Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Resumo

Nós introduzimos um conjunto de montagem imunohistoquímica e microscopia confocal de varredura a laser com vários rotulagem para analisar a formação de uma intrincada rede vascular em pele de rato membro embrionárias.

Resumo

Todo-mount análise imunohistoquímica para a imagem latente toda a vasculatura é fundamental para a compreensão dos mecanismos celulares de ramificação morfogênese. Nós desenvolvemos o membro modelo vascularização da pele para estudar o desenvolvimento vascular em que um pré-existentes primitiva do plexo capilar é reorganizado em uma rede hierarquicamente ramificada vascular. Todo-mount microscopia confocal com rotulagem múltiplos permite imagem robusta dos vasos sanguíneos intacta, assim como seus componentes celulares, incluindo células endoteliais, pericitos e células musculares lisas, usando marcadores fluorescentes específicos. Avanços neste modelo vasculatura membro pele com estudos genéticos têm melhorado a compreensão dos mecanismos moleculares do desenvolvimento vascular e padronização. O membro modelo vasculatura da pele tem sido usada para estudar como os nervos periféricos fornecer um modelo espacial para a diferenciação e padronização das artérias. Este artigo descreve um protocolo de vídeo simples e robusto para corar vasos sanguíneos vascular intacto com anticorpos específicos e fluorescentes anticorpos secundários, que é aplicável para os órgãos vascularizados embrionárias, onde somos capazes de acompanhar o processo de desenvolvimento vascular.

Protocolo

1. Coleta de rato Pele Limb embrionárias (E13.5 E17.5 ~)

1. Euthanize conectado fêmeas através de um procedimento aprovado. De acordo com nosso protocolo aprovado animais, as fêmeas são sacrificados por exposição ao CO ₂ e, em seguida, assegurada por deslocamento cervical. Lay o animal à sua toalha de papel absorvente e deixe-o completamente em 70% EtOH / H ₂ O de uma garrafa squeeze.
2. Dissecar o útero intacto e coloque-o em um prato 100 15 mm x Petri contendo solução gelada de Hanks salina balanceada (HBSS) para lavar o sangue.
3. Separado e dissecar o embrião. Remover o âmnio muito fina a partir do embrião.
4. (Opção) Dissecar um único embrião em um 35 10 mm x placa de Petri se cada embrião deve ser genotipados. Dissecados cauda é transferido para um tubo de 0,2 ml PCR para genotipagem.
5. Cortar as patas dianteiras do embrião e transferência forelimbs por uma pinça de anel em 24 placa bem contendo 2 ml de gelado paraformaldeído frescos 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS).
6. Corrigir o forelimbs com suave mistura na Mixer Nutator a 4 ° C durante a noite.
7. No dia seguinte, retire a PFA e lavar três vezes por 5 min em 2 ml de PBS com leve mistura no Mixer Nutator à temperatura ambiente.
8. Transferir os membros anteriores em metanol 100% (MeOH) e armazená-los freezer a -20 ° C enzima (o freezer com controle de temperatura crítica e sem função de descongelação automática). Anticorpos primárias constantes da Tabela 1 trabalho após o tratamento MeOH 100%.
9. Peeling off do membro anterior, usando uma pinça fina. Pele dos membros, quando desidratado, deve separar facilmente a partir do membro. Primeiro lugar o membro com o lado ventral (lado da palma) voltado para cima. Em seguida, usando uma pinça fina, cortar a pele, como mostrado no vídeo. Próxima dissecar todo o membro inteiro, descascando a pele suavemente, sem qualquer dano.

