JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Özet

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) sistem doğal olarak bakteriyel edinilmiş bağışıklık fonksiyonları ama başarılı bir şekilde pek çok farklı canlıların genom mühendisliği için repurposed. En sık wildtype CRISPR 9 (Cas9) ilişkili veya Cas12a endonükleaz sonra homolog olmayan sonunda (NHEJ) yol veya onarım homoloji-yönetmen (katılma yolu ile DNA çift iplikçikli sonu onarılana genom, belirli sitelerde ayırmak için kullanılır Bir donör şablon olmasına bağlı olarak HDR) yolu yok veya sırasıyla mevcut. Bugüne kadar farklı bakteri türleri sistemlerden CRISPR genom memeli hücrelerinde düzenleme gerçekleştirme yeteneğine sahip olması gösterilmiştir. Ancak, teknoloji belirgin basitliğine rağmen birden çok tasarım parametrelerinin değerlendirilmesi, hakkında en iyi deneyler düzenleme onların genom taşımak için çapraşık kullanıcılar sık sık terk gerekir. Burada, tam bir iş akışı deneysel tasarım başarılı memeli hücre hatları deneylerde düzenleme genom yürütülmesini kolaylaştırmak amacı ile istenilen DNA değişiklikleri taşıyan Hücre klonlar tanımlaması için açıklamak. Biz kullanıcıların, dikkat çekmek kritik noktalar CRISPR sistem, rondela uzunluğu ve tek iplikçikli oligodeoxynucleotide (ssODN) donör şablonunun tasarımını seçimi de dahil olmak üzere vurgulayın. Biz bu iş akışı için gen nakavt çalışmaları, çabaları, modelleme hastalığı faydalı olacaktır veya satırları üretimi muhabiri hücre öngörülüyor.

Giriş

Hastalığa neden olan düzeltilmesi gibi birçok Biyomedikal ve Biyoteknolojik uygulamaları herhangi bir canlı organizma genom mühendis yeteneğine sahiptir mutasyonlar, hastalık çalışmalar için doğru hücresel modelleri inşaatı veya, tarımsal üretimi arzu edilen özellikleri ile bitkileri. Yüzyılın beri genom Mühendisliği dahil meganucleases1,2,3memeli hücrelerinde için çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir, parmak nükleaz4,5, çinko veya Transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs)6,7,8,9. Ancak, bu önceki böylece onların yaygınlaşmasının araştırma ve endüstrisi engelleyici programı için zor ya da sıkıcı bir araya getirmek teknolojilerdir.

Son yıllarda, kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik yineler (CRISPR) interspaced - CRISPR-ilişkili (Cas) sistem teknoloji10,11mühendislik güçlü yeni genom ortaya çıkmıştır. Aslında bir adaptif bağışıklık sisteminde bakteri, başarıyla oldu genom değişiklik bitkiler ve hayvanlar, insanlar da dahil olmak üzere dağıtılmış. Neden CRISPR-Cas kısa bir sürede çok popülerlik kazanmıştır bir temel nedeni bu Cas9 veya Cas12a (Ayrıca Cpf1 da bilinir) gibi anahtar Cas endonükleaz getiriyor öğe, genom doğru konuma chimeric tek Kılavuzu RN sadece kısa bir parçası (SgRNA), bir tasarım için basit ve ucuz sentezlemek. Hedef siteye işe ediliyor sonra CA'ları enzim moleküler makas çifti olarak işlev görür ve onun RuvC, HNH veya Nuc etki alanları12,13,14ile ilişkili DNA cleaves. Elde edilen çift telli sonu (DSB) daha sonra homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma veya homoloji yönetmen onarım (HDR) yolu ile hücreleri tarafından onarıldı. Onarım şablon yokluğunda, DSB potansiyel olarak protein kodlayıcı genlerin frameshift mutasyonlar neden çıkmasına neden takma ad-rasgele ekleme veya silmek-in nükleotit (indels) kesim yerinde olabilir, hataya NHEJ yolu tarafından onarıldı. Ancak, istediğiniz DNA değişiklikleri içeren bir donör şablonu huzurunda DSB yüksek sadakat HDR yolu tarafından onarıldı. Donör şablonları sık karşılaşılan tek iplikçikli oligonucleotides (ssODNs) ve plazmid bulunmaktadır. Eğer bir nispeten uzun bir sıra eklemek dilek ikinci genellikle kullanılırken dilediğiniz DNA değişiklikleri (örneğin, tek bir baz çifti İLETİMLERİNİZE), küçük eski genellikle kullanılır (örneğin, bir yeşil flüoresan protein kodlama dizisi veya GFP) hedef locus içine.

CA'ları protein endonükleaz Etkinlik hedef site15bir protospacer bitişik motifi (PAM) olmasını gerektirir. (Cpf1 olarak da bilinir) Cas12a PAM 5' sonunda bunun yerine olmakla Cas9 PAM163' sonunda protospacer olduğunu. Cas-Kılavuzu RNA karmaşık PAM17ise bir DSB tanıtmak değiştiremiyor. Bu nedenle, PAM belirli bir Cas nükleaz ayırmak mümkün nerede genomik Mekanlar üzerinde bir kısıtlama yerleştirir. Neyse ki, Cas enzimler farklı bakteri türleri üzerinden genellikle farklı PAM gereksinimleri sergi. Bu nedenle, çeşitli CRISPR-Cas sistemleri mühendislik bizim alet entegre ederek, bir genom hedefleyebilir siteleri aralığını genişletebilirsiniz. Ayrıca, doğal bir Cas enzim mühendislik veya daha fazla genomik hedefleri manipülasyon18,19,20' ye erişilebilir kapsamını genişletme alternatif PAM dizileri tanımasını gelişti.

