Supramaximal 강도 Hypoxic 운동과 쥐에 혈관 기능 평가

요약

Hypoxia에서 고 강도 훈련 프로토콜 입증 된 일부 환자에서 잠재적으로 유리한 혈관 적응을 유도 하 고 선수를 개선 하기 위해 반복 스 프린트 능력 이다. 여기, 우리는 프로토콜을 식별 비보 관 기능 평가 전을 사용 하 여 이러한 혈관 적응 훈련 마우스 사용 하 여의 타당성을 테스트 합니다.

초록

운동 훈련은 건강을 유지 하 고 많은 만성 질병을 방지 하기 위한 중요 한 전략 이다. 그것은 심장 혈관 질병, 더 구체적으로, 고통 받는 환자 낮은 말단 동맥 질환, 어디는 환자의 걷는 용량 상당히 변경에 대 한 국제 가이드라인에서 권장 하는 치료의 첫 번째 줄에 영향을 미치는 그들의 질의 생활입니다.

전통적으로, 낮은 지속적인 운동과 간격 훈련을 모두 사용 되었습니다. 최근, supramaximal 훈련 또한 선수 공연을 통해 혈관 각 색 한, 다른 메커니즘 들을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. Hypoxia 훈련의이 종류의 조합을 수 있습니다 특정 pathologies에 대 한 관심의 추가 또는 synergic 효과 가져올 수 있었다. 여기, 우리는 자동화 된 디딜 방 아와 hypoxic 상자를 사용 하 여 그들의 최대 속도의 150%에서 건강 한 쥐에 hypoxia에서 supramaximal 강도 훈련 세션을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 관심의 장기를 찾기 위해 마우스 해 부 하는 방법을 보여 특히 폐 동맥, 복 부 대동맥과 장 골 동맥. 마지막으로, 우리는 아이소메트릭 긴장 연구를 사용 하 여 검색 된 혈관에 비보 관 기능 평가 전 수행 하는 방법을 보여줍니다.

서문

저 산소 증, 산소 (O₂)의 감소 영감된 분수 hypoxemia (hypoxia에서 낮춘된 동맥 압력)와 변경 된 O₂ 전송 용량¹리드. 급성 저 산소 증은 골격 근육² 와 반대 '보상' vasodilatation 감독 증가 공감 vasoconstrictor 활동을 유도 합니다.

Hypoxia에서 submaximal 강도,이 '보상' vasodilatation, , normoxic 조건 운동의 동일한 레벨 기준으로 잘 설립된³입니다. 이 혈관은 증강된 혈액 흐름 및 유지 보수 (또는 변경 제한) 필수적 이다 활성 근육에 산소 공급의. 아데노신이 없는 독립적인 역할이이 응답에서 산화 질소 (NO) 때문에 hypoxic 중 산화 질소 synthase (NOS) 억제로 알려졌다 증강된 vasodilatation의 중요 한 blunting 기본 내 피 소스 것 표시 했다 ⁴운동. 다른 여러 vasoactive 물질은 가능성이 재생 역할에 보상 vasodilatation hypoxic 운동을 하는 동안.

이 향상 된 hypoxic 운동 충 hypoxia 유발 하는을에 비례 동맥 O₂ 콘텐츠에서 이며 운동 강도가 증가할수록 큰 예 hypoxia에서 강렬한 증분 운동을 하는 동안.

보상 vasodilatation 아니 중재 구성 요소 증가 운동 강도³다른 경로 통해 통제 된다: β-아드레날린 수용 체-자극 없이 구성 하는 경우 낮은 강도 hypoxic 운동 동안 파라마운트 나타납니다 보상 팽창에 기여 하는 아무 소스 운동 강도 증가 β-아드레날린 메커니즘에 덜 의존 것으로 보인다. 적혈구 및 내 피 파생 prostaglandins 발표 ATP 등 강도 높은 hypoxic 운동을 하는 동안 아무 릴리스를 자극에 대 한 다른 후보 있다.

