خارج الحي تقليد تكون الدم الإنسان العادية وغير العادية

Summary

يوصف نظام ثقافة 3D لتكون الدم باستخدام دم الحبل السري البشري وابيضاض الدم خلايا نخاع العظام. وتستند هذه الطريقة على استخدام مادة البولي يوريثين سقالة الاصطناعية التي يسهل اختراقها المغلفة مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية. هذا سقالة قابل للتكيف لاستيعاب مجموعة واسعة من الخلايا.

Abstract

الخلايا الجذعية المكونة للدم تتطلب المكروية فريدة من نوعها من أجل الحفاظ على دم تشكيل خلية ^1؛ نخاع العظم (BM) هي عملية معقدة ثلاثية الأبعاد (3D) تكون الدم فيها الأنسجة وينظم من قبل microenvironments الخلوية نظمت مكانيا يطلق عليه منافذ ^2-4. تنظيم منافذ BM أمر بالغ الأهمية بالنسبة لوظيفة أو اختلال وظيفي من BM طبيعي أو خبيثة ^5. ولذلك فإن فهم أفضل للالمكروية في الجسم الحي باستخدام محاكاة المجراة سابقا يساعدنا على توضيح المحددات الجزيئية والخلوية وmicroenvironmental من leukemogenesis ^6.

حاليا، يتم استزراع الخلايا المكونة للدم في المختبر في ثنائي الأبعاد (2D) قوارير زراعة الأنسجة / ⁷ لوحات جيدة تتطلب إما التعاون مع ثقافة خيفي أو الخلايا اللحمية xenogenic أو إضافة السيتوكينات الخارجية ^8. هذه الشروط هي مصطنعة وتختلف في الجسم الحي 9،10 تعدد القدرات.

هنا، نقدم رواية نخاع العظام 3D منظومة الثقافة التي تحاكي البيئة في الجسم الحي، وتدعم نمو 3D multilineage تكون الدم في غياب عوامل النمو الخارجية. السقالة المسامية العالية المستخدمة في هذا النظام مصنوعة من البولي (بو)، ويسهل عالية الكثافة نمو الخلايا عبر مساحة محددة أعلى من ثقافة أحادي الطبقة التقليدية في 2D ^11. وأوضحت أن عملنا هذا النموذج دعم نمو دم الحبل السري البشري (CB) خلايا وحيدات النوى (متعددة الجنسيات) ¹² وخلايا اللوكيميا الأولية في غياب السيتوكينات الخارجية. هذا التقليد الأعمى 3D رواية توفر منصة قابلة للتطبيق لتطوير نموذج تجريبي لدراسة الإنسان تكون الدم واكتشاف علاجات جديدة لسرطان الدم.

Protocol

1. سقالة تصنيع وبيو functionalization، من السقالات

1. الى افتعال PU السقالات (حجم المسام 100-250 ملم، المسامية 90-95٪) في شكل أقراص طبق بيتري، استخدم فصل المرحلة التي يسببها حراريا ¹³ عملية من خلال إعداد حل البوليمر (5wt٪ في Dioxan)، يليه تجميد واللاحقة مذيب التسامي (الشكل 1A).
2. قطع القرص سقالة إلى مكعبات من 0.5 × 0.5 مم 0.5 × قبل طلاء مع بروتينات ECM (الشكل 1B).
3. مخزنة مسبقا الرطب والسقالات التي غمر بها في الإيثانول (70٪) لمدة 1 دقيقة، ثم نقل إلى فوسفات المالحة (PBS) لمدة 20 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي ثم لمدة 10 دقيقة في 3630 XG وإضافة محلول البروتين.
4. أجهزة الطرد المركزي والسقالات في حل بروتين في 1420 XG لمدة 20 دقيقة.
5. من أجل كسر الجمود في المسام السطح، وتسمح للخلايا المصنف على اختراق أعمق في سقالة، أجهزة الطرد المركزي والسقالات مرة أخرى بمبلغ 910 XG لمدة 10 دقيقةفي برنامج تلفزيوني.
6. تعقيم السقالات باستخدام مزيج من التعرض دقيقة و 8 في 230 فولت 50 هرتز،، 0.14 ألف مصباح، الأشعة فوق البنفسجية، مع غمر لمدة 2 ساعة في الإيثانول (70٪). بعد ذلك، وغسل السقالات مرتين في برنامج تلفزيوني قبل ان يضيف لIscove معدلة Dulbecco متوسطة (IMDM) تستكمل مع 30٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين والستربتوميسين (P / S). وضع السقالات في حاضنة مرطب لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ قبل استخدامها. يتم وضع السقالات العقيمة في لوحات 24 ثقافة جيدا الأنسجة (واحد لكل سقالة أيضا).