Teknolojisi çoğu kullanıcı için birden çok nedeni birden çok CRISPR-Cas sistemi genom mühendislik amaçları için kullanılabilir olmakla birlikte, ağırlıklı olarak Cas9 nükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden yararlanmıştır. Birincisi, bir nispeten sade bir şekilde NGG PAM, aksine sadece varlığında daha karmaşık PAMs bölmek birçok diğer Cas protein gerektirir. İkincisi, bu insan hücreleri21,22,23,24' te başarılı bir şekilde dağıtılması için ilk Cas endonükleaz 's. Üçüncü olarak, SpCas9 bugüne kadar en iyi karakterize enzim gereğidir. Bir araştırmacı başka bir Cas nükleaz kullanmak isterse, o ya da o sık sık tasarım deneme ve nasıl su kuyusu diğer enzimler için SpCas9 göre farklı biyolojik bağlamlarda yapmak için en iyi nasıl hakkında belirsiz olur.

Farklı CRISPR-Cas sistemleri göreli performansını konusunu açıklığa kavuşturmak amacıyla, biz son zamanlarda beş Cas endonucleases – SpCas9, Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzim dan gelen Cas9 enzim sistematik karşılaştırılması gerçekleştirdiyseniz Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzim Acidaminococcus sp. BV3L6 üzerinden (AsCas12a) ve Cas12a enzim (LbCas12a) Lachnospiraceae bakteri ND2006 üzerinden25. Adil bir karşılaştırma için hedef siteleri ve diğer deneysel koşullar aynı kümesini kullanarak çeşitli Cas nükleaz değerlendirildi. Teknoloji kullanıcıları için yararlı bir başvuru olarak hizmet verecek her CRISPR-Cas sistem ayrıca belirlenen çalışma tasarım parametreleri. Burada, daha iyi araştırmacılar CRISPR-CA'larına faydalanmak için etkinleştirme sistemi, biz en iyi genom Mühendisliği (bkz. şekil 1) farklı Cas9 ve Cas12a enzimleri ile için adım adım bir protokol sağlar. Protokol sadece başarılı genom mühendislik sonucu memeli hücrelerinde olasılığını en üst düzeye çıkarmak için de önemli tasarım konuları ama deneysel ayrıntıları içerir.

figure-introduction-6012
Resim 1 : İnsan hücre hatları düzenlenmiş genom oluşturmak için iş akışının genel bir bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

1. tasarım sgRNAs

  1. Uygun bir CRISPR-Cas sistemi seçin.
    1. İlk olarak, hedef bölge içinde memeli hücreleri16,21-32işlevsel olması için gösterilen tüm Cas9 ve Cas12a enzimler PAM dizisi için kontrol edin. Beş sık kullanılan enzimler Tablo 1 onların anılan sıraya göre PAMs birlikte verilmiştir.
      Not: yanında endonucleases Tablo 1' de listelenen, Streptococcus thermophilus (St1Cas9) üzerinden Cas9 nükleaz gibi memeli hücrelerinde de, başarılı bir şekilde dağıtılan daha az kullanılan diğer CA'lar enzimler vardır bu PAM NNAGAAW tanır. İstenen hedef site bilinen PAM içermiyorsa, o zaman bir genom mühendisliği için CRISPR-Cas sistemi kullanmak mümkün olmaz.
    2. İkinci olarak, hedef genomik odağı veya gen bilinen herhangi bir özelliklerini göz önünde bulundurun. Gen ifade düzeyleri veya Kromatin erişilebilirlik dikkate almak için bazı özellikler içerir ve yakından diğer olup dizileri de ilgili.
      Not: Bazı enzimler belirli biyolojik bağlamları için daha uygundur. Örneğin, bir tekrarlayan genomik odağı veya bir gen ile birkaç diğer yakın paralogs düzenlemek için bu her iki AsCas12a (nedeniyle SpCas9 ve LbCas12a daha onun alt dayanıklılık için sgRNA ve hedef DNA arasında uyuşmazlıklar için) kullanmak için tavsiye edilir veya SaCas9 (nedeniyle onun daha yüksek hedefleme özgüllük sağlayan uzun mesafe tutucular, gereksinimini)25.
CA'ları endonükleazPAMEn iyi yer açıcı uzunluğu
SpCas9NGG17-22 nt (dahil)
SaCas9NNGRRT≥ 21 nt
NmCas9NNNNGATT≥ 19 nt
AsCas12a ve LbCas12aTTTV≥ 19 nt

Tablo 1: bazı sık kullanılan CA'ları enzimler soydaş PAMs ve en iyi sgRNA uzunlukları ile. N = herhangi bir nükleotit (A, T, G veya C); R = A ya da G; V = A, C veya G.

  1. Uygun boşluk ekleyici sırasını seçin. Eşsiz bir dizi patlama33 ile hedef genom inceleyerek veya birkaç ücretsiz çevrimiçi araçlar, aşağıdaki gibi kullanarak hedef kapalı bölünme olaylar, riskini en aza indirmek için mümkün olduğunca tanımlamak: (a) programından Feng Zhang'ın laboratuvar34 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (c) E-net36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas-OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
    Not: Hangi Cas bağlı olarak enzim kullanılır 17 25 nükleotit (nt) (dahil)'ye spacer optimum uzunluğu değişebilir (bkz. Tablo 1). Cas9 için rondela PAM, ters yönde için Cas12a iken, rondela Ayrıca mısınız aşağı akım, kesme sitesinden mesafe artan ile HDR verimliliği hızla düşer. Bu nedenle, hassas DNA düzenleme için istenen değişiklik site olabildiğince yakın olarak sgRNA getirin.
  2. DNA oligonucleotides için kullanılan CRISPR plazmid uygun çıkıntılar ile sentez.
    1. Kılavuzun ilk konumu G. belirleme spacer geriye doğru tamamlayıcı dizi değilse G nükleotit spacer önünde ekleyin. Amaçlı klonlama için gerekli çıkıntılar ekleyin.
      Not: Bizim değerlendirme çalışması25içinde kullanılan plazmid için illüstrasyon yoluyla sentezlenmiş için oligonucleotides Tablo 2' de gösterilir. Bir kılavuz olarak, Şekil 2 ' de verilen örnek kullanın. Birçok CRISPR plazmid ticari kaynaklardan (örneğin, Addgene) kullanılabilir. Daha popüler plazmid bazıları Tablo malzemeleriverilmiştir.
CRISPR plazmidSıra
pSpCas9 ve pSaCas9Anlamı: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisens: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'
pNmCas9Anlamı: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisens: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5'
pAsCas12a ve pLbCas12aAnlamı: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisens: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5'

