Normal ve Anormal İnsan Hematopoezin ex vivo Mimicry

Özet

Hematopoez için 3D kültür sistemi, insan kordon kanı ve lösemiye kemik iliği hücreleri kullanılarak anlatılmıştır. Metodu hücre dışı matris proteinlerine ile kaplanmış bir emici sentetik poliüretan iskele kullanımına dayanmaktadır. Bu yapı iskelesi hücreleri geniş bir uyum sağlamak için uyarlanabilir.

Özet

Kemik iliği (Kİ) mekansal organize hücresel mikro tarafından düzenlenir karmaşık üç boyutlu (3D) doku neyin hematopoez olduğunu nişler ^2-4 denir; hematopoetik kök hücreler kan hücresi oluşumu ¹ sürdürebilmek için benzersiz bir mikro gerektirir. BM nişler organizasyon normal veya malign BM ⁵ işlev veya işlev bozukluğu için önemlidir. Bu nedenle, bir ex vivo taklitçilik kullanılarak in vivo mikro çevresinde daha iyi anlaşılmasını us lökomogenezisin ⁶ arasında, hücresel ve moleküler microenvironmental belirleyicilerini açıklamak konusunda yardımcı olur.

Şu anda, hematopoetik hücreleri ya allojenik ya ksenojenik stromal hücreleri ile birlikte kültür ya da egzojen sitokinlerin ⁸ ilavesiyle gerektiren (2B) iki boyutlu bir doku kültür şişeleri / kuyu-plakaları ⁷ in vitro kültürlenmiştir. Bu şartlar, yapay ve in vivo olarak farklılık 9,10 farklılaşma ve kaybına neden olabilir anormal yüksek sitokin konsantrasyonları için hücrelerde açığa çıkarırlar içinde mikro.

Burada, in vivo ortamda 3D büyümesini uyaran ve eksojen büyüme faktörlerinin yokluğunda multilinaj hemopoeziste destekler yeni bir 3D kemik iliği kültürü sistemi sunmaktadır. Poliüretan (poliüretan) yapılmış, bu sistemde kullanılan çok gözenekli yapı iskelesi, 2B ^11, geleneksel tek tabakalı kültürden daha yüksek bir spesifik yüzey alanı boyunca yüksek yoğunluklu hücre büyümesini kolaylaştırır. Bizim bu iş modeli insan kanı kordonu (kesici) mononükleer hücreler (MNC) eksojen sitokinlerin yokluğunda ¹² ve birincil lösemi hücre büyümesini desteklenen belirtmiştir. Bu yeni 3D taklit hematopoezisi incelemek ve lösemi için yeni tedavilerin keşfetmek için deneysel insan modelinin geliştirilmesi için uygun bir platform sağlar.

Protokol

1. Iskelelerinin İskele imalatı ve Bio-fonksiyonlandırmalar

1. Petri tabağı disk şeklinde poliüretan iskelesi (100-250 gözenek büyüklüğü mm, gözenekliliği% 90-95) imal etmek için, ardından bir polimer solüsyonu (Dioksan içinde 5wt%) hazırlayarak ısının neden olduğu faz ayırma işlemi kullanan ¹³ donmaya ve müteakip solvent yüceltme (Şekil 1A).
2. ECM proteinleri (Şekil 1B) ile kaplama öncesinde 0.5 x 0.5 x 0.5 mm küpler halinde iskele diski kesin.
3. Sonra 1 dk ve fosfat içine aktarmak için etanol (% 70) onları daldırarak Öncesi ıslak iskeleleri 20 dakika (PBS) tamponlu tuz. Daha sonra 3630 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edilir ve protein çözeltisi ilave edin.
4. 20 dakika boyunca 1420 x g'de protein çözeltisi içinde iskelesi santrifüjlenir.
5. Yüzey boşluklannın engeli ve iskelesi içine derin nüfuz tohumlanmış hücreleri imkan vermek üzere, 10 dakika boyunca 910 x g'de bir kez daha iskeleleri santrifüjPBS içinde.
6. Etanol içinde 2 saat (% 70) için daldırma ile 230 v, 50 Hz, 0.14 A, UV lamba, az 8 dakika maruz kalma bir arada kullanarak iskeleleri sterilize edin. Bundan sonra,% 30 fetal bovin serumu (FBS) ve% 1 penisilin ve streptomisin (P / S) ile desteklenmiş Iscove modifiye Dulbecco Orta (IMDM) eklenmeden önce PBS ile iki kez iskelesi yıkanır. ° C _ve% 5 CO2 kullanımdan önce 37 az 3 gün süreyle nemlendirilmiş bir inkübatörde iskelesi yerleştirin. Steril iskelesi bir 24 well-doku kültür plakaları (kuyu başına bir yapı iskelesi) yerleştirilir.

