Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos

Resumo

Um sistema de cultura de 3D para a hematopoiese é descrito usando sangue do cordão umbilical humano e células de medula óssea leucémicas. O método baseia-se na utilização de um poliuretano poroso sintético andaime revestido com proteínas da matriz extracelular. Este andaime é adaptável para acomodar uma grande variedade de células.

Resumo

Células-tronco hematopoéticas requer um microambiente único, a fim de sustentar a formação do sangue célula ^1, a medula óssea (BM) é um complexo tridimensional (3D) tecido hematopoiese em que é regulada por espacialmente organizadas microambientes celulares denominados nichos ^2-4. A organização dos nichos BM é crítico para a função ou disfunção de BM normal ou maligno ^5. Por conseguinte, uma melhor compreensão do microambiente em in vivo utilizando um mimetismo ex vivo nos ajudaria elucidar os determinantes moleculares, celulares e microambiental de leucemogênese ^6.

Actualmente, as células hematopoiéticas são cultivadas in vitro em frascos de tecidos bidimensionais (2D) de cultura / poço de placas ⁷ que requerem ou de co-cultura com alogénico ou xenogénica células estromais ou adição de citocinas exógenas ^8. Estas condições são artificiais e diferem do in vivo 9,10 pluripotência.

Aqui, apresentamos um romance 3D osso sistema de cultura de medula que simula o ambiente de crescimento in vivo em 3D e suporta hematopoiese multilinhagens na ausência de fatores de crescimento exógenos. O andaime altamente poroso utilizado neste sistema de poliuretano (PU), facilita a alta densidade crescimento celular através de uma maior área superficial específica do que a cultura em monocamada em 2D convencional ^11. O nosso trabalho indicou que este modelo de suporte o crescimento de sangue do cordão umbilical humano (CB), as células mononucleares (MNC) ¹² e primárias de células leucémicas, na ausência de citocinas exógenas. Este mimetismo 3D romance proporciona uma plataforma viável para o desenvolvimento de um modelo humano experimental para estudar a hematopoiese e para explorar novos tratamentos para a leucemia.

Protocolo

1. Andaime Fabricação e Bio-funcionalização de Andaimes

1. Para fabricar PU andaimes (tamanho de poro 100-250 mm, porosidade de 90-95%) sob a forma de discos de Petri, utilizar a separação de fases induzida termicamente ¹³ processo através da preparação de uma solução de polímero (5wt% em dioxano), seguido de congelamento e subsequente sublimação do solvente (Figura 1A).
2. Cortar o disco de andaime em cubos de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm antes do revestimento com ECM proteínas (Figura 1B).
3. Pré-molhadas os suportes por imersão em etanol (70%) durante 1 min e depois transferir em salina tamponada com fosfato (PBS) durante 20 min. Em seguida, centrifugar durante 10 min a 3630 xg e adicionar a solução de proteína.
4. Centrifugar os suportes na solução de proteína a 1420 xg durante 20 min.
5. A fim de desbloquear os poros da superfície, e permitir que as células semeadas a penetrar mais profundamente na andaime, centrifugar o scaffolds mais uma vez em 910 xg durante 10 minem PBS.
6. Esterilizar os andaimes usando uma combinação de 8 min de exposição a 230 V, 50 Hz, 0,14 Uma lâmpada de UV, com a imersão durante 2 h em etanol (70%). Depois disso, lavar os suportes duas vezes em PBS antes da adição Modificado por Dulbecco Médio de Iscove (IMDM), suplementado com 30% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina e estreptomicina (P / S). Colocar os suportes em um incubador humidificado durante 3 dias a 37 ° C e 5% de CO ₂ antes de usar. Andaimes estéreis são colocados num placas de 24 poços de tecido-cultura (um andaime por poço).

2. Isolamento de células mononucleares e Plantio de andaime

1. Extrair humano MNC do sangue do cordão ou amostras de medula óssea leucémicas, usando Ficoll-Paque centrifugação em gradiente de densidade (35 min a 1500 rpm) (Figura 1C).
2. Ressuspender o MNC em IMDM contendo 30% de FBS e 1% P / S.
3. 100 ul de semente de suspensão MNC (2 × 10 ⁶ células / andaime) para a andaimes usando uma pipeta de micro-.
4. Incubar a andaimes semeadas a 37 ° C sob 5% de CO ₂ durante 10 minutos para as células para se adaptar à andaimes.
5. Encher cada poço com 1,5 ml de IMDM contendo 30% de FBS e 1% P / S e as placas assim lugar na incubadora a 37 ° C e _5% de CO2 durante a duração da experiência.
6. Os arcabouços semeados sofrem diariamente mudam de todos os meios de comunicação.

3 na proliferação celular in situ e Morfologia:. MTS, SEM e cytospins

1. Ensaio MTS: Retire uma cultura não-sementes e dois andaimes sem sementes e coloque em um 24 novo e limpo bem-chapa. Adicionar 1 ml de meio e 200 uL da solução de MTS e incubar durante 3 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
   1. Exame de 8 x 100 uL de amostras a partir do sobrenadante; lugar em uma placa de 96 poços e absorvância medida a 490 nm usando um leitor de microplacas.
2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV): em diferentes momentos do diacultura e, remover os andaimes semeadas com MNC a partir dos meios de comunicação, e fixar com 2,5% de PBS-tamponada solução de glutaraldeído por 40 min a 4 ° C, em seguida, lavar duas vezes com PBS.
   1. Desidratado os suportes em uma série graduada de etanol (25, 50, 70, 80, 90, 95 e 100%), cada um durante 10 min e seco num ambiente asséptico durante 4 horas.
   2. Espécimes de secção e, em seguida, por pulverização catódica-revestimento com ouro numa atmosfera de árgon durante 2 min antes da avaliação SEM, utilizar uma voltagem de aceleração de 20 kV.
3. Cytospins: Recolha 2,0 x 10 ⁴ células / lâmina por aspiração das células do andaime em pontos de tempo diferentes na cultura.
   1. Centrifugar as células numa lâmina de vidro durante 3 min a 1500 rpm.
   2. Coloração das lâminas com Wright-Giemsa modificado e observar por meio de um microscópio óptico. F-visualizar Imaging System Soft pode ser usado para tirar fotos.
   3. Lave as lâminas antes da observação ao microscópio.
4. M análise ultiphoton: andaimes fixos em pontos de tempo diferentes, com vapor de etanol (70%) durante a noite e, em seguida, seco e armazenar a -20 ° C até análise posterior. Antes de visualização com a seção de microscópio multifotônica o andaime em 30 mm de espessura, slides e molhado com PBS.
   1. Bloquear a andaimes seeded em PBS com 10% de soro fetal de bovino durante 30 min à temperatura ambiente.
   2. Incubar as andaimes durante a noite a 4 ° C na escuridão com uma diluição de 1:50 de anticorpo monoclonal primário: ratinho anti CD71 humano.
   3. Lavar as amostras três vezes em PBS e coradas com o anticorpo secundário: anti-ratinho Alexa Fluor 488 durante 1 h à temperatura ambiente na escuridão.
   4. Lavar as amostras três vezes com PBS e observar com um microscópio confocal usando uma água de emissão lente objectiva x60.
   5. Fluoróforo Alexa Fluor 488 é excitado a 488 nm pelos lasers pulsáteis. O software Volocity 5.3.2 pode ser utilizado para análise de imagem subsequente.

jove_title "> 4. citometria de fluxo e da população celular

1. Antes da análise celular no citómetro de fluxo (FC), rótulo as células de interesse com os anticorpos correspondentes de imunofluorescência para a detecção. Um certo número de amostras são preparadas de acordo com os anticorpos seleccionados, para detecção. Para a detecção MNC a seguinte combinação de anticorpos são utilizados: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
2. Aspirar as células do andaime em pontos de tempo diferentes e centrifugar. Dissolve-se uma pelete de células de cerca de 1x10 ⁶ células em 100 uL de tampão FC (PBS azida de sódio + 0,1%) e adicionar 10 uL de cada corante de fluorescência de anticorpos. Incubar as células durante 30 min a 4 ° C, lavar duas vezes com PBS e finalmente re-suspender em tampão de FC.
3. Carregar a amostra para o manchado citómetro de fluxo com o controlo de isotipo para definir o "negatividade" da expressão do anticorpo e calibrar os canais de detecção com o controle citómetro de fluxo.
4. Leia a amostra manchado w om os três anticorpos diferentes e, finalmente, representam os dados no uso do software WinList.

5. Os resultados representativos

Um exemplo de hematopoiéticas cinética de crescimento celular, sem a adição de factores de crescimento exógenos é mostrado na Figura 2. Devido à natureza heterogénea de hematopoiese, duas células diferentes: normais e anormais células hematopoiéticas são ilustrados. Na Figura 2A, a proliferação celular de CBMNC humana é evidente após 28 dias em cultura. Figura 2B mostra a cinética de crescimento no mimetismo usando células humanas leucémicas primárias. Proliferação celular é avaliada utilizando o ensaio de MTS que mede a actividade metabólica celular em relação à absorvância. Em ambos os casos, as células proliferaram e estabeleceu no modelo. As diferenças na cinética de crescimento são observados; células hematopoiéticas normais estabelecer a cultura mais rápido do que as células leucémicas.

_content "> A morfologia das células colhidas, mesmo após 28 dias de cultura na ausência de factores de crescimento exógenos era típica de células hematopoiéticas normais (Figura 3A) e células leucémicas (Figura 3B). secções centrais dos suportes foram analisados ​​por SEM após os andaimes foram retirados da cultura e mostrou a propagação das células semeadas em todo o andaime, estabelecendo-se em agrupamentos e em "nicho-estruturas semelhantes (Figura 3A '& B'). Figura C mostra o tamanho dos poros e distribuição em um unseeded andaime usado como um controlo. microscopia multifotônica após 28 dias foi utilizado para destacar a distribuição das células no interior da andaime 3D in situ e que mostrou a presença de eritróide ilhas nas secções centrais do andaime (Figura 4) pela expressão do marcador CD71, que é positiva em eritroblastos. Isso prova a importância da du madura e células vencimentoeritropoiese anel. Finalmente, os gráficos de citometria de fluxo da semeadura células antes mostra a diferença no fenótipo de células hematopoiéticas, em que A Figura 5A representa células hematopoiéticas normais: CBMNCs humanos e Figura 5B ilustra anormais células hematopoiéticas: células leucémicas primárias. Níveis de CD235a ⁺ e CD45 ⁺ correspondente a eritrócitos e leucócitos, respectivamente são superiores na amostra normal do que no leucémicas destacando a natureza hemoblastic das leucemias.

Figura 1. Ilustração dos processos envolvidos na fabricação e PU andaime bio-funcionalização. A) PU é dissolvido em dioxano (5wt%) e pelo processo termicamente induzida fase de separação e sublimação solvente subsequente do andaime é produzido, como descrito por Safinia et al ^13. B) O disco de andaime é então cortada intO cubos de 0,5 x 0,5 x 0,5 mm e, então, revestido por centrifugação com matriz extra-celular (ECM) proteínas. C) MNC são extraídos umbilical humano CB ou a partir de aspiração BM utilizando centrifugação em gradiente de densidade e semeado (2x10 ⁶ células / andaime) na andaimes PU com uma micropipeta.

. Figura 2 proliferação celular medido utilizando o ensaio de MTS: A) usando sangue do cordão umbilical humano EMNs; B), utilizando células humanas leucémicas primárias. As colunas mostram o crescimento de células ao longo do tempo, quando semeadas no andaimes PU, sem a adição de citocinas exógenas.

Figura 3: A morfologia e distribuição em torno dos andaimes utilizando cytospins, scannimicrografias ng elétrons. (AB) Representante Wright-Giemsa cytospins manchadas de A) células mononucleares do sangue do cordão coletadas em PU andaimes após 28 dias de cultura, e B) osso aspirados células leucêmicas coletadas de PU andaimes após 14 dias de cultura. Ambos os experimentos foram realizados em condições de citocinas livre. (A'-B ') Representante seções centrais das micrografias de MEV de PU andaime A') cabo semeado sangue multinacionais e B ') células leucêmicas após serem cultivadas durante 28 dias, e C) controle andaime sem células.

Figura 4. Multifotônica micrografia de um andaime PU semeado com sangue do cordão umbilical multinacionais após 28 d na cultura e corados com o marcador CD71 eritróide.

Figura 5. Citometria de Fluxo 3D Dot-plots coradas para CD45, CD71 e marcadores de expressão CD235a superfície. O controlo de isotipo obtido é também apresentados para comparação da intensidade relativa da fluorescência. O painel A mostra células do cordão humanos de sangue mononucleares positivos para os marcadores acima; B Painel mostra células leucémicas humanas primárias.

Discussão

O ex vivo sistema de cultura 3D apresentado aqui permite-nos estabelecer uma biomimicry 3D da hematopoiese que recapitula a arquitetura original BM e fenótipo celular independente de citocinas exógenas. O modelo 3D fornece a estrutura e do microambiente que permite normais e anormais células hematopoiéticas para proliferar em condições similares àquelas encontradas in vivo.

A seleção do material polimérico andaime representou um passo crítico no projeto biomimicr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue No
Dioxan	Invitrogen	D20,186-3
PBS	Gibco	14190-094
IMDM	Invitrogen	12440-053
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
MTS	Promega	G3580
Glutaraldehyde	Fluka Biochemika	49624
Wright-Giemsa	Sigma-Aldrich	WG32
Fetal bovine serum	Gibco	10108-165
CD71	Santa Cruz Biotechnology	sc-32272
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
CD45-FITC	BD Pharmigen	74895
CD71-PE	BD Pharmigen	555537
CD235a-PE-Cy5	BD Pharmigen	555570
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S-8032