2. وحيدات النوى عزل الخلايا والبذر سقالة

1. استخراج الإنسان الشركات متعددة الجنسيات من دم الحبل السري أو ابيضاض الدم عينات نخاع العظام، وذلك باستخدام Ficoll-Paque الطرد المركزي المتدرج الكثافة (35 دقيقة عند 1500 دورة في الدقيقة) (الشكل 1C).
2. Resuspend الشركات متعددة الجنسيات في IMDM تحتوي على 30 FBS٪ و 1٪ P / S.
3. 100μl البذور من الشركات متعددة الجنسيات تعليق (2 × 10 ⁶ خلية / سقالة) على السقالات باستخدام ماصة الصغيرة.
4. احتضان والسقالات المصنفة على 37 درجة مئوية تحت CO ₂ 5٪ لمدة 10 دقائق للحصول على الخلايا ليستقر في السقالات.
5. ملأ كل جيدا مع 1.5 مل من IMDM التي تحتوي على 30٪ FBS وألواح جيد 1٪ P / S وضعها في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ طوال مدة التجربة.
6. والسقالات المصنفة تخضع يوميا تتغير من جميع وسائل الإعلام.

3 في انتشار الخلايا الطبيعي وعلم الصرف: MTS، ووزارة شؤون المرأة وCytospins

1. MTS مقايسة: إزالة ثقافة من أمم متحدة واحدة في البطولة واثنين من السقالات المصنفة والمكان في 24 جديدة نظيفة جيدا لوحة. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام و 200 ميكرولتر من حل MTS والحضانة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
   1. أخذ 8 × 100 عينة ميكرولتر من طاف؛ مكان في لوحة 96-جيدا والامتصاصية التدبير ب 490 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
2. المجهر الإلكتروني (SEM): في نقطة زمنية مختلفة من الالثقافة الإلكترونية، وإزالة السقالات المصنف مع الشركات متعددة الجنسيات من وسائل الإعلام، وإصلاح مع 2.5٪ في برنامج تلفزيوني، مخزنة حل غلوتارالدهيد لمدة 40 دقيقة في 4 درجة مئوية، ثم تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
   1. المجففة والسقالات في سلسلة متدرجة من الايثانول (25، 50، 70، 80، 90، 95، و 100٪)، ولكل لمدة 10 دقيقة وجافة في بيئة معقمة لمدة 4 ساعات.
   2. عينات القسم ثم تفل، معطف لهم مع الذهب في جو الأرجون لمدة 2 دقيقة قبل SEM التقييم، واستخدام الجهد تسارع من 20 كيلو فولت.
3. Cytospins: جمع 2.0 × ⁴ 10 خلية / الشريحة بواسطة الشفط الخلايا من سقالة في نقاط زمنية مختلفة في الثقافة.
   1. منبذة الخلايا على شريحة زجاجية لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة.
   2. وصمة عار على الشرائح مع رايت صبغة الجمسا التعديل ومراقبة باستخدام المجهر الضوئي. F-عرض يمكن استخدامها لينة نظام التصوير لالتقاط الصور.
   3. غسل الشرائح قبل مراقبة المجهر.
4. M ultiphoton تحليل: السقالات فيكس في نقاط زمنية مختلفة مع بخار الإيثانول (70٪) بين عشية وضحاها ومن ثم الجافة ومخزن في -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. قبل التصور مع قسم مجهر multiphoton السقالة إلى شرائح سميكة ميكرومتر 30 و رطب مع برنامج تلفزيوني.
   1. منع السقالات المصنفة في برنامج تلفزيوني مع المصل 10٪ بقري جنيني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. احتضان والسقالات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام مع تخفيف 1:50 من الأجسام المضادة أحادية المنشأ الأساسي: الفأر CD71 الإنسان المضادة.
   3. غسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية: مكافحة فأر اليكسا فلور 488 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   4. غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ونلاحظ مع المجهر متحد البؤر باستخدام X60 انبعاث المياه عدسة الهدف.
   5. هو متحمس Fluorophore اليكسا فلور 488 في 488 نانومتر ليزر نابض. ويمكن استخدام البرنامج لVolocity 5.3.2 تحليل الصور اللاحقة.

jove_title "> 4. تحليل تدفق Cytometric للسكان الخلوي

1. قبل تحليل الخلوية في عداد الكريات تدفق (FC)، تسمية الخلايا في المصالح مع الأجسام المضادة للالمناعي المقابلة للكشف. يتم إعداد عدد من العينات وفقا للأضداد مختارة للكشف. للكشف عن الشركات متعددة الجنسيات تستخدم التركيبة التالية من الأضداد: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
2. نضح الخلايا من سقالة في نقاط زمنية مختلفة، والطرد المركزي. بحل بيليه خلية من حوالي 1x10 ⁶ خلايا في 100 العازلة FC ميكروليتر (PBS أزيد الصوديوم + 0.1٪)، وإضافة 10 ميكرولتر من كل الأضداد صبغ مضان. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني، وأخيرا في نادي العازلة إعادة تعليق.
3. تحميل العينة إلى تدفق عداد الكريات الملون مع سيطرة isotype لتعيين "سلبية" للتعبير عن الأجسام المضادة ومعايرة قنوات كشف مع التحكم في التدفق عداد الكريات.
4. قراءة عينة ث الملون إيث الأجسام المضادة الثلاثة المختلفة، وتمثل أخيرا في البيانات باستخدام برنامج WinList.

5. ممثل النتائج

ويرد مثال للدم حركية النمو الخلوي دون إضافة عوامل النمو الخارجية في الشكل 2. وتتضح طبيعية وغير طبيعية الخلايا المكونة للدم: نظرا لطبيعة متجانسة من تكون الدم، واثنين من انواع مختلفة من الخلايا. في الشكل 2A، الانتشار الخلوي من CBMNC الإنسان هو واضح بعد 28 يوما في الثقافة. 2B ويبين الشكل حركية النمو في محاكاة باستخدام خلايا اللوكيميا الأولية. ويتم تقييم الخلوية انتشار استخدام فحص النظام التجاري المتعدد الأطراف الذي يقيس النشاط الأيضي الخلوية في ما يتعلق الامتصاصية. في كلتا الحالتين، فإن الخلايا تكاثرت، وأنشأ في هذا النموذج. ويلاحظ اختلافات في حركية النمو؛ الخلايا المكونة للدم الطبيعي في تأسيس ثقافة أسرع من خلايا اللوكيميا.

وقد تم تحليل _content "> ومورفولوجيا الخلايا تحصد حتى بعد 28 يوما من تاريخ الثقافة في ظل غياب عوامل النمو الخارجية كان نموذجيا من الخلايا المكونة للدم الطبيعي (الشكل 3A) وخلايا اللوكيميا (الشكل 3B). الفروع المركزية للالسقالات بواسطة SEM بعد تمت إزالة السقالات من ثقافة وأظهرت انتشار الخلايا المصنفة في جميع أنحاء سقالة، تأسيس أنفسهم في مجموعات وفي هياكل "المتخصصة مثل" (الشكل 3A '& B "). يبين الشكل جيم حجم المسام وتوزيعها في غير المصنف تستخدم سقالة كمجموعة تحكم. تم استخدام المجهر Multiphoton بعد 28 يوما لتسليط الضوء على توزيع الخلايا داخل سقالة 3D في الموقع وأنها أظهرت وجود جزر محمر في الفروع المركزية للسقالة (الشكل 4) من التعبير عن علامة CD71 وهو أمر ايجابي في erythroblasts، وهذا يدل على أهمية دو ناضجة والخلايا الناضجةعصابة تكون الكريات الحمر. أخيرا، الرسوم البيانية التدفق الخلوي للخلايا قبل البذر يظهر الاختلاف في النمط الظاهري للخلايا المكونة للدم، حيث 5A الرقم يمثل الخلايا المكونة للدم الطبيعي: CBMNCs الإنسان و5B الشكل يوضح الخلايا المكونة للدم غير طبيعية: خلايا اللوكيميا الأولية. مستويات CD235a ⁺ و CD45 ⁺ المقابلة لكريات الدم الحمراء وكريات الدم البيضاء هي على التوالي أعلى في عينة من الطبيعي في ابيضاض الدم تسليط الضوء على طبيعة الأرومات من اللوكيميا.

الشكل 1. توضيحات من العمليات التي تنطوي عليها PU سقالة تصنيع والحيوية functionalization. A) يذوب في PU Dioxan (5wt٪)، وبواسطة عملية مرحلة الانفصال التي يسببها حراريا والتسامي مذيب لاحقة يتم إنتاج سقالة، كما وصفها سافينيا وآخرون ^13. B) ثم يتم قطع القرص سقالة مادبامكعبات س من 0.5 × 0.5 × 0.5 ملم ومن ثم المغلفة بواسطة الطرد المركزي مع اضافية البروتينات الخلوية (ECM) المصفوفة. ج) يتم استخراج من الشركات متعددة الجنسيات CB السري الإنسان أو من طموح BM باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة والمصنفة (2x10 ⁶ خلية / سقالة) في السقالات PU مع micropipette.

قياس الانتشار الرقم الخلوي 2 باستخدام الفحص MTS: أ) استخدام الإنسان الحبل الشركات المتعددة الجنسيات في الدم ب) باستخدام خلايا اللوكيميا الأولية. الأعمدة تظهر نمو الخلايا مع مرور الوقت عندما بذرت في السقالات PU دون إضافة السيتوكينات الخارجية.

الشكل 3: مورفولوجيا الخلايا والتوزيع في جميع أنحاء السقالات باستخدام cytospins، scanniنانوغرام الميكروسكوب الالكتروني. (أ ب) الممثل رايت بالغيمزا cytospins الملون من وخلايا دم الحبل السري) وحيدات النوى التي تم جمعها من السقالات PU بعد 28 يوما من ثقافة، وباء) العظام والخلايا التي تم جمعها من ابيضاض الدم يستنشق السقالات PU بعد 14 يوما من ثقافة. وقد أجريت تجارب على حد سواء في حالة خلوى الحرة. (A'-B ') المقاطع المركزية ممثل الميكروسكوب PU SEM سقالة من A') المصنفة الحبل الدم، والشركات المتعددة الجنسيات 'ب) خلايا اللوكيميا بعد أن تم زرعها لمدة 28 يوما، وجيم) مع عدم وجود سيطرة سقالة الخلايا.

الشكل 4. Multiphoton صورة مجهرية من المصنف سقالة بو دم الحبل مع الشركات المتعددة الجنسيات بعد 28 د في الثقافة والملون مع علامة محمر CD71.

الشكل 5. التدفق الخلوي 3D الدوت المؤامرات ملطخة عن CD71، CD45 وعلامات سطح CD235a التعبير. ويرد أيضا في الحصول على السيطرة isotype للمقارنة من كثافة مضان نسبي. لوحة ويظهر خلايا دم الحبل السري وحيدات النوى إيجابية للعلامات أعلاه؛ لوحة B يظهر خلايا اللوكيميا الأولية.

Discussion

وبحكم ثقافة 3D فيفو نظام المقدمة هنا تمكننا من تأسيس تقليد الطبيعة 3D من تكون الدم الذي يلخص بنية الأصلي BM والنمط الظاهري الخلوية مستقل من السيتوكينات الخارجية. نموذج 3D يوفر هيكل والمكروية التي تمكن الخلايا المكونة للدم العادية وغير العادية لتتكاثر في ظروف م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue No
Dioxan	Invitrogen	D20,186-3
PBS	Gibco	14190-094
IMDM	Invitrogen	12440-053
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
MTS	Promega	G3580
Glutaraldehyde	Fluka Biochemika	49624
Wright-Giemsa	Sigma-Aldrich	WG32
Fetal bovine serum	Gibco	10108-165
CD71	Santa Cruz Biotechnology	sc-32272
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
CD45-FITC	BD Pharmigen	74895
CD71-PE	BD Pharmigen	555537
CD235a-PE-Cy5	BD Pharmigen	555570
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S-8032