2. Mononükleer Hücre İzolasyon ve İskele Seeding

1. Ficoll-Paque yoğunluk gradiyenti santrifüj (1500 rpm de 35 dakika) (Şekil 1C) kullanarak, kordon kanı veya lösemi kemik iliği örneklerinden, insan MNC ayıklayın.
2. IMDM in Pastör pipetiyle MNC% 30 FBS ve 1%, P / S içeren
3. Bir mikro-pipet kullanarak iskeleler üzerine MNC süspansiyon Tohum 100μl (2 × 10 ⁶ hücre / iskelet).
4. İskeleler yerleşmeye hücreleri için 10 dakika _boyunca% 5 CO2 altında 37 ° C'de numaralı seribaşı iskeleleri inkübe edin.
5. 37 kuvöz% 30 FBS ve% 1 P / S ve yer kuyucuğu içeren IMDM 1.5 ml ile her yanı kadar kontör ° C ve deneme süresi için% 5 CO _2.
6. Numaralı seribaşı iskelelerinin tüm medya günlük değişime uğrarlar.

3 in situ Hücre Çoğalması ve Morfoloji olarak:. MTS, SEM ve Cytospins

1. MTS deneyi: kültür bir un numaralı seribaşı ve temiz yeni bir 24 iyi plaka iki numaralı seribaşı iskeleler ve yerden çıkarın. Ortamın 1 ml ve 37 MTS çözeltisi ve 3 saat süre ile inkübe edilir ve 200 ul ekleme ° C'de _ve% 5 CO2.
   1. Bir mikroplak okuyucu kullanarak 490 nm'de 96-plaka ve ölçü absorbans yer, üstteki 8 x 100 ul örnek alabilir.
2. Th farklı zaman noktalarında: elektron mikroskobu (SEM)e kültür, medya MNC ile tohumlanan iskeleleri kaldırmak ve 4 40 dakika boyunca% 2.5 PBS-tamponlanmış glutaraldehit çözüm ° C düzeltmek, daha sonra PBS ile iki kez yıkayın.
   1. Susuz 4 saat için aseptik ortamda 10 dakika ve kuru etanol için bir aşamalı dizisi (25, 50, 70, 80, 90, 95, ve% 100), her bir destek mi.
   2. Bölüm örnekleri ve daha sonra önceden SEM değerlendirilmesi için 2 dakika süre ile, bir argon atmosfer altın sputter-kaplama, bunların, 20 kV voltaj bir hızlanma kullanabilir.
3. Cytospins: kültüründe farklı zaman noktalarında iskele gelen hücreleri aspire tarafından 2.0 x 10 ⁴ hücre / slayt toplayın.
   1. 1500 rpm'de 3 dakika için bir cam slayt üzerine hücreler santrifüjleyin.
   2. Wright-Giemsa Modifiye Leke ve optik mikroskop kullanılarak gözlemlemek ile slaytlar Leke. Yumuşak Görüntüleme Sistemi fotoğraf çekmek için kullanılabilir F-görüntüleyebilirsiniz.
   3. Mikroskop gözlem öncesinde slaytlar yıkayın.
4. M ultiphoton analizi: Daha fazla analiz kadar -20 etanol buharı (% 70) gece ve daha sonra kuru ve mağaza ° C ile farklı zaman noktalarında Fix iskeleleri. Önce multiphoton mikroskop 30 mikron kalınlığında slaytlara bölümünde iskele ve PBS ile ıslak görselleştirme için.
   1. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 10 fetal bovin serumu ile PBS içinde tohumlu iskelesi bloke eder.
   2. Fare anti-insan CD71: ° C karanlıkta primer monoklonal antikorun a 1:50 seyreltme ile 4 azından iskelesi gece boyunca inkübe edilir.
   3. PBS ile üç kez yıkanır örnekleri ve sekonder antikor ile lekesi: karanlık oda sıcaklığında 1 saat boyunca anti-fare Alexa Fluor 488.
   4. PBS ile numuneler üç kere yıkayın ve bir su emisyon x60 objektif lens kullanarak bir konfokal mikroskop ile gözlemlemek.
   5. Fluorofor Alexa Fluor 488 pulsatil lazerler 488 nm de heyecanlı. Volocity 5.3.2 yazılımı sonraki görüntü analizi için de kullanılabilir.

