Supramaximal yoğunluğu hipoksik egzersiz ve farelerde vasküler işlevi değerlendirme

Özet

Hipoksi yoğun eğitim sprint yeteneği tekrarlanan vasküler uyarlamalar potansiyel olarak bazı hastalarda yararlı ikna etmek ve sporcuların geliştirmek için kanıtlanmış bir protokoldür. Burada, protokol ve ex vivo vasküler işlevi değerlendirme sistemini kullanarak bu vasküler uyarlamalar tanımlamak fizibilite eğitim fare kullanarak sınayın.

Özet

Egzersiz eğitim sağlık bakımı ve birçok kronik hastalıkların önlenmesi için önemli bir stratejidir. Hastalarda kardiyovasküler hastalıklardan daha ayrıntılı olarak, alt ekstremite arter hastalıkları, nerede hastaların yürüme kapasitesi önemli ölçüde değişmiş, için uluslararası kurallar tarafından önerilen tedavinin ilk satırdır etkileyen onların yaşam kalitesi.

Geleneksel olarak, düşük sürekli egzersiz ve ara egzersiz kullanılmaya başlandı. Son zamanlarda, supramaximal eğitim sporcuların gösterileri ile vasküler uyarlamaları, diğer mekanizmaları arasında geliştirmek için de gösterilmiştir. Bu tür eğitim hipoksi ile bir arada bazı patolojiler için ilgi olabilir bir ek ve/veya sinerjik etkisi getirebilir. Burada, biz supramaximal yoğunluk eğitimler hipoksi %150 maksimum hızları, sağlıklı fareler üzerinde gerçekleştirmek bir motorlu koşu bandı ve hipoksik kutusunu kullanarak anlatan. Biz de faiz, organların almak için fareyi incelemek nasıl göstermek özellikle pulmoner arter, abdominal aorta ve iliyak arter. Son olarak, izometrik gerginlik çalışmalar kullanarak ex vivo vasküler işlev değerlendirmesi alınan damarları üzerinde gerçekleştirmek nasıl gösterir.

Giriş

Hipoksi, oksijen (O₂) azalan ilham kısmını hipoksemi (hipoksi indirdi arteriyel basınç) ve bir değişmiş O₂ taşıma kapasitesi¹yol açar. Akut hipoksi yönettiği iskelet kas² ve karşı bir 'telafi edici' kapakların doğru artan sempatik vasoconstrictor etkinlik neden olmaktadır.

Hipoksi submaximal yoğunlukta egzersiz, normoxic koşullarda aynı düzeyde göre 'telafi edici' Bu kapakların, iyi kurulmuş³var. Bu vazodilatasyon bir artar kan akımı ve bakım sağlamak (veya değişiklik sınırlamak için) esastır etkin kaslara oksijen teslimat. Adenozin önemli artar kapakların blunting ile nitrik oksit sentaz (NOS) inhibisyon hipoksik sırasında rapor edildi beri nitrik oksit (NO) birincil endotel kaynak gibi görünüyor olsa da bağımsız bir rol bu yanıt olarak değil-si olmak için gösterildi ⁴egzersiz. Birkaç diğer vazoaktif maddelerin büyük olasılıkla telafi kapakların hipoksik bir egzersiz sırasında bir rol oynuyorlar.

Bu gelişmiş hipoksik egzersiz hiperemi Arteryel O₂ içeriğinde hipoksi indüklenen şelaleye doğru orantılı ve örneğin hipoksi yoğun artımlı egzersiz sırasında egzersiz yoğunluğu arttıkça, daha büyük.

Telafi edici kapakların NO-aracılı bileşeni ile artan egzersiz yoğunluğu³farklı yollar aracılığıyla düzenlenmiştir: β-adrenergic reseptör-hiçbir bileşen teşvik düşük yoğunluktaki hipoksik egzersiz sırasında olağanüstü görüntülenir , hiçbir katkı için telafi edici dilatasyon kaynak egzersiz yoğunluğu arttıkça β-adrenergic mekanizmaları üzerinde daha az bağımlı gibi görünüyor. Eritrositler ve/veya prostaglandin endotel kaynaklı gelen serbest ATP gibi daha yüksek yoğunluklu hipoksik egzersiz sırasında hiçbir yayın uyarıcı için diğer adaylar vardır.

Supramaximal egzersiz hipoksi (hipoksi [RSH] tekrarlanan sprint Eğitim Egzersiz Fizyolojisi literatürde adlı) performans geliştirme ekibi veya raket sporu oyuncular sağlayan bir son eğitim yöntemi⁵ ' tir. Bu yöntem hipoksi gerçekleştirilen eğitim aralığı farklı veya RSH gerçekleştirilen bu yana maksimum hız⁶ (V_max) maksimum yoğunluk daha büyük kas perfüzyon ve oksijenlenme⁷ ve belirli kas transkripsiyon yol açar yanıt-e doğru⁸. RSH etkinliğini açıklamak için çeşitli mekanizmalar önerilmiştir: hipoksi içinde Sprint sırasında telafi vazodilatasyon ve ilişkili yüksek kan akımı lifler fast-seğirme lifler yavaş seğirme daha fazla yararlanacak. Sonuç olarak, RSH verimliliği fiber türü seçici ve yoğunluk bağımlı olması muhtemeldir. Damar sistemi geliştirilmiş yanıt RSH içinde her şeyden önemlidir spekülasyon.

Egzersiz eğitim kapsamlı farelerde, hem de sağlıklı bireyler ve patolojik fare modelleri^9,10çalışılmıştır. Fareler eğitmek için en yaygın yolu kemirgen bir koşu bandı kullanıyor ve geleneksel olarak kullanılan rejimi düşük yoğunluklu eğitim, % 40-%60 (artımlı koşu bandı testi¹¹kullanarak kararlı) V_max 30-60 dk¹²için^{,13 vardır. ,14,15}. Maksimal yoğunluğu ara egzersiz ve patolojileri üzerindeki etkisi fare^16,17' yaygın olarak inceledik; Böylece, fareler için çalışan protokollerin eğitimi aralığı geliştirilmiştir. Bu protokoller genellikle bir kemirgen motorlu koşu bandı, 1-4 dk, aktif ya da pasif kalan^16,18ile serpiştirilmiş için % 80-% 100 de V_max çalışan yaklaşık 10 nöbetleri oluşur.

Hipoksi (yani, yukarıda V_max) supramaximal şiddeti, egzersiz fareler ilgi mikrovasküler vasodilatory tazminat ve aralıklı egzersiz performans daha yüksek, hem de önceki sonuçlar gelir maksimal veya ılımlı yoğunluklarda, supramaximal daha. Ancak, bizim bilgi, farelerde, normoxia veya hipoksi supramaximal eğitim Protokolü'nün önceki rapor var.

Çalışmanın ilk amacı fare ve tolere edilebilir ve yeterli Protokolü (yoğunluk, sprint süresi, kurtarma, vb) belirlenmesi supramaximal yoğunluk eğitim fizibilite test etmekti. İkinci amaç vasküler işlevi farklı eğitim alay normoxia ve hipoksi etkilerini değerlendirmek için yapıldı. Bu nedenle, biz (1) fareler de hipoksi alıştırmada supramaximal tahammül ve bu protokol bir büyük gelişme vasküler işlevinde normoxia egzersiz daha aynı zamanda düşük yoğunluklarda, hipoksi egzersiz daha neden olmaktadır (2) hipotezler test edin.

Protokol

Yerel devletin hayvan bakımı Komitesi (hizmet de la Consommation et des Affaires Vétérinaires [SCAV], Lozan, İsviçre) tüm deneylerin onaylı (yetkilendirme VD3224; 01.06.2017) ve tüm deneylerin ilgili uygun olarak yapılmıştır kurallar ve düzenlemeler.

1. hayvan barınma ve hazırlık

1. Evi yeni konut durumları alışmak için 6-8 haftalık C57BL/6J erkek fareler sırayla fareler için en az 1 hafta önce başına deneyler tesiste hayvan. Pratik nedenlerden dolayı fareler aynı deneysel grup içinde genellikle birlikte yerleştirilmiştir.
2. Fareler bir ısı kontrollü Oda (22 ± 1 ° C) ad libitum erişimi olan bir 12 h ışık/karanlık döngü ile yiyecek ve su bulundurun.

2. maksimum hız ve performans iyileştirme koşu bandı artımlı Test tarafından standart değerlendirme belirlenmesi

Not: Aşağıdaki adımları eğitim protokolleri tamamlamak için kritik öneme sahiptir.

1. Nerede fare 0 ° eğim ile birlikte, birden çok şerit üzerinde olabilir ve bir elektrikli ızgara ile monte fareler 0,2 için ayarlamak için bir motorlu koşu bandı kullanın fare çalıştırmak için teşvik etmek üzere lane, arkasında anne.
2. İlk test önce aşağıdaki protokole göre fareler iklimlendirme için koşu bandı, 4 gün için gönderin.
   1. 1 gün, 10 dakikadır 4,8 m/dak koşmak fareler var.
   2. Gün 2, 10 dakikadır 6 m/dak koşmak fareler var.
   3. 3 günde 10 dakikadır 7.2 m/dak koşmak fareler var.
   4. 4 günde 10 dakikadır 8.4 m/dak koşmak fareler var.
3. 5 günde, fareler için aşağıdaki protokolüne göre azalmasına ve dolayısıyla artımlı bir test için gönderin.
   1. Fare 4,8 m/min (at 0 ° eğim) 5 dk kadar sıcak izin.
   2. Yorgunluk, fareyi ya 3 ardışık saniye elektrikli ızgara üzerinde harcıyor. hangi ulaşılana kadar 1,2 m/dk her 3 dk (örneğin, 5 dk 4,8 m/dk, sonra 3 dk. 6 m/dk, 3 dk 7.2 m/dk, 3 dk 8.4 m/dak, vb) tarafından hızını artırmak veya 100 şoklara (cihaz tarafından görüntülenen) alır.
   3. (V_maxkabul) elde hız yazmak süre, mesafe, şokların sayısı ve ızgara üzerinde harcanan toplam zaman.
      Not: Genellikle, V_max oldu 28.8 ± 3.7 m/dak.
   4. Orta eğitim, fareler için bu test hızları (örneğin, eğitim protokolü 8 hafta sürer eğer, daha sonra 4 hafta bir orta eğitim artımlı sınama gerçekleştirmek. Güncellenme Zamanı V_max farelerin için eğitim, yeniden düzenlemek için yeniden gönderin Bu durumda, bir zamanlanmış eğitimlerin testi ile değiştirin) ve bu yüzden daha performans iyileştirmeleri değerlendirmek için çalışma sonunda bunu.
   5. Bir 48 saat dinlenme süresi önce ve sonra bu testi uygulayın.
      Not: Sabah tüm artımlı testleri yapıldı.

3. hipoksik ortamda

1. Hipoksi yılında eğitim oturumlarına bir gaz Mikser bağlantılı koşu bandı hipoksik kutusunda (şekil 1) yerleştirin. Kalibre edilmiş oksimetre oksijen (F_benO₂ [yani, hipoksi düzeyini]) ortam kısmını kutusunda düzenli olarak denetlemek için kullanın.
2. Gaz Mikser azot (N₂) % 100 ayarlayın ve oksimetre hipoksi düzeyini doğrulamak için kullanın. Bir kez F_benO₂ 0,13, = gaz Mikser parametre %100 N₂ ' den % 13 O₂olarak değiştirin.
3. Hipoksi pasif güneşe maruz önlemek amacıyla, çöp ve zenginleştirme ile geçici küçük Kafesteki fareler koyun ve hızlı bir şekilde bu kutuya koyun bir kez F_{2 ben}O = 0.13 ulaştı. Çevre kafese koyarak sonra hala_%2 13 O olduğunu doğrulayın; Eğer değilse, o yeniden ayarlayabilirsiniz.
4. Düzenli olarak F_iO₂ olarak kalır emin olmak için bir eğitim oturumu boyunca O₂ düzeyini doğrulamak = 0.13 ± 0,002.

4. Normoxic çevre

1. Normoxia eğitim oturumlarında, koşu bandı hipoksik kutuda tutun, ancak böylece ortam havası eldivenleri çıkarmak (F_{2 ben}O 0.21 =). Amaç aynı eğitim ortamı olarak hipoksi farelerde yeniden sağlamaktır.

5. Supramaximal yoğunluk eğitim

1. Fareler koşu bandı (at 0 ° eğim) bireysel şerit yerleştirin ve aşağıdaki protokol için gönderir.
   1. 5 dk kadar sıcak fare 4,8 m/dk, 5 dk 9 m/dk ardından var.
   2. Sprint %150 için önceden belirlenen V_maksimumhızını.
      Not: Genellikle, sprint hız yapıldı 42.1 ± 5.5 m/dak.
   3. Fareler 5 x 10 s Sprint 20 ile dört setleri için tren her sprint arasında kalan s. İnterset gerisi 5 dk (Şekil 2) oldu.
      Not: Eğitim oturumu toplam iş yükünü başka bir eğitim grubu maç gerekiyorsa bekleme süresi nokta eklemek.
2. Bu eğitimler arasında tercihen 48 h ile haftada 3 x eğitim gerçekleştirin.
3. Pamuk temizleme bezi elektrik şoku için tamamlayıcı bir yöntem olarak çalıştırmak için fareler teşvik etmek için kullanın. Lane, fare ve elektrikli ızgara arasında üstündeki bir yarık bir pamuk bez koyun ve koşu bandı arkası ulaştığında yavaşça fare sürükle. Bu elektrik şokları teslimini önlemek ve daha yumuşak bir şekilde çalıştırmak için fareler teşvik.

6. yüksek yoğunluklu eğitim

1. Fareler koşu bandı (at 0 ° eğim) bireysel şerit yerleştirin ve aşağıdaki protokol için gönderir.
   1. 5 dk kadar sıcak fare 4,8 m/dk, 5 dk 7.2 m/dk ardından var.
   2. Sürekli çalışan oturum hızını % 40 için önceden belirlenen V_maxayarlayın.
      Not: Tipik olarak, sürekli çalışan hızı 9.9 m/dak yapıldı.
   3. Fareler 40 dk için tren.
   4. Bu eğitimler arasında tercihen 48 h ile haftada 3 x eğitim gerçekleştirin.
   5. Pamuk temizleme bezi elektrik şoku için tamamlayıcı bir yöntem olarak çalıştırmak için fareler teşvik etmek için kullanın.

7. fareler ötenazi ve Organ çıkarma

1. Eğitim protokolü ve en az 24 saat sonra son artımlı test sonunda, fareyi isoflurane (% 4-5 anestezi ikna etmek için O_%2 ve % %100 O₂ anestezi korumak için % 1-2) kullanarak bir indüksiyon odasında anestezi. Uygun anesthetization pençe retraksiyon refleks kullanarak onaylamak (sıkıca hayvanın pençe çimdik; hayvan için uyarıcı tepki zaman anestezi uygun sayılır).
2. 25 G iğne kullanarak, en fazla kan hacmi yukarıda açıklanan¹⁹olarak toplamak için perkütan bir kardiyak ponksiyon, yerine getirin.
3. Servikal yerindençıkmasına gerçekleştirebilir ve fare deri deri yuvarlak uçlu makas ile karın üzerinde ilk katman ile kesme ve belgili tanımlık kesme (doğru baş ve kuyruk) iki tarafında çekerek kaldırmak.
4. Karın zarını göğüs kafesi altında fare sol tarafında dalak ulaşmak ve gerekirse ayıklamak için ince nokta uç makasla kesme.
   Not: Kasları gerekirse incelemek.
5. Pulmoner arter incelemek.
   1. Küçük makas ve forseps kullanarak, göğüs kafesi kaldırın ve kalp-akciğer bölgeyi boşaltın.
   2. "Kendi kendine kapanma" cımbız ile apex ve yavaşça aort ve pulmoner arter germek için çekin mümkün olduğunca yakın kalp çimdik.
   3. Sağ elini kullanan, pulmoner arter ve aort ve sonra hareket cımbız altında Ekle eğri cımbız sadece pulmoner arter (şekil 3) tutmak için biraz geri.
   4. Sol el sağ el ile düzenlenen değiştirmek için cımbız başka bir çifti eklemek için kullanın.
   5. Keskin düz microscissors sağ elinde kullanarak, kalbine mümkün olduğunca yakın olarak pulmoner arter bir tarafta ve diğer tarafta olabildiğince uzağa incelemek.
      Not: Her ne kadar sağ eli ile sol ile kesmek daha kolay bulduk hangi alet hangi elini tutan önemli değil.
   6. Soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) arabellek ile 2 mL tüp koydum ve buz üzerinde tutun.
6. Tüm vücut perfüzyon gerçekleştirin.
   1. Fareyi sağ alt bacak üst kısmında, cımbız dış-iç şu iliyak arter sağ femoral arter (inguinal ligament altında) aşağı temizlemek için kullanın. Keskin düz microscissors kullanarak, femoral arter tam bir kesim yapmak.
   2. Kalbin sol ventrikül içinde soğuk PBS ile dolu bir 5 mL 25 G şırınga yerleştirin ve hafifçe kalan kan damarları kaldırmak için soğuk PBS enjekte.
      Not: Pulmoner arter çıkarılması nedeniyle, PBS belgili tanımlık kesme ta dolaşımda değil mümkündür.
7. Cımbız kullanarak, sol ve sağ inguinal ligament üzerinden aort kalp mümkün olduğunca iyice çevreleyen yumuşak doku kaldırın.
   Not: Kalp daha fazla çözümleme için gerekirse elde edilebilir.
8. Cımbız ve microscissors kullanarak, dış iliyak arter (içinde sol ve sağ bacaklarda) en düşük noktasına kadar kalp dışarı teşrih ve tamamen disseke-out bölümü soğuk PBS ile 10 cm çapında çanak yerleştirin.
9. Cımbız ve/veya microscissors kullanarak, hafifçe çekerek veya uzak damarları kesme aort ve damar çevresinde kalan yağ temizleme bitirmek.
10. Microscissors kullanarak, sol İliak arter sol-sağ İliak arter çatallanma kesmek ve daha fazla analiz için saklayın.
11. Microscissors kullanarak, altında sol renal arter abdominal aort kesmek ve soğuk PBS arabellek buz (şekil 4) ayıklanan gemi yer.
12. Kalan temizlenmiş gemisi, aort sağ üstte sol renal arter, depolama için daha fazla çözümleme için tutmak.

Şekil 4 : Resim disseke gemilerin. Üst abdominal aort (altında sol renal arter) ayıklanan gemiden sonuna doğru iliyak arter, buz soğuk PBS arabellek yerleştirilmesi için hazır. (1) Abdominal aort. (2) sağ ortak iliyak arter. (3) dış iliyak arter. (4) iç iliyak arter. (5) Femoral arter. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

8. ex vivo vasküler işlev değerlendirmesi

Not: Bir yıkama boşaltma ve odaları ile Krebs dolumu karşılık gelir.

1. Yukarıda açıklanan protokol²⁰göre izole pulmoner arter, abdominal aort ve şu iliyak arter kesimleri 1.0-2.0 mm uzun vasküler yüzük içine kesmek ve Lümen geçirilen iki 0,1 mm çaplı stirrups üzerinde her halka monte.
2. Gemi Yüzüklerin 10 mL değiştirilmiş Krebs-zil bikarbonat çözeltisi (118.3 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 1,2 mM KH₂PO₄, 25.0 mM NaHCO₃ve 11.1 mM ile dolu dikey organ odalarında askıya alma glikoz) 37 ° C'de muhafaza ve O₂-5% CO₂ (pH 7,4) ile % 95'i gazlı. Bir üzengi organ odası altına demirlemiş olan ve diğeri bir ağırlık ölçme esneklik detektörler gram izometrik kuvvet ölçümü için bağlı.
3. Onların en iyi dinlenme gerginlik için gemiler getirmek: Yüzüklerin pulmoner arter için 0.5 g, iliyak arter için 1,5 g ve 2 g için karın aortu germek ve denge 20 dk süre sonra yıkayın. 1 x adımları yineleyin streç denge yıkama.
4. Gemilerin canlılık test etmek için Yüzüklerin KCl 235 µL ile sözleşme (10^-1 M) 10 dakikadır onları başka bir 10 dakikadır yıkamak ve tekrar KCl 235 µL ile sözleşme (10^-1 M) bir plato ulaşan kadar yaklaşık 20 dk için.
5. 10 dk daha kapları yıkamak ve endojen prostanoids mümkün girişimi engellemek için en az 20 dk 58,4 µL İndometazin (10^-5 M), (bir inhibitörü Siklooksijenaz aktivitesi olan) ekleyin.
6. Phenylephrine (Phe) toplu doz 10^-9 (10 µL) 10^-4 için M eklemek (veya 10^-9 10^-5 M pulmoner arter için; için 10^-9 M yukarıda tüm konsantrasyonlarda için 9 µL) damarları sözleşme için.
7. Gemilerin nispeten istikrarlı daralma devlet (Yaylası) ulaşana kadar Phe son doz sonra 1 h için bekleyin.
8. 10^-9 10^-4 M için gelen endotel bağımlı vazodilatör asetilkolin (ACh), (10^-9 M, için 58,4 µL ve dönüşümlü olarak 12.6 µL ve 10^-9 M yukarıda tüm konsantrasyonlarda için 40 µL), nitrik ikna etmek için toplu doz Ekle oksit (NO)-gevşeme aracılı.
9. Gevşeme eğrinin sonundaki 10 dk kapları yıkama ve İndometazin (10^-5 M) 58,4 µL NG-nitro-L-NOS, en az 20 dk için bir inhibitörü olan arginin (NLA, 10^-4 M), 184 µL ekleyin.
10. Gemi tekrar nispeten istikrarlı bir daralma ikna etmek için Phe (10^-5 ve 10^-4 M için pulmoner arter ve 10^-4 M abdominal aort ve iliyak arter) için 1 h, 10 µL benzersiz bir doz ile sözleşme.
11. Ach 40 µL benzersiz bir doz ekleyin (10^-4 M) kadar bir plato ulaştı.
12. İndometazin (10^-5 M) 58,4 µL eklemeden önce 10 dk, tekrar kapları yıkamak ve NLA 184 µL (10^-4 M) 20 dk için.
13. Gemi Phe (10^-5 ve 10^-4 M) 10 µL için 1 h ile sözleşme.
14. Toplu dozlarda ekleyin (10^-9 [58,4 µL] 10^-4 M için [10^-9 M yukarıda tüm konsantrasyonlarda için 40 µL]) Hayır donör diethylamine (DEA) / Hayır, içinde sipariş NO kaynaklı endotel bağımsız gevşeme değerlendirmek için.
15. Deney sonunda, gemilerin gerekirse gelecekteki analizleri için sıvı azot depolamak.

Sonuçlar

Bilgimizi, bu da çalışmanın bir program supramaximal yoğunluk eğitim normoxia ve hipoksi fareler için açıklamak için ilkidir. Bu protokol için fareler her sprint arasında 20 s kurtarma dört beş 10 s Sprint kümesini koştu. Bu grup kurtarma dönemleri ile 5 dk serpiştirilmiş. Fareler ve böyle bir protokol sürdürme yeteneğine sahip olması düzgün tamamlamak bilinmiyordu. Ancak, şekil 5göre vücut kilo supramaximal yoğunluk eğitim geç...

Tartışmalar

Bu çalışmanın ilk hedefi farelerde hipoksik yoğun eğitim fizibilite değerlendirmek için ve iyi fareler tarafından tolere Protokolü yeterli özelliklerini belirlemek için yapıldı. Supramaximal (yani, daha fazla V_max) yoğunluk eğitim farelerde kullanarak veri beri amaçsız, önceki iletişim kuralları, beş all-out Sprint (yaklaşık %200 4-5 kümelerinden oluşan sporcular ile geliştirilen dayalı çalışmalar gerçekleştirmek zorunda V_max), 5 dk^21,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cotton swab	Q-tip
Gas mixer Sonimix 7100	LSI Swissgas, Geneva, Switzerland		Gas-flow: 10 L/min and 1 L/min for O2 and CO2, respectively
Hypoxic Box	Homemade		Made in Plexiglas
Motorized rodents treadmill Panlab LE-8710	Bioseb, France
Oximeter Greisinger GOX 100	GREISINGER electronic Gmbh, Regenstauf, Germany
Sedacom software	Bioseb, France
Strain gauge	PowerLab/8SP; ADInstruments