저 산소 증 (hypoxia [RSH]에서 반복된 스 프린트 훈련 운동 생리학 문학에서 이라는)에 Supramaximal 운동은 이다는 최근 훈련 방법⁵ 팀 또는 라켓 스포츠 선수에 성능 향상을 제공. 이 방법은 다른 간격 hypoxia에서 수행에 훈련에서 또는 최대 속도⁶ (V_최대) 근처에서 RSH 수행 후 최대 강도에 이르게 큰 근육 관류와 산소⁷ 와 특정 근육 transcriptional 응답⁸. RSH의 효과 설명 하기 위해 몇 가지 메커니즘 제안: hypoxia에서 달리기, 동안 보상 혈관 확장 및 관련 된 높은 혈액 흐름 도움이 될 것 이라고 빠른 트 위치 섬유 보다는 더 느린 트 위치 섬유. 따라서, RSH 효율성 섬유 유형 선택 및 강도 종속 될 것입니다. 우리 혈관 시스템의 향상 된 응답성은 RSH에 답해야 추측.

운동 훈련은 쥐, 둘 다 건강 한 개인에서 병 적인 마우스 모델^9,10에 광범위 하 게 연구 되었습니다. 쥐를 훈련 하는 가장 일반적인 방법은 설치류 디딜 방 아를 사용 하 고 전통적으로 사용 된 처방은 낮은-강도 훈련, V_최대 (증분 디딜 방 아 시험¹¹를 사용 하 여 결정)의 40%-60%에서 30-60 분^{12,13 ,,1415}. 최대 강도 간격 훈련과 pathologies에 미치는 영향 널리 연구 쥐^16,17; 따라서, 간격 훈련 마우스 실행 프로토콜 개발 되었습니다. 이러한 프로토콜은 일반적으로 설치류 자동화 된 디딜 방 아, 1-4 분, 나머지는 활성 또는 수동^16,18interspersed V_최대 의 80%-100%에서 실행의 약 10 복싱의 구성.

Hypoxia에서 (즉, 위는 V_최대) supramaximal 강도에서 운동 하는 쥐에 관심 microvascular vasodilatory 보상 및 간헐적 운동 성능을 모두 더에서 증가 이전 결과에서 온다 supramaximal 보다 최대한 또는 적당 한 농도. 그러나, 우리의 지식, 생쥐, normoxia 또는 hypoxia에서에서 supramaximal 훈련 프로토콜의 이전 보고서가입니다.

현재 연구의 첫 번째 목표는 마우스와 쾌활 하 고 적절 한 프로토콜 (강도, 스 프린트 기간, 복구, 등)의 결정에 supramaximal 강도 훈련의 타당성을 테스트 했다. 두 번째 목표는 혈관 기능에 normoxia와 hypoxia에서 다른 훈련 식이요법의 효과 평가 했다. 따라서, 우리는 (1) 쥐 hypoxia, supramaximal 운동을 잘 용납 하 고이 프로토콜 보다 더 낮은 농도에 산소에 운동 뿐만 아니라 normoxia에 운동 보다는 혈관 기능에 큰 개선 유도 (2) 가설을 테스트 합니다.

프로토콜

현지 국가의 동물 보호 위원회 (서비스 드 라 소비 외 데 레 아 페르 Vétérinaires [SCAV], 로잔, 스위스) 모든 실험을 승인 (승인 VD3224; 01.06.2017) 및 모든 실험 관련에 따라 실시 했다 지침 및 규정

1. 동물 주택 및 준비

1. 하우스 6 8 주 오래 된 C57BL/6J 남성 쥐 쥐에 실험 시작 전에 적어도 1 주 동안 동물 시설에 그들의 새로운 주택 조건에 사용. 실용적인 이유로, 동일한 실험적인 그룹의 마우스는 일반적으로 보관 되어 함께.
2. 음식과 물에는 온도 제어 룸 (22 ± 1 ° C) ad libitum 액세스와 12 h 명암 주기에서에서 생쥐를 유지.

2. 최대 속도 및 성능 향상 증분 테스트 디딜 방 아의 표준 평가의 결정

참고: 다음 단계는 훈련 프로토콜을 완료 하려면 중요 합니다.