Hücresel Nüfus "> 4 jove_title. Sitometrik Akış Analizi

1. Akış sitometresi (FC) hücresel analizinden önce tespiti için ilgili immünfloresan antikorlar ile ilgi hücreleri etiketleyin. Örnekleri arasında bir dizi tespiti için seçilen antikorlar göre hazırlanmaktadır. MNC algılaması için antikor kombinasyonları kullanılır: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
2. Farklı zaman noktalarında ve santrifüj azından iskelesi gelen hücreleri aspire. 100 ul FC tamponu (PBS +% 0.1 sodyum azit) içinde ⁶ 1x10 etrafında hücreleri bir hücre peleti eritilir ve her bir antikor floresans boyasının 10 uL ekleyebilir. 4 azından 30 dakika ° C'de inkübe hücreleri, PBS ile iki kez yıka, sonuçta FC tampon içinde tekrar askıya.
3. Antikor ifade "olumsuzluk" kurmak ve akış sitometresi kontrolü ile tespit kanalları kalibre izotip kontrolü ile akış sitometresi lekeli içine örnek yükleyin.
4. Örnek lekeli w Oku Üç farklı antikorları i ve en sonunda WinList yazılımı kullanılarak veri temsil eder.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Eksojen büyüme faktörlerinin ilave edilmeden hematopoietik hücre büyümesi kinetik bir örnek, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Hematopoiesis heterojen, iki farklı hücre nedeniyle: normal ve anormal hücre hematopoetik gösterilmiştir. Şekil 2A, insan CBMNC hücre proliferasyonu kültüründe 28 gün sonra açıktır. Şekil 2B, insan primer lösemi hücre kullanılarak taklitçilik büyüme kinetikleri gösterir. Hücresel proliferasyon absorbans ilişkin hücresel metabolik aktivitesini ölçer MTS testi kullanılarak değerlendirilir. Her iki durumda da, hücrelerin çoğalması ve modeli kuruldu. Büyüme kinetiği farklılıklar gözlenir; kültür kurmak, normal hematopoetik hücreler daha hızlı lösemik hücrelerden daha.

iskelelerinin _content "> eksojen büyüme faktörlerinin yokluğunda kültürün 28 gün, normal hücrelerin hematopoetik (Şekil 3A) ve lösemi hücre (Şekil 3B) tipik olarak daha sonra hücreler hasat morfolojisi. Orta bölümleri sonra SEM ile analiz edildi İskeleler kültürü kaldırılır ve kümeler halinde ve "niş" gibi yapılar (Şekil 3A '& B') kendilerini kurarak, iskele boyunca numaralı seribaşı hücrelerinin yayılmasını saptandı. Şekil C gösteren bir dereceye giremeyen içinde gözenek boyutu ve dağıtım iskelesi, bir kontrol olarak kullanılmıştır. 28 gün sonra Multiphoton mikroskopi in situ 3D iskelesi içinde hücrelerinin dağılımını vurgulamak için kullanılan ve bu işaretleyici tarafından ifade (Şekil 4) iskele merkez bölümde eritroid adalar varlığını gösterdi erythroblasts pozitiftir. CD71 Bu olgun ve olgunlaşan hücreler du önemini ortaya koyuyorhalka eritropoez. Insan CBMNCs ve Şekil 5B anormal hematopoetik hücreler gösterir: Birincil lösemik hücrelerin Son olarak, hücrelerin önceden ekimi sitometrisi grafikleri Şekil 5A, normal hematopoetik hücreler temsil hematopoetik hücrelerin fenotipi farkı gösterir. CD235a düzeyleri ⁺ ve CD45 ⁺ sırasıyla lösemilerin hemoblastic doğasını vurgulayarak lösemik daha normal bir örnek daha yüksektir eritrosit ve lökositlerin karşılık.

