Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Резюме

Введем целом монтажа иммуногистохимии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с несколькими маркировки для анализа сложных сосудистых формирование сети в мышиных эмбриональных коже конечностей.

Аннотация

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для работы с изображениями всего сосудистая сеть имеет решающее значение для понимания клеточных механизмов ветвления морфогенеза. Мы разработали сосудистой коже конечностей модель для изучения развития сосудов, в которых уже существующих примитивных капиллярного сплетения реорганизован в иерархически разветвленной сосудистой сети. Всего монтажа конфокальной микроскопии с несколькими маркировки позволяет надежной визуализации интактных кровеносных сосудов, а также их клеточных компонентов, включая эндотелиальные клетки, перицитов и гладкомышечных клеток, с использованием специфических флуоресцентных маркеров. Достижения в этой сосудистой коже конечностей модель с генетические исследования лучшему пониманию молекулярных механизмов развития сосудов и кучность стрельбы. Сосудистой коже конечностей модель была использована для изучения того, как периферические нервы обеспечивают пространственную шаблон для дифференциации и структурирования артерий. Это видео статье описан простой и надежный протокол пятно нетронутыми сосуды с сосудистыми специфических антител и флуоресцентного вторичными антителами, которая применима для васкуляризированной органов эмбриональных, где мы имеем возможность следить за процессом развития сосудов.

протокол

1. Сбор мышиных эмбриональных кожи конечностей (E13.5 ~ E17.5)

1. Эвтаназии подключен самок утвержденной процедурой. По нашим утвержденный протокол животных, самки эвтаназии СО ₂ воздействия, а затем обеспечивается шейки дислокации. Положите животное на своих абсорбирующих бумажное полотенце и положите его полностью в 70% EtOH / H ₂ O из бутыли.
2. Рассекать матку нетронутой и поместить его в 100 х 15 мм чашки Петри содержащих сбалансированный солевой ледяной Хэнкса Решение (HBSS), чтобы смыть кровь.
3. Отдельный и анализировать эмбриона. Удалить очень тонкие амнион из эмбриона.
4. (Опция) Рассеките одного эмбриона в 35 х 10 мм блюдо Петри, если каждый эмбрион необходимо генотипирование. Расчлененный хвост передается 0,2 мл ПЦР трубка для генотипирования.
5. Отрежьте передние конечности эмбриона и передачи передние конечности от кольца щипцов в 24-луночный планшет, содержащий 2 мл ледяной свежей 4% Параформальдегид (PFA) в фосфатном буфере физиологический раствор (PBS).
6. Fix передние конечности с нежным перемешивания на Nutator смесителя при температуре 4 ° С в течение ночи.
7. На следующий день, удалить PFA и мыть три раза в течение 5 мин в 2 мл PBS с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
8. Передача передние конечности в 100% метанола (метанол) и хранить их при температуре -20 ° C фермент морозильник (морозильная камера с критической контроля температуры и без функции автоматического размораживания). Первичные антитела, перечисленных в таблице 1 работы после 100% MeOH лечения.
9. Снимите кожу от передних конечностей с использованием тонких пинцетом. Лимб кожи, когда обезвоженной, должен легко отделить от конечностей. Первое место конечности с брюшной стороны (пальмовое сторона) вверх. Затем с помощью тонкой пинцет, разрезать кожу, как показано на видео. Следующая рассекать вокруг всей конечности, шелушение кожи от нежно без каких-либо повреждений.