Tablo 2: Oligonucleotides son değerlendirilmesinde kullanılan CRISPR plazmid içine sgRNA dizileri klonlama için gerekli eğitim25. Çıkıntılar italik.

figure-protocol-4860
Resim 2 : Hedef siteleri seçin ve oligonucleotides CRISPR plazmid klonlama için çizmek nasıl gösteren bir örnek. Burada hedef genomik locus exon 45 insan CACNA1D gen olduğunu. PAMs SpCas9 ve SaCas9 için NGG ve NNGRRT sırasıyla ve PAM AsCas12a için ise kırmızı vurgulanır ve LbCas12a TTTN ve yeşil vurgulanır. Yeşil yatay çubuk protospacer iki Cas12a enzimler için ise kırmızı yatay çubuk protospacer SpCas9 ve SaCas9, için gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. klonlama bir omurga vektör içine oligonucleotides,

  1. Fazdan ve anlam ve Antisens oligonucleotides tavlama.
    1. Oligonucleotides liyofilize Eğer onları 100 µM konsantrasyonu tris-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) resuspend (TE tampon, Tablo malzemelerigörmek) veya GKD2O.
    2. De pipetting tarafından anlamda Oligonükleotid, 1 µL antianlamlı Oligonükleotid, T4 DNA ligaz arabelleği (10 x), T4 polinükleotit kinaz (PNK) 1 µL ve 6 µL GKD2O. Mix 1 µL 1 µL içeren bir 10 µL tepki karışım hazırlamak ve reaksiyon karışımı bir termal cy yer Aşağıdaki parametreleri kullanarak cler: 30 dk, 5 dk ve 25 ° C 6 ° C/dk kadar rampa için 95 ° C için 37 ° C.
    3. Reaksiyon mix 1: 100 GKD2O içinde (örneğin, 2 µL tepki mix + 198 µL GKD2O) oranında seyreltin.

figure-protocol-6534
Şekil 3 : CRISPR plazmid örneği. Plazmid farklı önemli özelliklerini gösteren (bir) A harita. Burada, U6 organizatörü sgRNA ifade sürücüler ise EF-1a organizatörü Cas9, ifade ediyor. Amp(R) bir Ampisilin-direnç geni plazmid gösterir. (b) "BbsI-BplI klonlama sitedeki" Plazmid dizi. BbsI tanıma dizisi GAAGAC ve BplI tanıma dizisi GAG N5ise kırmızı ile gösterilen - CTC ve yeşille gösterilir. (c) koloni için PCR sgRNA sıra başarılı bir şekilde plazmid klonlanmış olup olmadığını kontrol etmek için kullanılan astar. Evrensel M13R(-20) astar plazmid harita üzerinde pembe bir okla gösterilir iken hU6_forward astar plazmid haritada mor bir okla belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Uygun bir restriksiyon enzimi ile CRISPR plazmid sindirmek.
    Not: sgRNAs genellikle klonlama itimat Golden Gate derleme türü ile IIS enzimleri. Farklı enzimler farklı CRISPR plazmid için kullanılabilir. BbsI veya BplI pSpCas9 için kullanın (bkz. şekil 3). PSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a ve pLbCas12a için BsmBI kullanın.
    1. Dairesel plazmid vektör 1 µg içeren bir 20 µL tepki karışım hazırlamak, arabelleği (10 x) 2 µL, restriksiyon enzimi (örneğin, BbsI, BplI veya BsmBI) ve GKD2O son hacmi 20 µL. için 1 µL kuluçkaya 2,5 h 37 ° C'de tepki.
    2. Karides alkalen fosfataz (SAP) 1 µL için tepki ekleyin ve başka bir 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. 6 DNA yükleme x 5 µL ekleyerek tepki gidermek (bkz. Tablo reçetesi) mix de boya ve % 0,8 özel jel tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek x 1 tepki gidermek. O zaman, doğru grubun tüketim ve jel geçin doğrusallaştırılmış vektör arındırmak.
  2. Tavlanmış oligonucleotides sindirilmiş CRISPR plazmid ligate.
    1. Bir 10 µL tepki karışım hazırlamak: 50 ng doğrusallaştırılmış vektör, seyreltilmiş tavlanmış oligonucleotides 1 µL, T4 DNA ligaz arabelleği (10 x) 1 µL, T4 DNA ligaz ve GKD2O 10 µL son hacmiyle 1 µL ( Tablo malzemelerigörmek). Gecede 16 ° C'de veya 2 h için oda sıcaklığında tepki kuluçkaya.
      Not: tüp ligasyonu sürecini hızlandırmak için konsantre T4 DNA ligaz kullanın ve reaksiyon mix 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. Kimyasal olarak yetkili E. coli ve birleştirilmiş ürünler dönüşümü hücreleri (bkz. ek dosya 1). Dönüştürülmüş bakteri hücreleri 100 µg/mL Ampisilin ile bir LB agar tabakta yayıldı.
  4. Koloni Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) bakteri tanımlamak için INSERT ile gerçekleştirin.
    1. İki adet steril PCR şerit tüpler hazır olun. Set 1 LB suyu uygun antibiyotik (örneğin, 100 µg/mL Ampisilin) ile 50 µL eklemek, GKD2O, Set 2 iken 4.7 µL ekleyin.
    2. Steril pipet ucu ile bir koloni plaka kapalı almak, kısa bir süre içinde bir Set 1 tüp çalmak ve bir Set 2 tüpte bahşiş. Her zaman farklı PCR tüpleri kullanmak emin bir kaç colonies için yineleyin.
      Not: Genellikle dört kolonileri eleme yeterlidir. Ancak, bu klonlama verimliliği bağlı olarak değişebilir.
    3. Her Set 1 tüp (için 10 µL PCR) aşağıdaki reaktifler ekleyin: 5 µL 2 x PCR ana mix (boya ile Malzemeler tablobkz: yükleme), duygusu veya Antisens Oligonükleotid (100 µM), 0.15 µL yukarı veya aşağı CRISPR plazmid hedefleme astar (100 µM) 0,15 µL sgRNA kaset akışı sırasıyla (bkz. şekil 3).
      Not: PCR ürünü verim ideal bir ürün boyutu yaklaşık 150 bp veya daha büyük, herhangi bir pozitif bantları astar dimer yanlış değil.
    4. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termal cycler PCR çalıştırın: 3 dk, 30 95 ° C için 95 ° C s (Adım 2), 60 ° C 30 s (Adım 3), 72 ° C 30 s (Adım 4), başka bir 34 döngü, 72 ° C 5 min için için adımlar 2\u20124 tekrar ve 4 ° C'de tutun
      Not: 60 ° C tavlama sıcaklığı tasarlanmış astar için optimize edilmiş olması gerekir. Uzama süresi 30 s de beklenen PCR amplicon boyutuna ve kullanılan DNA polimeraz bağlı olarak değişir.
    5. 1 x TAE tampon kullanarak bir % 1'özel jel reaksiyonlar gidermek.
    6. PCR olumlu bir grupta 5 mL LB ile uygun antibiyotik içeren daha büyük bir konik tüp içine karşılık gelen Set 2 tüp sizden kendi kültürünün 50 µL aktararak verimleri bir koloni aşılamak. Gecede bir 37 ° C'de kuluçka makinesi-shaker büyümek kültür izin.
    7. Gecede kültür bir miniprep kit ( Tablo malzemelerigörmek) ve (hU6_forward veya M13R(-20) Şekil3) duygusu veya Antisens Oligonükleotid değil koloni PCR astar kullanarak örnek sıra kullanarak plazmid yalıtmak.
      Not: gerekirse, aşağı akım deneyler için daha büyük bir miktar almak için sıra onaylı CRISPR plazmid maxiprep gerçekleştirin.