1. 쥐 쥐 0 ° 경사와 함께, 여러 차선에 있을 수 있습니다와 전기 그리드와 탑재 0.2로 설정 자동화 된 디딜 방 아를 사용 하 여 실행 하려면 마우스를 촉진 하기 위해 차선 뒤 엄마.
2. 첫 번째 테스트 전에 다음 프로토콜에 따라, 디딜 방 아에 순응의 4 일 쥐를 제출 합니다.
   1. 하루에 1, 4.8 m/분에서 10 분 동안 실행 하는 마우스를 있다.
   2. 하루에 2, 6 m/분에서 10 분 동안 실행 하는 생쥐를 있다.
   3. 3 일에 7.2 m/분에서 10 분 동안 실행 하는 생쥐를 있다.
   4. 하루에 4, 8.4 m/분에서 10 분 동안 실행 하는 생쥐를 있다.
3. 5 일에 피로, 다음 프로토콜에 따라 증분 테스트에 마우스를 제출 합니다.
   1. 워밍업 5 분 4.8 m/분 (0 ° 경사)에 쥐를 보자.
   2. 때 마우스는 중 전기 그리드에서 3 년 연속 초 지출에 도달 하면 피로까지 1.2 m/분 마다 3 분 (예: 4.8 m/min, 다음 3에서 6 m/분, 7.2 m/분, 8.4 m/분, 등에서 3 분 3 분에서 5 분) 하 여 속도 증가 또는 (표시는 장치에 의해) 100 충격을 받습니다.
   3. 그리고 격자에 소요 된 총 시간 기간, 거리, 충격, 수 달성된 속도 (V_최대으로 간주)를 적어 둡니다.
      참고: 일반적으로, V_최대 은 28.8 ± 3.7 m/분.
   4. 중간 훈련 (예를 들어, 경우 훈련 프로토콜 8 주 지속 다음 4 주 중반 교육 증분 테스트를 수행에 업데이트 된 V_최대 생쥐의 훈련의 속도 조정 하기 위해이 테스트에 마우스를 다시 제출 합니다. 그 경우에, 대체 예정된 교육 중 테스트에 의해), 그리고 성능 향상을 평가 연구의 끝에 이렇게 다시 할.
   5. 이 테스트 전후 48 h 휴식 기간을 구현 합니다.
      참고: 모든 증분 테스트 아침에 수행 했다.

3. 산소가 적은 환경

1. Hypoxia에서 훈련 세션에 대 한 디딜 방 아 hypoxic 상자 (그림 1)에서 가스 믹서에 연결 장소. 보정된 속도도 사용 하 여 정기적으로 상자에 산소 (F_iO₂ [즉, 산소의 수준])의 주변 부분을 제어.
2. 질소 (N₂)의 100%에 가스 믹서를 설정 하 고 산소의 수준을 확인 하는 속도도 사용. 일단 F_iO₂ = 0.13, 13% O₂를 100% N₂ 가스 믹서의 매개 변수를 변경.
3. Hypoxia에 장기간된 수동 노출 피하려면 쥐에 쓰레기와 농축, 임시 작은 케이지 하 고 신속 하 게 배치 상자에서 한 번 F_iO₂ = 0.13에 도달 했습니다. 환경 인지 확인 13% O₂ 에 아직도; 감 금 소를 두기 후에 그렇지 않으면, 그것을 조정.
4. 정기적으로 그것은 F_iO₂ 에 남아 있는지 확인 하는 훈련의 과정을 통해 O₂ 의 레벨을 확인 0.13 ± 0.002 =.

4. Normoxic 환경

1. Normoxia에서 훈련 세션에 대 한 hypoxic 상자에 디딜 방 아를 유지 하지만 그렇게 거기에 주변 공기 장갑 제거 (F_iO₂ = 0.21). 목표는 hypoxia에서 쥐로 같은 교육 환경을 재현 하는.