2. Всего монтажа иммуногистохимического окрашивания конечностей Скины

1. Увлажняет конечностей шкуры в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки путем инкубации через градуированные серии MeOH / PBT (PBS + 0,2% Тритон Х-100) (75%, 50%, 25%) в течение 5 минут каждый. Обратите внимание, что обмен решения должны быть осторожны, чтобы не повредить конечности скинов.
2. Мыть два раза в течение 5 мин в PBT с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
3. Блок конечностей шкуры или с 10% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 блокирующего буфера для коз вторичными антителами, или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100 блокирующего буфера для осла вторичными антителами в течение 2 часов с нежным перемешивания на Nutator смесителя на комнатной температуре.
4. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу в 2 мл щипцы-микроцентрифужных трубка с 800μl первичных антител (соответствующего разбавления, перечисленных в таблицах) в блокирующем буфере (или 10% сыворотки козьего / PBS 0,2 TX100% или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Инкубируйте конечностей шкуры с мягким перемешивания на Nutator смесителя при температуре 4 ° С в течение ночи. Обратите внимание, что несколько первичных антител, полученных из различных видов (например, крысы моноклональное антитело + кролик поликлональных антител) могут использоваться одновременно.
5. На следующий день, место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу щипцов в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS 0,2% или 2 TX100 Осел% сыворотки / PBS +0,2% TX100).
6. Вымойте пять раз в течение 15 мин с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
7. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу в 2 мл щипцы-микроцентрифужных трубка с 800μl вторичного антитела в блокирующем буфере (или 10% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Обычно мы используем вторичные антитела от Джексона ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 разведения) или Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 разведение). Фильтры вторичных решение антител при 0.22μm PVDF мембранных фильтров шприц для удаления агрегированных частиц вторичных антител. Инкубируйте конечностей шкуры в темноте или обернуты алюминиевой фольгой в течение 1 часа с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре. Обратите внимание, что различные флуоресцентные сопряженных вторичными антителами, полученных из различных видов могут быть использованы одновременно.
8. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу щипцов в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Вымойте пять раз в течение 15 мин в темноте или обернуты алюминиевой фольгой с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
9. (Вариант для counterstaining против ядра) Инкубируйте конечностей шкуры с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100) с К-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 разбавления) в темное время суток или завернутые с алюминиевой фольгой в течение 10 мин с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной temperatuповторно. Затем вымыть три раза в течение 5 мин с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100) в темное время суток или в оболочку из алюминиевой фольги с мягким перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре. Обратите внимание, что сильный и специфического окрашивания для ядер наблюдается To-PRO-3 в удельных выбросов (гелий-неоновый 633 нм возбуждение).

3. Монтаж Limb Скины на слайде

1. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм блюдо Петри. Удаление пыли, кристаллы, волокна от внутреннего слоя шкуры с использованием тонких пинцетом под стереомикроскопа с низкой освещенности, чтобы избежать обширных фото отбеливание.
2. Передача конечностей шкуры клея микроскопических слайд кольца щипцов. Место кожи с внутренним слоем лежал вверх на слайде (т.е. к покровным). Свести шкуры тщательно с использованием тонких пинцет и удалите переноса моющий буфер Kimwipe.
3. Горы в анти-Fade монтажа СМИ без пузырьков воздуха. Мы используем 25 "x25" покровным. Лечение на плоской поверхности в темное время суток (например, образцы смонтированы командами Продли Золотой реагента размещены на ночь в темноте при комнатной температуре перед просмотром). Для длительного хранения, печать покровное для слайдов и хранить при 4 ° C.

4. Конфокальной микроскопии

1. Настройка соответствующих лазеров для флуорофоров. Мы используем Leica TCS SP5 конфокальной микроскопии с тремя лазерных источников, включая Аргон 488nm (для Alexa Fluor 488 и GFP), DPSS 561nm (для Alexa Fluor 568 и Cy3) и гелий-неоновый 633 нм (для Alexa Fluor 633, Cy5 и To-Pro-3) .
2. Использование последовательного инструмент сканирования, чтобы избежать или уменьшить перекрестные помехи, в котором все красители в двойной или тройной окрашенных образцов будут в восторге, в то же время. В последовательном режиме сканирования изображения будут записаны в последовательном порядке.
3. Более общие сведения о флуоресцентных красителей и лазеров для возбуждения может быть создан в "конфокальной микроскопии для биологов" по Хиббса (2004)

5. Представитель Результаты

Всего монтажа тройной этикетки конфокальной микроскопии в immnofluorescence мыши лапы кожу на E15.5 с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (рис. 1А-C, D синий), нейрофиламентов маркер 2H3 (рис. 1А зеленый), и гладкие мышечные клетки маркером αSMA (рис. 1а, б красный) показало, характерные ветвящиеся структуры αSMA ⁺ артерий, в соответствие с 2H3 ⁺ периферических нервов конечностей в кожу. В дополнение к ветвления кровеносных сосудов, это сосудистой коже конечностей модель используется для изучения паттернов лимфатический сосуд ветвления с использованием антител к эндотелиальной лимфатической маркер ячейки LYVE-1 (Рис. 1D, E красный) и Neuropilin2 (NRP2) (рис. 1D, F зеленый ).

