İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

Özet

İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama akciğer yüzeyindeki mikro damar ağları görselleştirmek için bu mümkün kılar. Burada, gerçek zamanlı flüoresan görüntüleme kullanılarak izole edilmiş akciğerlerde bir mikro damarların geçirgenliğini ölçmek için bir yaklaşımı tarif eder.

Özet

İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama yaygın görselleştirmek ve tek Mikro damarların içinde sinyal tanımlamak için kullanılır. Gerçek zamanlı görüntüleme ile bu hazırlık birleştirilmesi suretiyle, bireysel akciğer kılcal geçirgenlik değişiklikleri belirlemek için mümkün olur. Bu yazıda sıçan akciğerlerini yalıtmak ve otolog kan ile bunları serpmek için gereken adımları açıklar. Sonra, küçük bir akciğer bölgeye mikrokateter yoluyla florosforlar veya ajanlar demlenmeye adımları özetlemektedir. Bu tarif edilen prosedürler kullanılarak, bakteriyel lipopolisakkarid infüzyon tepki olarak sıçan akciğer kılcal geçirgenlik artışı tespit edilmiştir. Veri Lipopolisakkarit hem venüler ve kapiller mikrovasküler kesimleri arasında sıvı sızıntısı arttığını ortaya koydu. Bu yüzden, bu yöntem, bu mümkün damar kesimleri arasında geçirgenlik cevapları karşılaştırmak ve böylece, yanıt olarak bir heterojen tanımlamak için yapar. Akciğer geçirgenliğini tanımlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemler akciğer doku örneklerinin postprocessing gerektiren ikengerçek zamanlı görüntüleme kullanımı, bu yöntem belirgin olarak, bu gereği ortadan kaldırır. Böylece, gerçek zamanlı görüntüleme ile birlikte izole akciğer hazırlık akciğer mikrovasküler geçirgenliği belirlemek için geleneksel yöntemler üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor, henüz geliştirmek ve uygulamak için basit bir yöntemdir.

Giriş

Akciğerlerde artmış mikrovasküler geçirgenlik alveolar ödem ve bozulmuş gaz değişimi gelişimine yol açar ve akut akciğer hasarı (ALI) ^1-3 önemli bir özelliğidir. Bu nedenle, vasküler geçirgenliğin tahminleri akciğer yaralanması ve önerilen terapötik müdahalelerin etkinlik derecesinin belirlenmesinde önemlidir. Bu tür kan serbest akciğer ıslak-kuru oranı ve mikrovasküler filtrasyon katsayısı olarak Gravimetrik analiz yaygın ^{geçirgenliği, 4,5} tahmin yöntemleri kullanılır. Diğer yöntemler, akciğer ^{dokusu, 6-8,} radyoaktif ya da floresan probları miktarının tutulmasını içerir. Bununla birlikte, yukarıdaki yöntem geçirgenliği verileri açıklık doğru Akciğer doku örneklerinin postexperiment işlem gerektirir. Bir hayvan, tek bir tedavi protokolü sadece kullanılabilir Dahası, büyük hayvan sayısı tam bir çalışma için gerekli olabilir. Yukarıdaki yöntemlerin ortak bir özelliği, için ortalama damar geçirgenliğini belirler olmasıdırdoku numunesi içindeki tüm kan damarları. Ancak, iyi pulmoner mikro ve makro-gemiler ⁹ fenotipik farklı olduğu kurulmuştur. Bu nedenle, geçirgenlik yanıtları hem de ^9,10 çeşitli damar kesimleri arasında heterojen olabilir. Böylece, bir doku örneğinin tüm pulmoner damarların geçirgenliği ortalama miktarının yeterince bu heterojenliğini yansıtmayabilir.

İzole kan perfüze akciğer hazırlık, akciğer yüzeyinde kan damarları dik bir mikroskop ^4,11,12 tarafından görüntülenmiştir olabilir. Bu tepkiler ¹³ herhangi bir heterojen ele böylece tek damarlarda karakterize yanıtları etkinleştirir. Buna ek olarak, mikrokapların flüoresan görüntüleme kullanılarak, floresans bazlı deneyler dahil edilebilir. Bundan başka, bir sol atriyum mikrokateter kan damarlarının ^11,14 içine maddeleri ve floresan probları sunmak için de kullanılabilir. Mikrokateter küçük bir akciğer bölgeye teslim sınırlar, böylece eskiinfüzyon maddeler ve florofor için bölge içinde sadece kan damarları poz. Bu, aynı akciğer içinde birden fazla küçük bölgeler, çalışma için gerekli hayvan genel bir azalmaya yol açan, ayrı deneyler için kullanılmasına olanak verir.

Gerçek zamanlı görüntüleme vasküler ve izole akciğer hazırlanması tek mikrodamarlar ekstravasküler floresan dinamik değişiklik yakalama sağlar. Bu nedenle, bir görüntü alanı içindeki her mikrodamar için, florofor ve yıkanmasına enfüzyonu esnasında floresanstaki değişimler kaydedilmiştir ve çevrimdışı ¹⁴ belirlenebilir. Maksimum ve kalıntı damar floresans değerleri kullanarak, görüntüleme alanı içinde her mikrodamar için bir geçirgenlik dizin belirlenebilir. Iltihaplı ya da zararlı ajanlara yanıt olarak geçirgenlik değişikliklerini belirlemek için, arzu edilen ajan ilk tatbik edilebilir ve daha sonra geçirgenliği indeksi belirlenir. Buna ek olarak, görüntü alanı ile aşılanmış akciğer bölgesi içinde herhangi bir değere ayarlanabilirmikrokateter, böylece istenen damar ağı seçiminde esneklik yüksek derecede olanak tanır. Dolayısıyla, gerçek zamanlı görüntüleme ile birlikte izole edilmiş kan perfüze akciğer preparat tek akciğer Mikro damarların içinde geçirgenliği ölçmek için çekici bir deneysel model sağlar.

Protokol

Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış hayvanlar üzerinde gerçekleştirilen tüm deneyler vardı.

Perfüze Rat Akciğer Hazırlıkları 1. Boru

1. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, basınç dönüştürücüleri (P23XL) takın. Kan akışı için Tygon boru (# 18) ile bir boru sistemi hazırlamak ve mikroskop sahnede boru yerleştirin.
2. 37 ° C su banyosu sıcaklığını ayarlama
3. Akciğer girişini bağlayın ve Tygon boru ile geçici çıkış.

Şekil 1.. Kan perfüzyon hortum. Şematik izole akciğer hazırlık aracılığıyla kan sirkülasyonu için kullanılan boru kurulumunu göstermektedir. Ayrıca, ilişkili bileşenleri gösterilen, üzerinden boru is yönlendirilir. Kalp ve akciğer şematik boru ve pulmoner arter (PA) arasındaki bağlantı siteleri göstermek için dahil, ve atriyal (LA) kanül (mavi kesik çizgiler) bırakılır.

İzole Sıçan Akciğerler 2. Hazırlanması

1. Ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) ile, sıçanlar (250-300 gr ağırlığında erkek Sprague-Davvley fareleri) anestezisi. Anestezi cerrahi bir uçak ettikten sonra, bir yatar pozisyonda hayvan.
2. Trakeostomi gerçekleştirin, bir trakeal kanül (PE-90) takın ve cerrahi sütür ile sabitleyin.
3. Kardiyak ponksiyon (21 G kelebek iğne) ile kalp içine heparin (100-200 U) demlendikten, 60 saniye ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​kan (~ 12-15 ml kan) için bekleyin.
4. İki kanüller (, 4 cm uzunluğunda, Tygon boru donanımı, 3 mm çap, bir ucunda genişleyen) hazırlamak ve tuzlu su ile doldurun.
5. Bir torakotomi gerçekleştirin. Sağ ventrikül üzerinde bir kesik (3 mm) yapın ve pulmoner doğru kesi bir kanül geniş uç slaytarter. Cerrahi sütür ile pulmoner arter kanül güvenli.
6. Sol ventrikül tepe (3 mm) ve İnsizyon kesi içine ikinci kanül geniş uç kaydırın. Sol atrium içine kanül yönlendirin. Göbek bandı (2 mm genişlik) ile sol ventrikül kanül güvenli.
7. Herhangi bir bağ dokusu disseke ve ekli kanüller ile birlikte akciğer ve kalp kaldırmak. Bir petri üzerinde akciğer ve kalp yerleştirin. Diyafragma yüzey üstüne böylece akciğeri yerleştirin. Üç kanüller aynı yöne bakmalıdır.
8. XY yönde manipüle edilebilir bir sahnede akciğer hazırlık yerleştirin. Bir mikroskop ile birlikte herhangi bir aşamada tüp veya gerekirse, yerleşik bir ısmarlama sahne tutmak için modifiye edilebilir.

İzole Sıçan Akciğerler 3. Kan Perfüzyon

1. Eşit hacimde albumin (% 5) çözeltisi ile kandan arındırıldı kan karıştırın ve hazneye ekleyin. Peristaltik pompayı akış r'yi14 ml / dk 'ya yedi. Kan tüpünü doldurmak için izin.
2. Şant açıkken, geçici akciğer giriş-çıkış fişini çekin. Sırasıyla, akciğer giriş ve çıkışına pulmoner arter ve sol atriyal kanül takın. Boru içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
3. Üçüncü bir basınç transdüktörü (P23XL) için trakeal kanül bağlayın. Trakeal kanül yoluyla% 30 oksijen ile akciğerlerini şişirmek ve 5 cm _H2O basıncı korumak
4. Akciğer perfüzyon başlamak için bir kelepçe ile şant kapatın. Pulmoner arter ve sırasıyla 10 ve 3 cm H ₂ O ~ at sol atriyal basıncı koruyun.

4. Mikrovasküler İnfüzyonluk Akciğer hazırlanıyor

1. Akciğer ve güvenli seviyesinden kateter için ek boru arka ucunu yukarı kaldırın.
2. A ~ 30 cm uzunluğunda PE90 boru içine 40 cm uzunluğunda PE10 boru, yaklaşık 30 cm sokulmasıyla bir enfüzyon kateterini hazırlayın. Bir iğne (30 g) at PE10 boru açıkta kalan ucunubir şırınga (1 cc) iliştirili.
3. Uzatma tüpünün yükseltilmiş arka ucuna kateter kombinasyonu yerleştirin. Dirençle karşılaşana kadar sol atrium ve akciğer içine kateter kombinasyonu yönlendirin. Dirençle karşılaşana kadar sonra, akciğer içine daha fazla yalnız PE10 kateter itin. Kateterin yerleştirilmesi sırasında aşırı kuvvet uygulayarak akciğer zarar unutmayın.
4. Ringer solüsyonu ile 1 cc şırınga doldurun ve bir şırınga pompasına ekleyin. 10 ul / dk infüzyon hızını ayarlayın.
5. İnfüzyon yeri akciğer kalanına kıyasla soluk olacak.
6. Tuzlu su ile ıslatın ve akciğer ortaya infüzyon siteyi terk yeterince büyük bir delik ile plastik wrap ile akciğer kapağı.
7. Bir O-ring (ısmarlama) altındaki bir musluk yağ çubukla ve O-ring altında bir cam lamel (# 1.5, 22 mm çap) yerleştirin. Yavaşça infüzyon sitede lamel ile O-halkasını yerleştirin. Standart tüp hol ile O-halkasını Güvenlider. Son zamanlarda ¹⁵ rapor lamel / O-ring kombinasyonu, bunun altında alveol yapılarını bozmaz.
8. O-halkası üzerinde bir floresan mikroskop bir objektif (20 X) yerleştirin ve akciğer yüzey üzerinde odaklanır.

Mikrodamarlar sayesinde 5.. Görüntüleme Floresan Dekstran Transit

1. Görüntüleme FITC çiçeklenme için mikroskop hazırlayın.
2. Yansıması için bir bölge seçin ve görüntü alma yazılımı kullanarak 1/minute hızında görüntü kazanır.
3. Şırınga pompası kullanılarak FITC-dekstran 20 kD (0.5 mg / ml) infüzyonu başlayın. Kan damarlarında floresan giderek artırmak ve maksimum ulaşacaktır. 60 dakika boyunca infüzyon devam edin.
4. Sonra lümen floresan yıkayın Ringer infüzyon geçmek. Üzerinde 10 dakika süreyle infüzyon koruyun. Yıkama-off sırasında 1/dk 'da görüntü alımı devam ediyor.

6.. Görüntü Analizi

1. Görüntü elde etme dosyasını açın.
2. Yeri bölgelergörüntü karesi içinde mikrodamarlar fazla ilgi.
3. Görüntü dosyasını kare-kare oynamak ve tüm çerçeveler için ilgi her bölgede en floresan yoğunluğu kaydedin.
4. Zamanın bir fonksiyonu olarak her bir ilgi bölgesi için floresan yoğunluğundaki değişim çizilir.
5. Maksimum floresan yoğunluğu ve yıkanmasına 10 dakika sonra, artık floresan yoğunluğunu ölçmek.
6. Ilgi bu bölgeyle bir arada kılcal için geçirgenlik endeksi elde etmek için, ilgi konusu her bölgesinde artık floresan yoğunluğu en fazla oranını hesaplar.

Sonuçlar

Perfüzyon tüpünün ve ilgili ekipmana bağlı bir izole edilmiş kan perfüze akciğer hazırlama Şekil 2 'de gösterilmiştir., Burada tarif edilen prosedürlerin herhangi bir fare türleri ile kullanılabilir ancak gösteri amacıyla, biz bir Sprague Dawley sıçan kullanılır. Bir sol atriyum yoluyla mikrokateter Modül akciğerin sadece küçük bir bölge ulaşır. Infüzyon bölge infüzyon kaynaklı renk (Şekil 3) tarafından tespit edilebilir. Gerçek zamanlı görünt...

Tartışmalar

Gerçek zamanlı görüntüleme ile birleştiğinde izole kan perfüze akciğer hazırlık tek akciğer kılcal geçirgenlik değişikliklerin belirlenmesi için basit bir araç sağlar. Bu LPS infüzyon tepki olarak geçirgenlik değişikliklerini belirlemek için bu yöntemi uygulanır. Bizim veri açıkça LPS infüzyon mikrovasküler geçirgenliği bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Bundan başka, veriler aynı zamanda LPS ile uyarılan değişiklikler, geçirgenlik ve kılcal venüllerin hem de benzer ol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure O-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4