2. Toda montagem de coloração imuno-histoquímica de Skins Limb

1. Hidratar as peles de membros em 5ml de polipropileno tubos de fundo redondo, incubando através da série graduada de MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) por 5 min cada. Note-se que a troca de soluções deve ser cuidadoso para não danificar as peles dos membros.
2. Lavar duas vezes por 5 min em PBT com suave mistura na Mixer Nutator à temperatura ambiente.
3. Bloquear o membro com peles de cabra ou 10% de soro / PBS 0,2% TX100 tampão de bloqueio por anticorpos de cabra secundário ou 10% Donkey soro / PBS 0,2% TX100 tampão de bloqueio por anticorpos burro secundário por 2 horas com a mistura suave no Mixer Nutator em temperatura ambiente.
4. Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em microcentrífuga-2ml tubo com 800μl de anticorpos primários (diluição adequada, conforme listado nas tabelas) no tampão de bloqueio (ou 10% de soro de cabra / PBS 0,2 TX100% ou 10% Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Incubar as peles membro com suave mistura na Mixer Nutator a 4 ° C durante a noite. Note-se que vários anticorpos primários derivados de espécies diferentes (por exemplo, anticorpo monoclonal de rato + anticorpo policlonal de coelho) podem ser usados ​​simultaneamente.
5. No dia seguinte, coloque as peles do membro em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em polipropileno 5ml de fundo redondo de tubo com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2 TX100 Donkey% de soro / PBS 0,2% TX100).
6. Lavar cinco vezes por 15 minutos com a mistura suave no Mixer Nutator à temperatura ambiente.
7. Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em microcentrífuga-2ml tubo com 800μl de anticorpos secundária no tampão de bloqueio (ou 10% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 10% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Normalmente usamos anticorpos secundários a partir de Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 diluições) ou Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 diluição). Filtrar a solução usando anticorpo secundário 0.22μm PVDF filtros de membrana seringa para remover as partículas agregadas dos anticorpos secundários. Incubar as peles dos membros no escuro ou envolto com papel alumínio por 1 hora com a mistura suave na Mixer Nutator à temperatura ambiente. Note-se que diferentes fluorescentes conjugados anticorpos secundários derivados de espécies diferentes podem ser usados ​​simultaneamente.
8. Coloque as cascas dos membros em um prato de 35 10 mm x Petri e transferência por uma pinça anel em 5ml de polipropileno tubos de fundo redondo com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100). Lavar cinco vezes por 15 min no escuro ou envolto com folha de alumínio com a mistura suave no Mixer Nutator à temperatura ambiente.
9. (Opção para contracoloração contra núcleo) Incubar as peles membro com 4ml da solução de lavagem (ou cabra 2% de soro / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100) com To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 diluição) no escuro ou envolto com papel alumínio por 10 minutos com a mistura suave no Mixer Nutator na sala de temperature. Então, lave três vezes por 5 min com 4ml da solução de lavagem (ou 2% de soro de cabra / PBS 0,2% ou 2% TX100 Donkey soro / PBS 0,2% TX100) no escuro ou envolto por folhas de alumínio com a mistura suave no o Mixer Nutator à temperatura ambiente. Note-se que a coloração forte e específica para núcleos é observado para To-pro-3 em uma emissão específica (HeNe excitação nm 633).

3. Montagem do Skins Limb no slide

1. Coloque as cascas em um membro 35 10 mm x placa de Petri. Remover poeiras, cristais, fibras da camada interna da pele, usando uma pinça fina sob o estereomicroscópio com iluminação baixa para evitar a foto branqueamento extensivo.
2. Transferir os skins membro para lâmina de microscópio adesiva por uma pinça de anel. Coloque as peles com a camada interna deitada para cima no slide (ou seja, para lamela). Achate as peles cuidadosamente usando uma pinça fina e remover carry-over tampão de lavagem por Kimwipe.
3. Montagem em anti-fade meios de montagem sem bolhas de ar. Nós usamos 25 "x25" lamela. Cura em uma superfície plana no escuro (por exemplo, as amostras montado usando Prolongar reagente de ouro são colocadas durante a noite no escuro à temperatura ambiente antes de visualizar). Para armazenamento a longo prazo, vedar a lamela para o slide e armazenar a 4 ° C.

4. Microscopia confocal

1. Criar lasers apropriados para fluoróforos. Usamos Leica TCS microscópio confocal SP5 com três fontes de laser de argônio, incluindo 488nm (para Alexa Fluor 488 e GFP), 561nm DPSS (por Alexa Fluor 568 e Cy3) e 633 nm HeNe (por Alexa Fluor 633, Cy5 e Para-Pro-3) .
2. Use a ferramenta de busca sequencial para evitar ou reduzir a interferência em que todos os corantes em amostras de dobrar ou triplicar manchada será animado ao mesmo tempo. No modo de varredura seqüencial, as imagens serão gravadas em uma ordem seqüencial.
3. Mais informações gerais sobre corantes fluorescentes e lasers para a excitação pode ser fundada em "Microscopia Confocal para biólogos" por Hibbs (2004)

5. Resultados representante

Todo-mount microscopia confocal triple-label immnofluorescence em pele de rato forelimb em E15.5 com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (Figura 1A-C, D azul), o marcador neurofilamento 2H3 (Figura 1A verde), e o marcador de células musculares lisas αSMA (Figura 1A, B vermelho) revelou um padrão característico de ramificação das artérias αSMA ^+, alinhado com 2H3 ⁺ nervos periféricos na pele dos membros. Além de ramificação dos vasos sanguíneos, este membro modelo vascularização da pele é usada para estudar padrões de ramificação de vasos linfáticos utilizando anticorpos para o marcador de células endoteliais linfáticas lyve-1 (Figura 1D, E vermelha) e Neuropilin2 (NRP2) (Figura 1D, F verde ).

