAB1398Z	1:100 dilüsyon # 1
PECAM-1	Rat (M)	BD	553369	1:300 dilüsyon
VEGFR2	Rat (M)	eBioscience	14-5821-82	1:200 oranında seyreltildiğinde
CD34	Rat (M)	eBioscience	13-0341	1:300 dilüsyon
Kollajen IV.	Tavşan (P)	Abd Serotec	2150-1470	1:300 dilüsyon # 2

Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
Neuropilin1	Tavşan (P)	Alex Kolodkin laboratuvar # 3		1:3000 dilüsyon
Unc5H2	Keçi (P)	Ar-Ge	AF1006	1:200 oranında seyreltildiğinde

Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
EphB4	Keçi (P)	Ar-Ge	AF446	1:100 dilüsyon

Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
LYVE-1 # 4	Tavşan (P)	Abcam	ab14917	1:200 oranında seyreltildiğinde
LYVE-1 # 4	Rat (M)	MBL	D225-3	1:200 oranında seyreltildiğinde
Prox-1	Tavşan (P)	Chemicon	AB5475	1:1000 dilüsyon
Prox-1	Keçi (P)	Ar-Ge	AF2727	01:50 seyreltme
Neuropilin2	Tavşan (P)	Hücre Sinyalizasyonu	3366	1; 100 seyreltme
Podoplanin	Suriye hamsteri (M)	Hibridoma Bankası	8.1.1	1:200 oranında seyreltildiğinde

Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
αSMA-Cy3	Fare (M) # 5	Sigma	C-6198	1:500 dilüsyon # 6
NG2	Tavşan (P)	Chemicon	AB5320	1:200 oranında seyreltildiğinde
SM22α	Tavşan (P)	Abcam	ab14106	1:200 oranında seyreltildiğinde

Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
GFP	Tavşan (P)	Invitrogen	A11122	1:300 dilüsyon
GFP	Rat (M)	Nacalai tesque	04404-84	1:1000 dilüsyon
GFP	Civciv (P)	Chemicon	P42212	1:300 dilüsyon

Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
ß-gal	Tavşan (P)	MP Biyomedikal	55976	1:5000 dilüsyon
ß-gal	Keçi (P)	Abd Serotec	4600-1409	1:500 dilüsyon
ß-gal	Civciv (P)	Abcam	ab9361	1:200 oranında seyreltildiğinde

Antikor	Tür	Şirket	Katalog #	Çalışma şartları
2H3	Fare (M) # 7	Hibridoma Bankası	2H3	1:200 oranında seyreltildiğinde
Tuj1	Fare (M) # 8	Covance	MMS-435P	1:500 dilüsyon
Peripherin	Tavşan (P)	Chemicon	AB1530	1:1000 dilüsyon

BFABP

Tavşan (P)

Thomas Müller laboratuvar # 9

1:3000 dilüsyon