3. tasarım ve onarım şablonları sentezi

Not: hassas genom mühendislik için istenilen DNA değişiklikleri belirten bir şablon ile birlikte CRISPR reaktifler sağlanması gerekiyor. Bir tek nükleotid İLETİMLERİNİZE gibi küçük DNA düzenlemeleri için en uygun (bakınız Bölüm 3.1) ssODN donör şablonlarıdır. Bir GFP ekleme gibi daha büyük DNA düzenlemeleri için 5' ya da 3' belirli bir protein kodlayıcı gen etiketi, plazmid donör şablonları en uygun (bkz. Bölüm 3.2).

  1. Tasarım ve ssODN donör şablon sentez (bkz. şekil 4).
    1. Doğru şablonu takip etmeli, sıra strand belirlemek.
      Not: ssODNs hedef Strand, bunun yerine25 sıra için bir tercih Cas9 sergiler Ise Cas12a ssODNs hedef strand dizi için bir tercih sergiler ( şekil 4birbakınız).
    2. Onarılan sıra tekrar tarafından seçilen CA'ların nükleaz targetable olmadığından emin olun. Örneğin, PAM amino asit değişiklik yok değil böyle bir şekilde mutasyona veya fonksiyonel önemsiz varsa donör şablon PAM'den ortadan kaldırmak. Örnek şekil 4b bir kılavuz olarak kullanın.
    3. Bir simetrik veya asimetrik donör şablonu isteniyorsa karar verin. Simetrik bağış için DNA modifikasyon sitesi kanat her homoloji kol en az 17 nt uzun25olduğundan emin olun. Asimetrik donör şablonları'nda (bkz: şekil 4bir) istenen DNA değişiklikleri daha uzun silah 5'kullanın. Önemlisi, kısa kol yaklaşık 37 olması nt homoloji kol yaklaşık 77 iken uzunluğu, uzunluğu25,39' nt.
    4. Tek iplikçikli DNA'ın bir parçası olarak tasarlanmış şablon sentez.
      Not: Asimetrik ssODNs yapabilir, ama her zaman değil, daha yüksek HDR verimliliği daha simetrik ssODNs sergilemek. Genel olarak, asimetrik bir donör genellikle en az bir simetrik verici yanı sıra, doğru şekilde tasarlanmış sergiliyor. O daha uzun olması ve bu nedenle polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) arıtma veya özel sentez yordamı gerektirir ancak, asimetrik Şablon çok daha maliyeti. Rutin gen Renkleri çakıştırmama genellikle NHEJ onarım yolu üzerinde itimat ve onarım şablon gerektirmez. Nakavt verimliliği düşük ise, ancak, bir frameshift mutasyon içeren ve en az 120 ssODN donör şablonu tasarlamak nt uzunluğu25,40yılında.