Figura 1. (AC) Artérias alinhar com os nervos periféricos na pele dos membros embrionárias. Todo-mount-label triple microscopia confocal immnofluorescence com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (AC, azul), o marcador neurofilamento 2H3 (A, verde), eo marcador de células musculares lisas αSMA (A e B, vermelho ) é mostrado. No E15.5, 2H3 ⁺ nervos periféricos (setas abertas) associado com artérias (setas), que são cobertos por αSMA ⁺ células musculares lisas. (DF) vasculatura linfática na pele dos membros embrionárias. Label triple-microscopia confocal immnofluorescence com anticorpos para o marcador de células pan-endotelial PECAM-1 (D, azul), o marcador de células endoteliais linfáticas lyve-1 (D e E, vermelho) e Neuropilin2 (NRP2) (D e F, verde ) é mostrado. Vasos linfáticos são visualizados por ambos lyve-1 e NRP2, enquanto lyve-1 também é expressa por um subconjunto de macrófagos (setas abertas). Barra de escala: 100μm.

Discussão

O sistema vascular é fundamental para o desenvolvimento do órgão durante a embriogênese, bem como para a manutenção de órgãos e funções reprodutivas nos adultos, pois fornece oxigênio e nutrientes suficientes para os órgãos. Rede vascular adequada é bem estabelecido com processos complexos e multi-passo a angiogênese em que o pré-existentes da rede capilar é reorganizada com estruturas altamente ramificada e hierarquizada. Apesar de inúmeros trabalhos têm demonstrado que uma variedade de moléculas es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
PECAM-1	Hamster Armenian (M)	Chemicon	MAB1398Z	Diluição 1:100 # 1
PECAM-1	Rat (M)	BD	553369	1:300 diluição
VEGFR2	Rat (M)	eBioscience	14-5821-82	Diluição de 1:200
CD34	Rat (M)	eBioscience	13-0341	1:300 diluição
Colágeno IV	Coelho (P)	AbD Serotec	2150-1470	1:300 diluição # 2

Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
Neuropilin1	Coelho (P)	O laboratório Kolodkin Alex # 3		1:3000 diluição
Unc5H2	Bode (P)	R & D	AF1006	Diluição de 1:200

Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
EphB4	Bode (P)	R & D	AF446	Diluição 1:100

Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
Lyve-1 # 4	Coelho (P)	Abcam	ab14917	Diluição de 1:200
Lyve-1 # 4	Rat (M)	MBL	D225-3	Diluição de 1:200
Prox-1	Coelho (P)	Chemicon	AB5475	1:1000 diluição
Prox-1	Bode (P)	R & D	AF2727	01:50 diluição
Neuropilin2	Coelho (P)	Sinalização celular	3366	1, 100 de diluição
Podoplanin	Hamster sírio (M)	Hibridoma Banco	8.1.1	Diluição de 1:200

Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
αSMA-Cy3	Mouse (M) # 5	Sigma	c-6198	1:500 diluição # 6
NG2	Coelho (P)	Chemicon	AB5320	Diluição de 1:200
SM22α	Coelho (P)	Abcam	ab14106	Diluição de 1:200

Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
GFP	Coelho (P)	Invitrogen	A11122	1:300 diluição
GFP	Rat (M)	Nacalai tesque	04404-84	1:1000 diluição
GFP	Chick (P)	Chemicon	P42212	1:300 diluição

Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
β-gal	Coelho (P)	MP Biomédica	55976	1:5000 diluição
β-gal	Bode (P)	AbD Serotec	4600-1409	1:500 diluição
β-gal	Chick (P)	Abcam	ab9361	Diluição de 1:200

Anticorpo	Espécies	Companhia	Catálogo #	Condição de trabalho
2H3	Mouse (M) # 7	Hibridoma Banco	2H3	Diluição de 1:200
Tuj1	Mouse (M) # 8	Covance	MMS-435P	1:500 diluição
Periferina	Coelho (P)	Chemicon	AB1530	1:1000 diluição

BFABP

Coelho (P)

O laboratório de Thomas Müller # 9

1:3000 diluição