Şekil 1. PU iskele imalatı ve bio-fonksiyonlandırmalar yer alan süreçlerin İllüstrasyon. A) poliüretan Dioksan (5wt%) içinde çözülür ve ısının neden olduğu faz ayırma işlemi ve daha sonra çözücü, süblimleştirme yolu ile iskelesi Safinia ark ¹³ tarafından tarif edildiği gibi, üretilir. B) İskele diski sonra int kesiliro küpleri 0.5 x 0.5 hücre dışı matriks (ECM) proteinleri ile santrifüj kaplı x 0,5 mm ve daha sonra. C) MNC insan umbilikal CB veya bir mikropipet ile yoğunluk gradiyenti santrifüj ve PU iskeleleri taneli (2x10 ⁶ hücre / iskelet) ile BM aspirasyon ayıklanır.

. Şekil 2 Hücresel proliferasyon MTS deneyi ile ölçülmüştür: A) insan kordon kanı ÇUŞ kullanarak; insan birincil lösemik hücreleri kullanarak) B. Eksojen sitokinlerin ilave edilmeden poliüretan iskelesi tohumlanmış olduğunda kolon zamanla hücrelerinin büyümesini göstermektedir.

Şekil 3: iskelelerinin etrafında Hücre morfolojisi ve dağılımı, scanni cytospins kullanarakng elektron mikrografikleri. (AB) kültür 28 gün sonra PU iskeleleri toplanan A) kordon kanı mononükleer hücrelerinin Temsilcisi Wright-Giemsa lekeli cytospins, ve B) kemik aspire lösemik hücrelerin kültür 14 gün sonra PU iskeleleri toplanmıştır. Her ikisi de deneylerin sitokin serbest durumda gerçekleştirilmiştir. (A'-B ')) tohumlu kordon kan ÇUŞ ve B') 28 gün süreyle kültüre edildikten sonra lösemi hücre ve hiçbir hücreleri ile birlikte C) kontrolü iskelesi A poliüretan iskelesi SEM temsil eden merkezi bölümü.

Şekil 4. Eritroid belirteç CD71 ile kültür ve lekeli 28 gün sonra kordon kanı ÇUŞ ile PU iskele numaralı seribaşı ve Multiphoton mikrografı.

Şekil 5. Flow sitometri 3D nokta araziler CD45, CD71 ve CD235a yüzey ifade belirteçleri için boyandı. Elde edilen izotip kontrolü de nispi floresans yoğunluğunu ve karşılaştırma için verilmiştir. Panel A yukarıdaki belirteçler pozitif insan kordon kanı mononükleer hücreler gösterir; B Paneli insan birincil lösemik hücreleri gösterir.

Tartışmalar

Burada sunulan ex vivo 3D kültür sistemi bize hematopoiesis 3D biyomimikri kurmaya olanak veren özetlediği BM özgün mimarisi ve eksojen sitokinler bağımsız hücre fenotipi. 3D modeli yapısı ve normal ve anormal hücre hematopoetik in vivo olarak karşılaşılan benzer koşullarda prolifere sağlayan mikro sağlar.

Polimerik iskelesi malzeme seçimi biyomimikri tasarım kritik bir adımı temsil ediyordu. Biyomalzeme Önemli avantajları gerekli mimari, yapısal ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue No
Dioxan	Invitrogen	D20,186-3
PBS	Gibco	14190-094
IMDM	Invitrogen	12440-053
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
MTS	Promega	G3580
Glutaraldehyde	Fluka Biochemika	49624
Wright-Giemsa	Sigma-Aldrich	WG32
Fetal bovine serum	Gibco	10108-165
CD71	Santa Cruz Biotechnology	sc-32272
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
CD45-FITC	BD Pharmigen	74895
CD71-PE	BD Pharmigen	555537
CD235a-PE-Cy5	BD Pharmigen	555570
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S-8032