figure-protocol-14241
Şekil 4 : Tasarım ssODN donör şablonları. (bir) çeşitli olası tasarımlar gösteren şematik. Hedef (T) strand mavi dikdörtgenler gösterir iken sigara-hedef (NT) strand, kırmızı yatay dikdörtgenler gösterir. Buna ek olarak, küçük yeşil dikdörtgen (örneğin tek nükleotid değişiklikleri) istenilen DNA değişiklikleri gösterir. Bir simetrik ssODN kullanıldığında, her homoloji kol minimum uzunluğu en az 17 olmalıdır nt (ama daha uzun olabilir). Asimetrik ssODNs için 37/77 T ssODN 77/37 NT ssODN Cas12a kaynaklı HDR için en uygun görünmektedir iken SpCas9 kaynaklı HDR için en uygun gibi görünüyor. L = sol homoloji kol; R = doğru homoloji kol. (b) nasıl ssODN şablonları tasarımı göstermek için belirli bir örnek. Hedef genomik locus exon 45 insan CACNA1D gen işte. PAM için Cas9 pembe ve altı çizili, PAM Cas12a kahverengi için süre ve altı çizili. Amaç missense mutasyon (vurgulanmış yeşil) Agu (albüm) (serin kodlama) dönüştürerek (arginin kodlama) AGG oluşturmaktır. Cas12a tarafından yeniden hedefleme önlemek için TTTC PAM için CTTC mutasyona uğramış. Amino asit (wow ve UAC her ikisi de tirozin için kod) bir değişiklik yok olduğunu unutmayın. Daha fazla Cas9 tarafından yeniden hedefleme önlemek için bir AGU kodon UCC kodon (kalın), ile değiştirilir serin için hangi kod her ikisi de. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Tasarım ve bir uygun plazmid donör şablonu klon. Örneğin, hedef genomik locus homolog uzun kolları tarafından çevrili bir GFP sıra içerebilir (bkz şekil 5).
    1. Değiştirilen sıra tekrar tarafından seçilen CA'ların nükleaz targetable olmadığından emin olun. Örneğin, protospacer eklenen (GFP) etiketi tarafından bölünebilir. Alternatif olarak, PAM mutasyona uğramış veya gen işlevini etkilemez böyle bir şekilde donör şablondan kaldırıldı.
    2. Genomik DNA PCR kullanarak homoloji kollarından yükseltmek. Her homoloji kol genellikle 1000-1500 bp uzunluğudur.
      Not: klonlama kolaylaştırmak için sol homoloji kol ve sağ homoloji için ters astar her kol için ileri astar en az 20 sahip olduğundan emin olun sıra seçili vektör omurga ile örtüşen nt. Ayrıca, sol homoloji kol için ters astar ve doğru homoloji kol için ileri astar epitope etiketiyle de üst üste gelen bazı dizileri olduğundan emin olun.
    3. İki homoloji kolu ve (GFP) etiket Gibson derleme41 kullanarak vektör omurga clone ( Tablo reçetesigörmek). Plazmid ileri kullanarak sıralama Sanger tarafından doğrulayın ve sırasıyla akış yukarı ve aşağı akım donör şablonunun astar ters.
      Not: Sanger sıralama kullanılabilir ticari bir hizmet olarak yaygın olarak ve uygun fiyatla rezervasyon yaptırın. Plazmid sıralama astar ile birlikte bir aliquot bir hizmet sağlayıcısına göndermek.
    4. Sadece bir kez sol homoloji kolun akış yukarı ya da aşağı doğru homoloji kol plazmid keser bir restriksiyon enzimi ile donör şablonu linearize.
      Not: Son zamanlarda, sgRNA-PAM dizileri tarafından çevrili olduğunu ve plazmid bölünme sonra ilgili Cas nükleaz tarafından piyasaya çıktı, bir çift kesimli donör HDR verimliliği42artırmak için gösterilmiştir. SgRNA-PAM dizileri akıntıya karşı eklenir ve sol ve sağ homoloji aşağı sırasıyla (örneğin Gibson kurul tarafından) silah homoloji kol boyu 300'e azalabilir bp ve plazmid linearize gerek yok.

figure-protocol-17977
Şekil 5 : Tasarım ve plazmid donör şablon / klonlama. P2A-GFP CLTA protein C terminus için sigorta belirli (bir) bu kalede örnektir. Kırmızı yatay dikdörtgen doğru homoloji kol gösterirken mavi yatay dikdörtgen sol homoloji kol gösterir. Küçük harfler kodlamayan gösterir iken büyük harf dizileri, protein kodlayıcı gösterir. SpCas9 ve Cas12a için PAMs italik ve altı çizili. endogenously CLTA C-terminus adlı P2A-GFP etiketlemek için kullanılan (b) bir plazmid donör şablonu. Sağlanan astar dizileri plazmid Clone Gibson kurul tarafından kullanılabilir. PCR koşulları aşağıdaki gibidir: 3 dk, 30 98 ° C için 98 ° C s (Adım 2), 63 ° C 30 s (Adım 3), 72 ° C için 1 dk (Adım 4), başka bir 34 döngü, 72 ° C 3 dk için için adımlar 2\u20124 tekrarlayın ve 4 ° C'de tutun Siyah harflerle vector dizileri için karşılık gelen, mavi mektuplardan sol homoloji koluna karşılık, yeşil harfler P2A-GFP için karşılık gelen ve kırmızı harflerle doğru homoloji kol karşılık gelir. P2a-GFP kodlama sırası başarıyla hedef locus entegre bir zamanlar, SpCas9 tarafından yeniden hedefleme beri sadece 9 mümkün olacak değil unutmayın onun protospacer (GTGCACCAG) nt kalmamış olabilir olduğu gibi. Ayrıca, Cas12a, üç basepairs yeniden hedefleme önlemek için hemen aşağı akım stop kodonu (kalın içinde) plazmid sırasından silinir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. hücre transfection

Not: HEK293T hücreler akılda kalan kısmı Protokolü'nün yazılır. Kullanılan kültür orta, Dulbecco modifiye kartal orta (4,5 g/M glikoz, % 10 fetal sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin ve % 0.1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM) oluşur. Protokolü'nün farklı adımları kullanılan gerçek hücre hattı göre değiştirilmesi gerekebilir. Tüm hücre kültür çalışmaları bir sınıf II Biyogüvenlik steril bir çalışma ortamı sağlamak için kabine içinde yapılır.

  1. Tohum 1.8 x 105 hücreleri bir 24-iyi doku kültürü plaka transfection önce bir gün.
    1. Medya aspirating ve 150 µL % 0.25 ekleyerek hücreleri ayırmak tripsin-EDTA iyi başına. 2 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    2. Tripsin hücre kültür ortamının 150 µL (veya 1 x birim) ekleyerek etkisiz hale getirin. Hücre süspansiyon için konik bir tüp aktarın. Spin aşağı 5 min için bir tezgah üst santrifüj-1000 x g de hücrelerde.
    3. Süpernatant Aspire edin ve hücre kültür medya ile 5 mL resuspend. Ayrı santrifüj tüpü içinde aliquot 10 µL % 0,4 trypan mavi çözüm. O zaman, 10 µL resuspended hücrelerde 4.1.2 adımından ekleyip iyice karıştırın.
    4. 10 µL (hücre + trypan mavi) karışımı bir hemasitometre pipet. El ile veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak için devam edin.
    5. 24-iyi doku kültürü plaka bir kuyuya tohum 1.8 x 105 hücreleri.
  2. Ya 500 içeren bir transfection karışım hazırlamak (NHEJ-aracılı düzenleme için) CRISPR plazmid veya 300 ng ng CRISPR Plazmid ve 300 ng transfection reaktifi (bkz: ile sağlanan yönergelere göre donör şablonunun (HDR-aracılı düzenleme için) Malzemelerin tablo). Oda sıcaklığında (genellikle çevresinde 10\u201220 min) önerilen zaman süresi için kuluçkaya.
  3. Dropwise moda hücrelerde transfection karışımı ekleyin ve hafifçe plaka sonra girdap.
  4. Oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya CO2 hava İnkübatör (deneyler NHEJ tabanlı için) 24 h için veya (HDR tabanlı deneyleri için) 72 saat.