Рисунок 1. (AC) Артерии согласования с периферических нервов в эмбриональной коже конечностей. Всего монтажа тройной этикетки конфокальной микроскопии immnofluorescence с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (AC, синий), нейрофиламентов маркер 2H3 (зеленый) и гладкие мышечные клетки маркером αSMA (А и В, красный ) показано. На E15.5, 2H3 ⁺ периферических нервов (открытые стрелки) ассоциируется с артериями (наконечники стрел), на которые распространяются αSMA ⁺ гладкомышечных клеток. (DF) лимфатической сосудистой в эмбриональной коже конечностей. Triple-этикетку конфокальной микроскопии immnofluorescence с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (D, синий), лимфатических эндотелиальных маркер ячейки LYVE-1 (D и Е, красный) и Neuropilin2 (NRP2) (D и F, зеленый ) показано. Лимфатические сосуды визуализируются как LYVE-1 и NRP2, в то время LYVE-1 выражается также подмножество макрофагов (открытый наконечники стрел). Шкала бар: 100 мкм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Сосудистой системы имеет решающее значение для развития органов во время эмбриогенеза, а также для обслуживания органов и репродуктивных функций у взрослых, потому что он поставляет достаточное количество кислорода и питательных веществ к органам. Правильное сосудистой сети хорошо ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
PECAM-1	Армянский хомячка (М)	Chemicon	MAB1398Z	1:100 разбавления # 1
PECAM-1	Крыса (М)	BD	553369	1:300 разбавления
VEGFR2	Крыса (М)	eBioscience	14-5821-82	1:200 разбавления
CD34	Крыса (М)	eBioscience	13-0341	1:300 разбавления
Коллаген IV	Кролик (Р)	Абд Serotec	2150-1470	1:300 разбавления # 2

Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
Neuropilin1	Кролик (Р)	Алексей Колодкин в лаборатории № 3		1:3000 разбавления
Unc5H2	Коза (Р)	R & D	AF1006	1:200 разбавления

Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
EphB4	Коза (Р)	R & D	AF446	1:100 разбавления

Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
LYVE-1 № 4	Кролик (Р)	Abcam	ab14917	1:200 разбавления
LYVE-1 № 4	Крыса (М)	MBL	D225-3	1:200 разбавления
Prox-1	Кролик (Р)	Chemicon	AB5475	1:1000 разбавления
Prox-1	Коза (Р)	R & D	AF2727	1:50 разбавления
Neuropilin2	Кролик (Р)	Сотовые сигнализации	3366	1, 100 разбавления
Podoplanin	Сирийский хомячок (М)	Гибридома банка	8.1.1	1:200 разбавления

Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
αSMA-Cу3	Мышь (М) # 5	Сигма	с-6198	1:500 разбавления # 6
NG2	Кролик (Р)	Chemicon	AB5320	1:200 разбавления
SM22α	Кролик (Р)	Abcam	ab14106	1:200 разбавления

Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
GFP	Кролик (Р)	Invitrogen	A11122	1:300 разбавления
GFP	Крыса (М)	Nacalai tesque	04404-84	1:1000 разбавления
GFP	Чик (Р)	Chemicon	P42212	1:300 разбавления

Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
β-гал	Кролик (Р)	Депутат биомедицинских	55976	1:5000 разбавления
β-гал	Коза (Р)	Абд Serotec	4600-1409	1:500 разбавления
β-гал	Чик (Р)	Abcam	ab9361	1:200 разбавления

Антитело	Вид	Компания	Catalogue #	Рабочее состояние
2H3	Мышь (М) # 7	Гибридома банка	2H3	1:200 разбавления
Tuj1	Мышь (М) # 8	Covance	MMS-435P	1:500 разбавления
Peripherin	Кролик (Р)	Chemicon	AB1530	1:1000 разбавления

BFABP

Кролик (Р)

Томас Мюллер лаборатории # 9

1:3000 разбавления