5. Supramaximal 강도 훈련

1. (0 ° 경사)에 디딜 방 아에 개별 차선에 쥐를 놓고 다음과 같은 프로토콜에 그들을 제출 합니다.
   1. 5 분 워밍업 쥐 4.8 m/분, 9 m/분에서 5 분 뒤에 있다.
   2. 달리기의 속도는 이전 결정 V_최대의 150%로 설정 합니다.
      참고: 일반적으로 스 프린트 속도 42.1 ± 5.5 m/분.
   3. 5 x 10의 달리기 20의 4 세트에 대 한 생쥐 기차 각 스 프린트 사이 나머지의 s. Interset 나머지는 5 분 (그림 2).
      참고: 훈련 세션의 총 작업 다른 훈련 그룹의 일치 하는 경우 cooldown 기간을 추가 합니다.
2. 이 선호 48 h 훈련 세션 사이 주당 3 배 훈련을 수행 합니다.
3. 전기 충격에 보완적인 방법으로 면봉을 사용 하 여 실행 하려면 마우스를 격려. 마우스와 전기 그리드 사이 레인 맨 슬릿에 면봉을 놓고 부드럽게 디딜 방 아의 뒷면에 도달 하면 마우스를 이동 합니다. 이 전기 충격의 전달을 방지 하 고 부드러운 방식으로 실행 하려면 마우스를 자극.

6. 낮은-강도 훈련

1. (0 ° 경사)에 디딜 방 아에 개별 차선에 쥐를 놓고 다음과 같은 프로토콜에 그들을 제출 합니다.
   1. 5 분 워밍업 쥐 4.8 m/min, 7.2 m/분에서 5 분 뒤에 있다.
   2. 40%는 이전 결정 V_최대의 지속적인 실행 중인 세션의 속도 설정 합니다.
      참고: 일반적으로, 연속 실행 속도 9.9 m/분 이었다.
   3. 40 분 동안 쥐를 훈련.
   4. 이 선호 48 h 훈련 세션 사이 주당 3 배 훈련을 수행 합니다.
   5. 전기 충격에 보완적인 방법으로 면봉을 사용 하 여 실행 하려면 마우스를 격려.

7. 마우스 안락사와 장기 추출

1. 훈련 프로토콜 및 마지막 증분 테스트 후 적어도 24 시간의 끝에 있는 유도 챔버에서 isoflurane (4%-5% O₂ 마 취를 유도 하 고 마 취를 유지 하기 위해 100% O₂ 에서 1%-2%)를 사용 하 여 마우스 anesthetize. 적절 한 anesthetization 발 도피 반사를 사용 하 여 확인 (동물의 발을 단단히 꼬집어; 동물 자극에 반응 하지 않는 경우 마 취에 적절 한 간주 됩니다).
2. 25g 바늘을 사용 하 여 앞에서 설명한¹⁹로 최대 혈액 볼륨을 수집 경 피 적인 심장 펑크를 수행 합니다.
3. 자 궁 경부 전위를 수행 하 고 라운드 팁 위 복 부에 피부의 첫 번째 레이어를 통해 절단 및 (쪽으로 머리와 꼬리) 절 개의 양쪽에서 당기는 마우스의 피부를 제거.
4. 얇은 포인트 팁이 위는 비장에 도달 하 고 필요 하다 면 그것을 추출 하는 마우스의 왼쪽에 흉 곽 아래 복 통해 잘라.
   참고: 필요한 경우 근육 해 부.
5. 폐 동맥에 밖으로 해 부.
   1. 작은 위, 겸 자 사용 하, 흉부 케이지를 제거 하 고 심장-폐 영역 선택을 취소.
   2. "자동 닫기" 족집게로 꼭대기를 부드럽게 스트레칭 대동맥 아치와 폐 동맥의 기본을 최대한 가까이 마음을 꼬집어.
   3. 오른손을 사용 하 여, 폐 동맥 및 대동맥, 및 다음 이동 핀셋 삽입 곡선된 핀셋 폐 동맥 (그림 3)만을 조금 다시.
   4. 왼손을 사용 하 여 오른쪽으로 하나를 대체 하는 핀셋의 또 다른 쌍을 삽입.
   5. 오른손에서 날카로운 직선 microscissors를 사용 하 여, 1 개의 측에 그리고 멀리 가능한 다른 쪽에에 가능한 마음으로 폐 동맥 해 부.
      참고: 그것은 중요 하지 않습니다 어느 손이 어떤 악기를 보유 하 고 있지만 우리는 왼쪽 보다 오른쪽 손으로 잘라 쉽게 나타났습니다.
   6. 그것 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 버퍼 2 mL 튜브에 넣고 얼음에 계속.
6. 전신 관류를 수행 합니다.
   1. 마우스의 오른쪽 하단 다리의 상단에 핀셋을 사용 하 여 (사 타 구니 인 대) 아래 오른쪽 대 퇴 동맥으로 외부 내부 오른쪽 장 골 동맥을 취소. 날카로운 직선 microscissors를 사용 하 여 대 퇴 동맥에 전체 컷을 확인 합니다.
   2. 심장의 좌 심 실에서 차가운 PBS 가득 5 mL 25 G 주사기를 넣고 부드럽게 혈관에서 나머지 혈액을 제거 하는 차가운 PBS를 주입 합니다.
      참고: 때문에 폐 동맥의 추출, PBS는 절 개를 순환 하지 않는 가능 하다.
7. 족집게를 사용 하 여 가능한 철저 하 게 마음에 왼쪽 및 오른쪽 사 타 구니 인 대에서 대동맥 주변 부드러운 조직을 제거 합니다.
   참고: 필요한 경우 추가 분석에 대 한 마음을 추출할 수 있습니다.
8. 족집게와 microscissors를 사용 하, 가장 낮은 지점 (왼쪽 및 오른쪽 사지)에 외부 장 골 동맥의 심장 밖으로 해 부 고 차가운 PBS로 10 cm 직경 접시에 완전히 해 부 아웃 섹션을 놓습니다.
9. 핀셋 / microscissors using, 부드럽게 당기 거 나 혈관에서 절단 하 여 대동맥과 동맥 주위 나머지 지방 청소 완료.
10. Microscissors를 사용 하 여 왼쪽 오른쪽 장 골 동맥 분기에서 왼쪽된 장 골 동맥을 잘라 고 추가 분석을 위해 그것을 저장 합니다.
11. Microscissors를 사용 하 여 왼쪽된 신장 동맥 아래 복 부 대동맥을 잘라 고 얼음 (그림 4)에 차가운 PBS 버퍼에 추출 된 선박을 배치.
12. 추가 분석에 대 한 저장소에서 왼쪽된 신장 동맥 위에 오른쪽 대동맥 아치에서 나머지 청소 용기를 유지.

그림 4 : 해 부 혈관의 그림. 오른쪽 장 골 동맥, 얼음 차가운 PBS 버퍼에 배치 될 준비가 끝에 복 부 대동맥 (아래 왼쪽된 신장 동맥)의 상단에서 추출 된 용기. (1) 복 대동맥입니다. (2) 바로 일반적인 장 골 동맥 (3) 외부의 장 골 동맥 (4) 내부의 장 골 동맥 (5) 대 퇴 동맥입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

8. 전 비보 관 기능 평가

참고: 세척은 비우는 및 Krebs와 챔버의 채우는에 해당 합니다.

1. 앞에서 설명한 프로토콜²⁰에 따라 격리 된 폐 동맥, 복 부 대동맥, 그리고 오른쪽 장 골 동맥 세그먼트 긴 1.0-2.0 m m의 혈관 고리를 잘라내어 두 0.1 m m 직경 등 통과 루멘에 각 반지를 탑재.
2. 수정된 Krebs 벨소리 중 탄산염 솔루션 (118.3 m m NaCl, 4.7 m m KCl, 2.5 m m CaCl₂, 1.2 m m MgSO₄, 1.2 m m KH₂포₄, 25.0 m m NaHCO₃및 11.1 mM의 10 mL 가득 수직 기관 실에서 배 링 일시 중단 포도 당) 37 ° C에서 유지 하 고 화난 95% O₂-5% CO₂ (pH 7.4). 한 등 자 기관 챔버의 바닥에 고정 되 고 다른 하나는 그램에서 아이소메트릭 힘의 측정에 대 한 스트레인 게이지에 연결 되어.
3. 그들의 최적의 휴식 긴장을 혈관을가지고: 0.5 g 폐 동맥, 장 골 동맥에 대 한 1.5 g 및 복 부 대동맥에 대 한 2 g 고리를 스트레칭 하 고 평형의 20 분 후 씻어. 스트레치-평형-워시 1 x 단계를 반복 합니다.
4. 혈관의 생존 능력을 테스트 하기 위해 고리 KCl의 235 µ L 계약 (10^-1 M) 10 분, 또 다른 10 분 동안 그들을 세척 하 고 KCl의 235 µ L와 다시 계약 (10^-1 M) 고원 도달까지 약 20 분.
5. 다시 10 분 동안 배를 세척 하 고 내 생 prostanoids의 가능한 간섭을 방지 하기 위해 적어도 20 분 동안 58.4 µ L indomethacin (10^-5 M)의 (cyclooxygenase 활동의 억제제)를 추가.
6. 10^-4 M를 10^-9 (10 µ L)에서 phenylephrine (Phe)의 누적 복용량을 추가 (또는 10^-5 M 폐 동맥; 대 하 10^-9 10^-9 M 이상의 모든 농도 대 한 9 µ L) 혈관을 계약.
7. 혈관 (고원) 상대적으로 안정적인 수축 상태에 도달 될 때까지 페의 마지막 복용 후 약 1 시간에 대 한 기다립니다.
8. 추가 누적 복용량은 endothelium 종속 vasodilator 아 세 틸 콜린 (ACh), 10^-4 M에 10^-9 에서 (58.4 µ L 10^-9 M, 대 고 번갈아 12.6 µ L 40 µ L 10^-9 M 이상의 모든 농도 대 한), 질소 유도 하 산화물 (NO)-중재 하는 휴식.
9. 이완 곡선의 끝에, 10 분, 배를 세척 하 고 NG-니트로-L-아르기닌 (NLA, 10^-4 M)은 적어도 20 분 동안 해의 억제제의 184 µ L indomethacin (10^-5 M)의 58.4 µ L을 추가.
10. 다시 페 (10^-5 및 10^-4 M 고 폐 동맥에 대 한 10^-4 복 부 대동맥과 장 골 동맥에 대 한 M) 1 시간에 대 한 상대적으로 안정적인 수축 유도 하의 10 µ L의 독특한 복용량과 함께 선박을 계약.
11. ACh의 40 µ L의 독특한 복용량을 추가 (10^-4 M) 고원 도달까지.
12. Indomethacin (10^-5 M)의 58.4 µ L를 추가 하기 전에 10 분 동안 다시 용기를 세척 및 NLA의 184 µ L (10^-4 M) 20 분.
13. 1 시간에 대 한 페 (10^-5 및 10^-4 M)의 10 µ L로 선박을 계약.
14. 추가 누적 복용량 (10^-9 [58.4 µ L] 10^-4 M를 [10^-9 M 이상의 모든 농도 대 한 40 µ L]) 아니 기증자 diethylamine (마약)의 / 아니, endothelium 독립 없음 유도 휴식을 평가 하기 위해서는.
15. 실험의 끝에, 필요한 경우 향후 분석을 위해 액체 질소에 혈관을 저장 합니다.

결과

우리의 지식을 하려면, 현재 연구 normoxia와 hypoxia 마우스 supramaximal 강도 훈련 프로그램을 설명 하기 위해 처음 이다. 이 프로토콜에서 마우스 각 스 프린트 사이 20 s 복구 5 10의 달리기의 4 세트를 달렸다. 세트의 복구 기간 5 분 interspersed 했다. 그것은 여부 쥐 같은 프로토콜을 유지 할 수 있을 것이 고 제대로 완료 알려지지 않았다. 그러나, 그림 5에 따...

토론

이 연구의 첫 번째 목적은 마우스에 hypoxic 강도 높은 훈련의 타당성을 평가 하 고 쥐에 의해 잘 용납 될 것입니다 프로토콜의 적절 한 특성을 결정 했다. 고의로, 쥐에 supramaximal (즉, 보다 더 많은 V_최대) 강도 훈련을 사용 하 여 데이터가 있기 때문에, 우리가 수행 했다 선수, 4 ~ 5 세트 5 전면적인 달리기 (약 200%의의와 개발 이전 프로토콜에 기반으로 하는 재판 V_최대), 5 분

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cotton swab	Q-tip
Gas mixer Sonimix 7100	LSI Swissgas, Geneva, Switzerland		Gas-flow: 10 L/min and 1 L/min for O2 and CO2, respectively
Hypoxic Box	Homemade		Made in Plexiglas
Motorized rodents treadmill Panlab LE-8710	Bioseb, France
Oximeter Greisinger GOX 100	GREISINGER electronic Gmbh, Regenstauf, Germany
Sedacom software	Bioseb, France
Strain gauge	PowerLab/8SP; ADInstruments