5. Floresans hücre (FACS) sıralama transfected hücreleri aktive

  1. Medya aspirating ve % 0.25 tripsin-EDTA iyi başına 150 µL ekleyerek hücreleri ayırmak. 2 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  2. Tripsin hücre kültür ortamının 150 µL (veya 1 x birim) ekleyerek etkisiz hale getirin. Hücre süspansiyon bir santrifüj tüpü aktarın. Spin aşağı vasıl 235 x g 5 min için bir microcentrifuge hücrelerde.
  3. Süpernatant Aspire edin ve % 2 fetal sığır serum (FBS) hücrelerle fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspend. 30 µm mesh ile hücreleri filtre veya süzgeç 5 mL FACS tüp içinde hücre.
  4. Başka bir santrifüj tüpü yaklaşık 100 µL kültür medya veya % 2 ile hazırlamak FBS PBS için hücreler topluluğu içinde.
  5. Akış Sitometresi üzerinde sigara transfected hücrelerle hücreler bir negatif kontrol kapı. Sıralama ve hangi Floresans göre kullanılan CRISPR plazmid mevcut belirtecidir transfected hücreleri toplamak. Plazmid mCherry gen içeriyorsa, örneğin, RFP pozitif hücreler için sıralama.
    Not: Farklı CRISPR plazmid farklı seçilebilir işaretleri olacaktır. Bu değerlendirme çalışmada kullanılan plazmid (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1 ve pLbCpf1) kümesi taşımak turuncu floresan protein (OFP) veya mCherry gene.

6. bireysel klonların genişleme

  1. Maksimum hızda (18.000 x g) tezgah üst santrifüj 5 dk. aspiratı süpernatant sıralanmış hücrelerde santrifüj kapasitesi ve Pelet 300 µL kültür medya ile resuspend. 24-iyi doku kültürü plaka 200 µL hücrelerde tohum ve yeniden elde etmek bir 37 ° C kuluçka birkaç gün için izin. Kalan 100 µL hücreler Bölüm 7 için tutmak.
  2. Hücreleri Konfluent olmaya başlayınca, onları adımları 4.1.1\u20124.1.3 göre geçiş. Tohum hücreleri büyümek bireysel colonies için yeterli yer sağlamak için seyrek 100 mm doku kültürü bulaşık içinde. Oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya CO2 hava kombine kuluçka makinesi.
    Not: çeşitli dilutions deneyin. Tek hücreleri tek tek koloniler büyümek için yeterli boş alan gerekir. Ancak, de hücre sayısı çok az olduğunda bazı hücre hatları büyümek değil gibi onlar da aşırı seyrek olamaz.
  3. Kolonilerin forma başlıyor bir zamanlar onları (4 x büyütme ile) mikroskop altında almak ve her klon hücre kültür ortamı içeren bir 24-şey plaka bireysel bir kuyunun içine yerleştirin. Oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya hücreleri Konfluent gelmektedir kadar CO2 hava İnkübatör.
    Not: Seri dilutions ve koloni malzeme çekme alternatif bir 96-şey plaka tek hücreler için sıralamak için Akış Sitometresi kullanmaktır. Ancak, bu tek bir hücre de olduğu zaman büyümek değil bazı hücre satırları için çalışmayabilir.

7. Düzenleme verimliliği değerlendirme

  1. 5 dk. aspiratı süpernatant tezgah üst santrifüj maksimum hızda (18.000 x g) (Kimden adım 6.1) kalan 100 µL göre hücreleri centrifuging tarafından genomik DNA ayıklamak ve bir ekstraksiyon Kiti (görmek tablo kullanarak genomik DNA izole etmek için devam Malzemeler).
  2. T7 endonükleaz gerçekleştirmek ben (T7EI) bölünme tahlil (bkz. şekil 6).
    1. 50 µL PCR 10 µL PCR reaksiyon arabelleği (5 x), 1 µL dNTP mix (10 mM), ileri astar kullanıcı tanımlı (10 µM), ters astar kullanıcı tanımlı (10 µM), DNA polimeraz, 2\u20125 µL (bağlı olarak kaç hücre genomik DNA şablonunun 0.5 µL 2.5 µL 2.5 µL içeren ayarlayın be göre), o zaman en iyi 50 µL GKD2O kadar ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Astar T7EI tahlil sonucu bir ag üzerinde iki ayrı grup böylece hedef genomik odağı ve verim 400\u2012700 bp. genellikle bir astar çevresinde bir PCR ürünü daha yakın diğer astar daha Cas enzim kesme sitesine yerleştirilmiş yan için tasarlanmıştır jel ortaya çıktı (bkz. şekil 6).
    2. PCR termal cycler aşağıdaki parametrelerle çalıştırın: 3 dk, 30 98 ° C için 98 ° C s (Adım 2), 63 ° C 30 s (Adım 3), 72 ° C 30 s (Adım 4), başka bir 34 döngü, için 2 dk 72 ° C için adımları 2\u20124 tekrar ve 4 ° C'de tutun
    3. 1 x TAE tampon kullanarak bir % 2 özel jel tepki gidermek.
    4. Temiz, keskin bir neşter ile jel PCR ürününden tüketim ve üretici yönergelerine göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA arındırmak. Dalga boyu 260 nm Absorbans bir Spektrofotometre kullanarak PCR ürünü konsantrasyonu ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek).
    5. 200 içeren bir tahlil karışım hazırlamak ng DNA, T7EI tepki 2 µL tampon (10 x) ve 19 µL GKD2O ile tepesinde ( Tablo malzemelerigörmek).
    6. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termal cycler PCR ürünü yeniden TAV: 95 ° C 5 min, 6 ° C/dk, 25 ° C kadar rampa için 4 ° C'de basılı tutarak
    7. 5 U T7EI yeniden tavlanmış PCR ürünü ekleyin, de pipetting tarafından mix ve 50 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    8. 1 x TAE tampon kullanarak % 2.5 özel jel T7EI sindirilmiş DNA gidermek.
    9. Jel resim, ImageJ kullanarak bant yoğunluklarda ölçmek ve aşağıdaki formülü kullanarak Indel oluşumu oranını hesaplamak:
      figure-protocol-26876
      nerede bir temsil sağlam PCR ürünü ve b ve c yoğunluğunu bölünme ürünleri43yoğunluklarda için karşılık gelir.
      1. Bir grupta ImageJ yoğunluğunu ölçmek için ilk grup ile sınırı mümkün olduğunca yakın çevresinde bir dikdörtgen kutu çizin. İkinci olarak, analiz ve Ölçümler ayarlaseçeneğini tıklatın. Alan, gri değeri demekve entegre yoğunluk seçenekleri işaretli olduğundan emin olun. Tamam' ı tıklatarak ayarları penceresinden çıkmak. Üçüncü olarak, analiz ve ölçü birimitıklatın. Ortalama veya RawIntDen değeri bant yoğunluk kullanılır.

