Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Zusammenfassung

Wir stellen Ihnen eine ganze-mount Immunhistochemie und konfokaler mit mehreren Kennzeichnung für die Analyse von komplizierten Gefäßnetz Bildung in embryonalen Maus Gliedmaßen Haut.

Zusammenfassung

Whole-mount immunhistochemische Analyse zur Abbildung des gesamten Gefäßsystem ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der zellulären Mechanismen der Verzweigung Morphogenese. Wir haben das Bein Haut Gefäßsystem Modell der vaskulären Entwicklung, in der eine bereits bestehende primitive Kapillarplexus in eine hierarchisch verzweigten Gefäßnetz reorganisiert wird Studie entwickelt. Whole-mount konfokalen Mikroskopie mit mehreren Kennzeichnung ermöglicht robuste Bildgebung von intakten Blutgefäßen sowie deren zelluläre Komponenten, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und glatte Muskelzellen, mit spezifischen fluoreszierenden Marker. Advances in diesem Teil der Haut Gefäßsystem Modell mit genetischen Studien haben ein besseres Verständnis molekularer Mechanismen der vaskulären Entwicklung und Strukturierung. Das Glied Haut Gefäßsystem Modell wurde verwendet, zu untersuchen, wie peripheren Nerven eine räumliche Vorlage liefern für die Differenzierung und Strukturierung von Arterien. Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache und robuste Protokoll zu intakten Blutgefäßen mit vaskulären spezifische Antikörper und fluoreszierende Sekundärantikörper werden, die für vaskularisierte embryonale Organe, wo wir in der Lage sind, den Prozess der vaskulären Entwicklung folgen Fleck.

Protokoll

1. Sammeln embryonalen Maus-Limb Skin (E13.5 ~ E17.5)

1. Euthanize gesteckt Weibchen durch zugelassene Verfahren. Nach unseren zugelassenen Tier-Protokoll sind die Weibchen von CO ₂ Belastung eingeschläfert und dann durch Genickbruch gewährleistet. Legen Sie das Tier auf seinen saugfähigen Papiertuch und legen Sie ihn gründlich in 70% EtOH / H ₂ O aus einer Spritzflasche.
2. Präparieren Sie die Gebärmutter intakt und legen Sie sie in einem 100 x 15 mm Petrischale mit eiskaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) zu waschen Blut.
3. Separate und sezieren des Embryos. Entfernen Sie die sehr dünne Amnion aus dem Embryo.
4. (Option) Dissect eines einzigen Embryos in einem 35 x 10 mm Petrischale, wenn jeder Embryo muss genotypisiert werden. Dissected Schwanz ist ein 0,2 ml PCR-Röhrchen für die Genotypisierung übertragen.
5. Schneiden Sie die Vorderbeine des Embryos und Transfer Vorderbeine durch einen Ring Pinzette in 24-Well-Platte mit 2 ml eiskaltem frischen 4% Paraformaldehyd (PFA) in Phosphatpuffer Saline (PBS).
6. Fix die Vorderbeine mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei 4 ° C über Nacht.
7. Am folgenden Tag, entfernen Sie die PFA und waschen dreimal für 5 min in 2 ml PBS mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
8. Übertragen Sie die Vorderbeine in 100% Methanol (MeOH) und speichert sie bei -20 ° C Enzym Gefrierschrank (Gefrierschrank mit kritischen Temperatur-Steuerung und ohne automatische Abtauung). Primärantikörper in Tabelle 1 der Arbeit nach der 100% MeOH Behandlung aufgeführt.
9. Peel off Haut aus dem Vorderbein mit feinen Pinzette. Limb Haut, wenn entwässert, sollte einfach zu trennen von der Extremität. Der erste Platz der Extremität mit Bauchseite (Handfläche) nach oben. Dann mit feinen Pinzetten, schneiden Sie die Haut wie im Video gezeigt. Next um den gesamten Leib sezieren, Peeling die Haut sanft, ohne Schäden.

2. Whole-mount immunhistochemische Färbung von Limb Skins

1. Rehydrieren die Extremität Skins in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr durch Inkubation durch die abgestufte Reihe von MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) für jeweils 5 min. Beachten Sie, dass der Austausch-Lösungen sollten vorsichtig sein, um eine Beschädigung des Körpers skins.
2. Zweimal waschen für 5 min in PBT mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
3. Blockieren Sie die Gliedmaßen Skins entweder mit 10% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 Blockierungspuffer für Ziege Sekundärantikörper oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100 Blockierungspuffer für Esel Sekundärantikörper für 2 Stunden unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
4. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 2ml-Reaktionsgefäß mit 800μl des primären Antikörpern (entsprechender Verdünnung in den Tabellen aufgeführt) in den Blocking-Puffer (entweder 10% Ziegenserum / PBS + 0,2 % TX100 oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). Inkubieren der Extremität Skins mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei 4 ° C über Nacht. Beachten Sie, dass mehrere primäre Antikörper aus verschiedenen Spezies (zB Ratte monoklonale Antikörper + polyklonalen Kaninchen-Antikörper) abgeleitet gleichzeitig genutzt werden können.
5. Am folgenden Tag, Ort der Extremität Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2 % Donkey Serum / PBS +0,2% TX100).
6. Wash fünfmal für 15 min unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
7. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 2ml-Reaktionsgefäß mit 800μl der Sekundärantikörper in den Blocking-Puffer (entweder 10% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). In der Regel verwenden wir Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 Verdünnungen) oder Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 Verdünnung). Filtern Sie die sekundären Antikörper-Lösung mit 0,22 &mgr; m PVDF-Membran Spritzenfilter, um aggregierte Partikel der sekundären Antikörper zu entfernen. Inkubieren der Extremität Skins im Dunkeln oder mit Alufolie umwickelt für 1 Stunde mit leichtem Rühren auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass verschiedene fluoreszierende konjugierte sekundäre Antikörper von verschiedenen Spezies abgeleitet gleichzeitig genutzt werden können.
8. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). Wash fünfmal für 15 min im Dunkeln oder umwickelt mit Alufolie mit leichtem Rühren auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
9. (Option für die Gegenfärbung gegen Kern) Inkubieren der Extremität Skins mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100) mit To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 Verdünnung) in der Dunkelheit oder umwickelt mit Alufolie für 10 min unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Zimmertemperatur Temre. Dann waschen dreimal 5 min mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100) im Dunkeln oder durch Aluminium-Folie mit leichtem Rühren auf gewickelt dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass starke und spezifische Färbung für Keime für Um-pro-3 ist in einer spezifischen Emission (HeNe 633 nm Anregung) beobachtet.

3. Montage des Limb Skins auf Slide

1. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale. Entfernen Sie Staub, Kristallen, Fasern von der inneren Schicht der Haut mit feinen Pinzetten unter dem Stereomikroskop mit geringer Beleuchtung auf umfangreiche Foto Bleichen zu vermeiden.
2. Übertragen Sie die Extremitäten Skins, um Klebstoff Objektträger durch einen Ring Pinzette. Legen Sie die Haut mit der inneren Schicht liegt oben auf der Folie (dh in Richtung Deckglas). Flatten die Felle sorgfältig mit feinen Pinzette und entfernen carry-over Waschpuffer durch Kimwipe.
3. Berg in anti-fade Montage Medien ohne Luftblasen. Wir verwenden 25 "x25" Deckglas. Cure auf einer ebenen Fläche in der Dunkelheit (zB montiert die Proben unter Verwendung ProLong Gold-Reagenz werden über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur vorgelegt, bevor viewing). Für die langfristige Lagerung, Deckglasränder, um die Folie und lagern bei 4 ° C.

4. Konfokale Mikroskopie

1. Richten Sie entsprechende Laser für Fluorophore. Wir verwenden Leica TCS SP5 konfokalen Mikroskop mit drei Laserquellen mit Argon 488nm (für Alexa Fluor 488 und GFP), DPSS 561nm (für Alexa Fluor 568 und Cy3) und HeNe 633nm (für Alexa Fluor 633, Cy5 und To-Pro-3) .
2. Verwenden sequenziellen Scan-Tool zu vermeiden oder zu vermindern das Übersprechen in dem alle Farbstoffe in Doppel-oder Dreifach-gefärbten Proben gleichzeitig begeistert sein. In der sequentiellen Scan-Modus, werden die Bilder in einer sequenziellen Reihenfolge aufgezeichnet werden.
3. Weitere allgemeine Informationen über Fluoreszenzfarbstoffe und Laser für die Anregung kann in "Die konfokale Mikroskopie für Biologen" gegründet werden, indem Hibbs (2004)

5. Repräsentative Ergebnisse

Whole-mount Triple-Label konfokalen Mikroskopie in immnofluorescence Maus forelimb Haut an E15.5 mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (Abbildung 1A-C, D blau), die Neurofilament Marker 2H3 (Abbildung 1A grün) und die glatte Muskelzelle Marker αSMA (Abbildung 1A, B rot) zeigte eine charakteristische Verzweigungsmuster αSMA ⁺ Arterien, mit 2H3 ⁺ peripheren Nerven in den Gliedmaßen Haut ausgerichtet. Neben der Blutgefäße Verzweigungen, ist dieser Teil der Haut Gefäßsystem Modell zur Strukturierung von Lymphgefäßsystem Verzweigung mit Antikörpern gegen das lymphatische Endothel-Zell-Marker LYVE-1 (Abb. 1D, E rot) und Neuropilin2 (NRP2) (Abbildung 1D-, F grün-Studie ).

Abbildung 1. (AC) Arterien align mit peripheren Nerven in der embryonalen Körpers Haut. Whole-mount Triple-Label konfokalen Mikroskopie immnofluorescence mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (AC, blau), die Neurofilament Marker 2H3 (A, grün) und der glatten Muskelzellen Marker αSMA (A und B, rot ) gezeigt. Am E15.5, 2H3 ⁺ peripheren Nerven (offene Pfeile) assoziieren mit Arterien (Pfeilspitzen), die durch αSMA abgedeckt werden ⁺ glatten Muskelzellen. (DF) Lymphgefäßsystems in der embryonalen Körpers Haut. Triple-Label konfokalen Mikroskopie immnofluorescence mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (D, blau), des lymphatischen Endothelzellen Marker LYVE-1 (D und E, rot) und Neuropilin2 (NRP2) (D und F, grün ) gezeigt. Lymphgefäße werden visualisiert sowohl LYVE-1 und NRP2, während LYVE-1 wird auch durch eine Teilmenge von Makrophagen (offene Pfeilspitzen) ausgedrückt. Maßstab: 100 um.

Diskussion

Das Gefäßsystem ist entscheidend für die Entwicklung der Organe während der Embryonalentwicklung sowie für Orgel Wartung und reproduktiven Funktionen in die Erwachsenen, weil es genügend Sauerstoff und Nährstoffe zu den Organen liefert. Proper Gefäßnetz ist mit komplexen und mehrstufigen Verfahren durch Angiogenese, in dem bereits bestehenden Netz von Kapillaren mit stark verzweigten und hierarchischen Strukturen neu organisiert ist gut etabliert. Obwohl zahlreiche Arbeiten haben gezeigt worden, dass eine Vielz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
PECAM-1	Armenische Hamster (M)	Chemicon	MAB1398Z	1:100-Verdünnung Nr. 1
PECAM-1	Rat (M)	BD	553369	1:300 Verdünnung
VEGFR2	Rat (M)	eBioscience	14-5821-82	1:200-Verdünnung
CD34	Rat (M)	eBioscience	13-0341	1:300 Verdünnung
Collagen IV	Rabbit (P)	AbD Serotec	2150-1470	1:300 Verdünnung Nr. 2

Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
Neuropilin1	Rabbit (P)	Der Alex Kolodkin Labor # 3		1:3000 Verdünnung
Unc5H2	Goat (P)	R & D	AF1006	1:200-Verdünnung

Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
EphB4	Goat (P)	R & D	AF446	1:100-Verdünnung

Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
LYVE-1 Nr. 4	Rabbit (P)	Abcam	ab14917	1:200-Verdünnung
LYVE-1 Nr. 4	Rat (M)	MBL	D225-3	1:200-Verdünnung
Prox-1	Rabbit (P)	Chemicon	AB5475	1:1000-Verdünnung
Prox-1	Goat (P)	R & D	AF2727	1:50-Verdünnung
Neuropilin2	Rabbit (P)	Cell Signaling	3366	1; 100-Verdünnung
Podoplanin	Goldhamster (M)	Hybridoma der Bank	8.1.1	1:200-Verdünnung

Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
αSMA-Cy3	Maus (M) # 5	Sigma	c-6198	1:500-Verdünnung Nr. 6
NG2	Rabbit (P)	Chemicon	AB5320	1:200-Verdünnung
SM22α	Rabbit (P)	Abcam	ab14106	1:200-Verdünnung

Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
GFP	Rabbit (P)	Invitrogen	A11122	1:300 Verdünnung
GFP	Rat (M)	Nacalai Tesque	04404-84	1:1000-Verdünnung
GFP	Chick (P)	Chemicon	P42212	1:300 Verdünnung

Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
β-gal	Rabbit (P)	MP Biomedical	55976	1:5000 Verdünnung
β-gal	Goat (P)	AbD Serotec	4600-1409	1:500 Verdünnung
β-gal	Chick (P)	Abcam	ab9361	1:200-Verdünnung

Antikörper	Spezies	Firma	Katalog #	Arbeitsbedingung
2H3	Maus (M) # 7	Hybridoma der Bank	2H3	1:200-Verdünnung
Tuj1	Maus (M) # 8	Covance	MMS-435P	1:500 Verdünnung
Peripherin	Rabbit (P)	Chemicon	AB1530	1:1000-Verdünnung

BFABP

Rabbit (P)

Die Thomas Müller-Labor Nr. 9

1:3000 Verdünnung