figure-protocol-27740
Şekil 6 : Hücreler için başarılı genom sonuçları düzenleme denetimi. iki yaygın olarak gösteren (bir) A şematik deneyleri kullanılan, yani uyuşmazlığı bölünme tahlil T7 endonükleaz ile ben (T7EI) enzim ve sonraki nesil sıralama (NGS) veya hedeflenen amplicon sıralama. Mavi yatay dikdörtgenler DNA ve sarı daire değişiklikler CRISPR-Cas sistem tarafından indüklenen gösterir gösterir. Amplicons NGS için üretmek için astar kırmızıyla gösterilir iken astar T7E1 tahlil için yeşil renkle belirtilir. (b) tasarım astar T7EI bölünme tahlil ve NGS diziler. Hedef genomik locus exon 45 insan CACNA1D gen işte. İstenen değişiklik site yıldız işareti gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Hedeflenen amplicon sıralama yapmak (bkz. şekil 6).
    1. Hedef genomik locus yükseltmek için PCR astar tasarım. 100'den küçük olması için astar birinin getirin ama 20'den fazla bp bp protospacer üzerinden.
      Not: Genellikle, toplam PCR ürün boyutu 150\u2012300 bp olarak tasarlanmıştır (bkz. şekil 6).
    2. Ek dizileri astar için aşağıdaki gibi ekleyin: (a) 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC - NNNN-[ileri astar] – 3'; (b) 5' - GTGCTCTTCCGATCT-[ters astar] –3'.
    3. 50 µL PCR reaksiyon mix 10 µL PCR reaksiyon arabellek (5 x), 1 µL dNTP (10 mM), astar (10 µM) astar b (10 µM), 0,5 µL DNA polimeraz, 2\u20125 µL genomik DNA şablonu (bağlı olarak kaç hücre sıralanmış) 5 µL 5 µL içeren ayarlayın , GKD20 ile 50 µL top.
    4. PCR termal cycler aşağıdaki parametrelerle çalıştırın: 3 dk, 30 98 ° C için 98 ° C s (Adım 2), 63 ° C 30 s (Adım 3), 72 ° C 15 s (Adım 4), başka bir 34 döngü, için 2 dk 72 ° C için adımları 2\u20124 tekrar ve 4 ° C'de tutun
    5. % 2 özel jel tepki gidermek ve üreticinin yönergelerine uygun bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak PCR ürünü arındırmak. Dalga boyu 260 nm Absorbans bir Spektrofotometre kullanarak DNA ölçmek ( Tablo reçetesigörmek).
    6. Aşağıdaki 2 PCR astar yuvarlak sentez: (c) 5' \u2012 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'; (d) 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[barkod] - GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
    7. 20 µL PCR reaksiyon kurmak karışımı içeren 4 µL PCR reaksiyon arabelleği (5 x), dNTP (10 mM), astar c (10 µM), astar d (10 µM), DNA polimeraz, DNA şablonu (adım 7.3.5 2 µL 0.2 µL 2 µL 2 µL 0.4 µL seyreltilmiş 1: 100) ve GKD2O. 9,4 µL
      Not: Seyreltme faktörü DNA şablonu için onun orijinal konsantrasyon bağlı olarak değişebilir. Konsantrasyonu 20\u201240 ng/µL ise, 1: 100 seyreltme faktörü kullanın. Buna ek olarak, deneysel her örnek için farklı bir barkod, çekme aynı astar bir ve astar b adımda 7.3.3 kullanılır.
    8. PCR termal cycler aşağıdaki parametrelerle çalıştırın: 3 dk, 30 98 ° C için 98 ° C s (Adım 2), 65 ° C 30 s (Adım 3), 72 ° C 30 s (Adım 4), başka bir 14 döngüleri, 72 ° C için 2 dk için adımları 2\u20124 tekrar ve 4 ° C tutun.
    9. Her reaksiyon varsayarak (farklı bir barkod her örnek için kullanılmıştır) PCR. birleştirin başarısı tüm örnekleri birlikte belirlemek için % 2 özel jel üzerinde 5 µL gidermek ve havuza alınan DNA PCR arıtma seti üreticisinin göre kullanarak temizlemek talimatları. PCR bazıları (non-spesifik ürün gösteren) birden fazla grup sergi, bir ek jel ayıklama adım gerçekleştirin.
    10. Yüksek işlem hacmi sıralama cihazda Kütüphane sıra ( Tablo malzemelerigörmek) eşleştirilmiş 151 bp okuma üretmek için üreticinin yönergelerine uygun. Oku 1 sıralama astar tasarlanmış özel ve ayrı ayrı temin edilecektir. Onun sırası aşağıdaki gibidir: Read1_seq: 5'-CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'. Oku 2 sıralama astar ve dizin sıralama astar standart ve reaktif kartuşu sağlanır.
      Not: T7EI tahlil ve hedeflenen amplicon sıralamanın sık genom düzenleme verimliliğini kontrol etmek için kullanılır. Ancak, diğer deneyler DNA değişiklikler tanıttı türüne bağlı olarak düzenleme verimliliği değerlendirmek için gerçekleştirilebilir. Örneğin, bir kısıtlama sitesi hedef site oluşturduysanız, bir kısıtlama parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) tahlil gerçekleştirilebilir. Bir kısıtlama endonükleaz yerine PCR ürünü sindirmek için kullanılır dışında T7EI tahlil için benzer.

8. bireysel klonlar taranması

  1. Konfluent olmaya başlayınca 6.3 adımından hücreleri bölün. Her bireysel klon kalan hücreleri toplar ve adım 7.1 göre genomik DNA ayıklayın.
  2. T7EI tahlil göre Bölüm 7.2, bir değişiklik dışında tüm bireysel klonlar için gerçekleştirin. 7.2.5 200 kullanmak yerine, adım ve hedef genomik locus wildtype hücrelerden yükseltmek test DNA sadece, 100 ile DNA testinin mix 100 ng ng ng wildtype DNA'sı.
    Not: Bazı klonlar başarılı biallelic dönüşüm geçirmiş ve homozigoz mutantız değiştirilmiş adım için nedenidir. Bu gibi durumlarda, hiçbir bölünme bantları T7EI tahlil wildtype DNA karışık değil eğer olacak.
  3. T7EI tahlil bantlarında bölünme sergi klonlar hedef sitedeki sıra.
    1. Adımları 7.2.1–7.2.4 göre değiştirilmiş genomik locus yükseltmek.
    2. Aşağıdaki klonlama tepki kadar ayarla: 4 µL PCR ürünü, tuz solüsyonu, 1 µL, TOPO vektör 1 µL ( Tablo reçetesigörmek).
    3. Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında en az 5 min için kuluçkaya.
    4. 3 µL tepki karışımı kimyasal olarak yetkili E. coli dönüşümü hücreleri (örneğin TOP10 veya Stbl3) (bkz. ek dosya 1). Dönüştürülmüş bakteri hücreleri ile 50 μg/mL sefaloridin bir LB agar tabakta yayıldı.
    5. Ertesi gün, en az 10 50 μg/mL sefaloridin içeren LB sıvı ortama kolonilerde aşılamak.
    6. Bakteriyel kültürlerde zaman bulanık, ayrı tut moduyla bir miniprep kullanarak plazmid ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve standart M13 ileriye veya geriye doğru M13 astar kullanarak sıralayın.
  4. (Deneme düzenleme genom protein kodlayıcı gen frameshift mutasyon yoluyla dışarı knocking içeriyorsa) yokluğu veya hedeflenen protein varlığını belirlemek için bir Batı leke (olarak da bilinen immunoblot) gerçekleştirin. Ek dosya 1bakın.
    Not: Diğer deneyler istenilen genomik değişiklikleri taşıyan klon tanımlamak için gerçekleştirilir. Örneğin, belirli bir gen knocking bazı değişiklikler hücresel davranışlara neden olduğu bilinen Eğer fenotipik tahlil gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Deney, ilgi odağı klonlanmış gerekiyor hedefleme bir sgRNA ifade CRISPR plazmid düzenleme genom gerçekleştirmek için. İlk olarak, plazmid bir kısıtlama bu linearize için enzim ile (genellikle bir türü IIS enzim) sindirilir. Bu % 1'özel jel ile birlikte komple ve Parsiyel sindirim arasında ayırt etmek için sindirilmemiş bir plazmid sindirilir ürünü gidermek için tavsiye edilir. Sindirilmemiş plazmid supercoiled olduğu gibi onlar doğrusallaştırılmış karşılıkları (bkz:

Tartışmalar

CRISPR-Cas sistemi genleri ve transcriptomes bitki ve hayvan Mühendisi için güçlü, devrimci bir teknolojidir. Çok sayıda bakteri türlerinin potansiyel olarak genom ve transcriptome amacıyla44mühendislik için adapte olabilir CRISPR-Cas sistemleri içeren tespit edilmiştir. Cas9 endonükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden diğer bakteriyel gelen enzimler insan hücreleri21,22,23

Açıklamalar

Yazarlar rekabet var mı mali çıkarlarının.

Teşekkürler

M.H.T. bir ajans için bilim teknoloji ve araştırma'nın ortak Konseyi Office grant (1431AFG103) tarafından desteklenmektedir, Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi grant (OFIRG/0017/2016), Ulusal Araştırma Vakfı Hibe (NRF2013-THE001-046 ve NRF2013-THE001-093), bir Bakanlığı Eğitim Tier 1 verme (RG50/17 (S)), bir başlangıç Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi Uluslararası genetik mühendislik makine (IGEM) rekabet için para verin.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)NEBM0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X1st BaseBUF-3000-50X4LDilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X1st BaseBUF-3020-10X4LDilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 DNA LigaseNEBM0202400,000 units/ml
Quick Ligation KitNEBM2200An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation KitThermo ScientificK1423An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning KitThermo Scientific451245The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LKit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.ColiThermo ScientificC737303
LB Broth (Lennox), powderSigma AldrichL3022Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powderSigma AldrichL2897Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media--2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP GradeGold BiotechnologyA-301
REDiant 2X PCR Mastermix1st BaseBIO-5185
Agarose1st BaseBIO-1000
T7 Endonuclease INEBM0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep KitFavorgenFAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High GlucoseHycloneSH30081.014.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mMGibco25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mLGibco15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1XGibco25200
Fetal Bovine SerumHycloneSV30160FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1XGibco20012
jetPRIME transfection reagentPolyplus Transfection114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0EpicentreLUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA KitBiolineBIO-52067An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNEBN0447
6X DNA Loading DyeThermo ScientificR061110 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3Merck539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µmBio-Rad1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10XBio-Rad1610772Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X1st baseBUF-2020Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solutionSigma AldrichP7170
TBS, 20X1st baseBUF-3030Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20Sigma AldrichP9416
Skim Milk for immunoassayNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
Antibody for β-actin (C4)Santa Cruz Biotechnologysc-47778Lot number: C0916
MiSeq systemIlluminaSY-410-1003
NanoDrop spectrophotometerThermo ScientificND-2000
Qubit fluorometerThermo ScientificQ33226
EVOS FL Cell Imaging SystemThermo ScientificAMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7Addgene108379Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9Addgene41815Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)Addgene71814Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)Addgene72247Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

Referanslar

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 146CRISPRCas9Cas12agenom d zenlemehomolog olmayan son kat lmaonar m homoloji y netmen

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır