Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
ТРИФОСФАТЫ-Cas — это мощная технология инженер комплекс геномов растений и животных. Здесь мы подробно протокол эффективно редактировать генома человека с использованием различных эндонуклеазами Cas. Мы отмечаем важные соображения и расчетные параметры для оптимизации эффективности редактирования.
Кластерный системы регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) функции естественно в бактериальных адаптивного иммунитета, но успешно многократно использовать для генома инженерии в многих различных живых организмов. Чаще всего Cas12a эндонуклеазы используется прилепится определенных сайтов в геноме, после чего перерыв двуцепочечной ДНК будет восстановлена через не гомологичных конце присоединения (NHEJ) путь или ориентированные на гомологии ремонт (или wildtype ТРИФОСФАТЫ связанные 9 (Cas9) HDR) путь в зависимости от того, является ли шаблон доноров отсутствует или представить соответственно. На сегодняшний день, ТРИФОСФАТЫ систем от различных видов бактерий было показано, чтобы быть способными выполнять изменения генома в mammalian клетках. Однако несмотря на кажущуюся простоту технологии, несколько конструктивных параметров должны рассматриваться, которые часто оставляют пользователи недоумевали о том, как лучше всего выполнять их геном редактирования экспериментов. Здесь мы описываем полный рабочий процесс из экспериментального дизайна для идентификации ячейки клонов, которые несут желаемые изменения ДНК, с целью облегчения успешного выполнения редактирования эксперименты в mammalian клетки линии генома. Мы подчеркиваем основные соображения для пользователей, чтобы принять к сведению, включая выбор системы ТРИФОСФАТЫ, длина распорку и дизайн шаблона доноров одноцепочечной oligodeoxynucleotide (ssODN). Мы предполагаем, что этот процесс будет полезен для гена нокаут исследований, моделирования усилия, болезни или поколения репортер мобильных линий.
Способность инженер геном любого живого организма имеет много биомедицинских и биотехнологических приложений, например коррекции болезнетворные мутации, строительство точных моделей для исследования заболеваний, или поколения сельскохозяйственных культур с желательные черты. С начала века, различные технологии были разработаны для техники генома клеток млекопитающих, включая meganucleases1,2,3, цинковый палец nucleases4,5, или Транскрипция эффекторных активатор как nucleases (Таленс)6,,78,9. Однако эти более ранних технологий трудно программы или утомительно собрать, препятствуя тем самым их широкое распространение в научных исследований и промышленности.
В последние годы кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) - связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) системы стала мощной новой генома, инженерные технологии10,11. Первоначально адаптивной иммунной системы в бактерии, он был успешно развернут для модификации генома растений и животных, включая человека. Основная причина, почему ТРИФОСФАТЫ-Cas популярность так много за такое короткое время, что элемент, который приносит ключевых эндонуклеазы Cas, например Cas9 или Cas12a (также известный как Cpf1), в нужное место в геноме это просто небольшой фрагмент химерных единого руководства RN A (sgRNA), которая является простой дизайн и дешевые синтезировать. После набираются на целевой сайт, Cas фермента функционирует как молекулярные ножницы и расщепляет ДНК связанного с его RuvC, HNH или КНУ доменов12,,1314. Результате двойной мель перерыв (DSB) впоследствии отремонтированы клетки через ориентированные на гомологии ремонт (HDR) путь или не гомологичных конце присоединения (NHEJ). В отсутствие шаблона ремонт DSB отремонтированы по ошибкам NHEJ пути, который может привести к псевдо-случайных вставки или удаления нуклеотидов (indels) в месте разреза, потенциально вызывая фреймшифт мутации в генах, белок кодирования. Однако в присутствии доноров шаблон, содержащий требуемые изменения ДНК, DSB восстановлена дорожка HDR высокой верности. Общие типы доноров шаблоны включают одноцепочечной олигонуклеотиды (ssODNs) и плазмид. Бывший обычно используется, если предполагаемого изменения ДНК небольшие (например, изменение одной пары базы), в то время как последние обычно используется, если один хочет, чтобы вставить относительно длинная последовательность (например, кодирующая последовательность зеленого флуоресцентного белка или GFP) в целевой Локус.
Эндонуклеазы активность белка Cas требует наличия protospacer прилегающие мотив (PAM) на целевой сайт15. Пэм Cas9 находится в конце 3' protospacer, в то время как Пэм Cas12a (также называемый Cpf1) находится в конце 5' вместо16. Cas руководство РНК комплекс не в состоянии представить DSB, если PAM отсутствует17. Следовательно PAM места ограничения в геномной местах, где особенно нуклеиназы Cas способен расщеплять. К счастью Cas nucleases из различных видов бактерий обычно демонстрируют различные требования PAM. Таким образом путем интеграции различных систем ТРИФОСФАТЫ-Cas в наших инженерных инструментов, мы можем расширить круг сайтов, которые могут быть направлены в геноме. Кроме того естественный фермент Cas может быть спроектирован или эволюционировали признать альтернативных последовательностей PAM, дальнейшего расширения масштабов геномной целей доступным для манипуляции18,19,20.
Хотя несколько ТРИФОСФАТЫ-Cas системы доступны для технических целей генома, большинство пользователей технологии полагались главным образом на Cas9 Нуклеаза от Streptococcus pyogenes (SpCas9) по нескольким причинам. Во-первых он требует относительно просто NGG Пэм, в отличие от многих других белков Cas, которые может только расщеплять при наличии более сложных пам. Во-вторых это первый Cas эндонуклеазы успешно развернуты в клетки человека21,,2223,24. В-третьих SpCas9 является на сегодняшний день лучше всего характеризуется фермент на сегодняшний день. Если исследователь хочет использовать другой нуклеиназы Cas, он или она часто будет ясно о том, как лучше разработать эксперимент, и насколько хорошо другие ферменты будет выполнять в различных биологических условиях по сравнению с SpCas9.
Чтобы внести ясность в относительной эффективности различных систем ТРИФОСФАТЫ-Cas, мы провели недавно систематическое сравнение пяти Cas эндонуклеазами – SpCas9, Cas9 фермента от золотистого стафилококка (SaCas9), энзим Cas9 от Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a фермента от Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) и Cas12a фермента от бактерия Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. За справедливое сравнение мы оценивали различные Cas nucleases, используя тот же набор целевых объектов и других экспериментальных условий. Исследование также определила дизайн параметры для каждой системы ТРИФОСФАТЫ-Cas, которая будет служить полезным справочным материалом для пользователей технологии. Здесь, чтобы лучше включить исследователей использовать ТРИФОСФАТЫ-Cas системы, мы предоставляем пошаговые протокол для оптимального генома техники с различными Cas9 и Cas12a ферменты (см. Рисунок 1). Протокол включает не только экспериментальных детали, но также важных конструктивных соображений необходимо максимизировать вероятность успешного генома инженерных решений в mammalian клетках.
Рисунок 1 : Обзор рабочего процесса для создания генома линий клеток человека отредактированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
1. дизайн sgRNAs
CAS эндонуклеазы | ПЭМ | Длина Оптимальная прокладка |
SpCas9 | НЭС | 17-22 nt включительно |
SaCas9 | NNGRRT | ≥ 21 nt |
NmCas9 | NNNNGATT | ≥ 19 nt |
AsCas12a и LbCas12a | TTTV | ≥ 19 nt |
Таблица 1: некоторые часто используемые Cas ферментов с их родственных ПАМС и оптимальной sgRNA длин. N = любой нуклеотидов (A, T, G или C); R = A или G; V = A, C, или G.
ТРИФОСФАТЫ плазмиды | Последовательность |
pSpCas9 и pSaCas9 | Смысл: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5' |
pNmCas9 | Смысл: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5' |
pAsCas12a и pLbCas12a | Смысл: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' Antisense: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5' |
Таблица 2: олигонуклеотиды, необходимых для клонирования sgRNA последовательности в ТРИФОСФАТЫ плазмид, используемых в ходе недавней оценки изучить25. Свесы выделены курсивом.
Рисунок 2 : Пример как выбрать целевые сайты и дизайн олигонуклеотиды для клонирования в ТРИФОСФАТЫ плазмидов. Цель genomic Локус здесь — 45 экзона гена человека CACNA1D. Пам SpCas9 и SaCas9 являются NGG и NNGRRT соответственно и выделяются красным цветом, а PAM для AsCas12a и LbCas12a TTTN и подсвечивается зеленым цветом. Красная горизонтальная полоса показывает protospacer для SpCas9 и SaCas9, в то время как зеленая горизонтальная полоса показывает protospacer для двух Cas12a ферменты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. клонирование в олигонуклеотиды в вектор позвоночника
Рисунок 3 : Пример ТРИФОСФАТЫ плазмида. () A карта с указанием различных важных особенностей плазмиды. Здесь EF-1a промоутер диски выражение Cas9, в то время как промоутер U6 диски выражение sgRNA. Amp(R) указывает, ампициллина сопротивление гена в плазмиду. (b) последовательность «BbsI-BplI клонирования сайт» в плазмиды. Признание последовательность BbsI GAAGAC и указывается в красном, в то время как признание последовательность BplI, кляп-N5- КТК и указывается в зеленый. (c) грунты, которые могут использоваться для проверки, является ли последовательность sgRNA был успешно клонирован в плазмиду для колонии PCR. HU6_forward грунтовка обозначается фиолетовые стрелки на карте плазмида, в то время как Универсальный грунт M13R(-20) обозначается розовыми стрелками на карте плазмиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. дизайн и синтез ремонт шаблонов
Примечание: Для точности инженерии генома, указав желаемые изменения ДНК шаблон необходимо предоставить вместе с ТРИФОСФАТЫ реагентов. Для небольших изменения ДНК такие изменения одного нуклеотида ssODN доноров шаблоны являются наиболее подходящим (см. раздел 3.1). Для большего изменения ДНК как вставки GFP тег 5' и 3' определенного белка кодирование гена, плазмида доноров шаблоны являются наиболее подходящим (см. раздел 3.2).
Рисунок 4 : Дизайн шаблонов доноров ssODN. () схемы, иллюстрирующие различные возможные конструкции. Красные горизонтальные прямоугольники указывают стренги непромысловых (NT), в то время как синие прямоугольники указывают стренги целевой (T). Кроме того небольшие зеленые прямоугольники показывают желаемые изменения ДНК (например единичных нуклеотидных изменений). Когда используется симметричный ssODN, минимальная длина каждого гомологии руку должно быть по меньшей мере 17 nt (но может быть больше). Для асимметричных ssODNs ssODN 37/77 T, как представляется, быть оптимальной для SpCas9-индуцированной HDR, в то время как NT ssODN 77/37, как представляется, является оптимальным для Cas12a-индуцированной HDR. L = левый гомологии руку; R = правый гомологии руку. (b) конкретный пример, чтобы продемонстрировать как ssODN шаблоны дизайна. Целевой геномной Локус вот экзона 45 CACNA1D гена человека. PAM для Cas9 розовый и подчеркнул, в то время как PAM для Cas12a коричневый и подчеркнул. Целью является создание Миссенс мутация (выделенный в зеленый) путем преобразования АГУ (кодирование Серин) для общ (кодирование аргинина). Для предотвращения повторной ориентации, Cas12a, TTTC PAM является мутировал КТТК. Обратите внимание, что нет никаких изменений в аминокислоты (СХУ и UAC, оба кода для тирозин). Для дальнейшего предотвращения, требуемой по Cas9, AGU кодон заменяется UCC кодон (жирный), оба из которых код для серина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Дизайн и клонирование плазмиды доноров шаблона. () цель в этот конкретный пример является предохранитель P2A-ГФП в C-конечная CLTA белка. Синий горизонтальный прямоугольник указывает гомологии левой руки, а красный прямоугольник горизонтальной руку правой гомологии. Прописные буквы указывать белка кодирование последовательностей, тогда как строчные буквы некодирующих последовательностей. Пам SpCas9 и Cas12a курсив и подчеркнул. (b) донором плазмида шаблон, который может использоваться для эндогенно тег P2A-ГФП в C-terminus CLTA. Предоставленный грунтовка последовательности может использоваться для клонирования плазмиды Ассамблеей Гибсон. Условия PCR заключаются в следующем: 98 ° С в течение 3 мин, 98 ° C за 30 s (шаг 2), 63 ° C за 30 s (шаг 3), 72 ° C в течение 1 мин (шаг 4), повторите шаги 2\u20124 для еще 34 циклов, 72 ° C на 3 мин и провести на 4 ° C. Черные буквы соответствуют последовательности вектор, синие буквы соответствуют руку левой гомологии, зеленый письма соответствуют P2A-GFP и красные буквы соответствуют руку правой гомологии. Обратите внимание, что после последовательности кодирования P2A-GFP успешно интегрированы в целевой локус, требуемой по SpCas9 будет невозможно, поскольку лишь 9 nt protospacer (GTGCACCAG) останутся нетронутыми. Кроме того во избежание повторного таргетинга, Cas12a, три basepairs сразу ниже по течению от остановки кодон (выделено жирным шрифтом) удаляются из последовательности плазмиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. клетки Трансфекция
Примечание: Оставшиеся части протокола записываются с HEK293T клеток в виду. Культура средних используется состоит из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнены глюкозы 4,5 г/Л, 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 2 мм L-глютамина и 0.1% пенициллина/стрептомицина. Различные этапы протокола может должны быть изменены согласно фактической клеток линии. Все клетки культуры работа в кабинете биологической безопасности II класса обеспечить стерильный рабочей среды.
5. флуоресценции активации клеток сортируя (FACS) transfected клеток
6. расширение индивидуальных клонов
7. Оценка эффективности редактирования
Рисунок 6 : Проверка клетки для редактирования результатов успешного генома. () A схема, иллюстрирующая два часто используемых анализов, а именно несоответствие расщепления пробирного с T7 эндонуклеазы я фермента (T7EI) и следующего поколения последовательности (НГС) или целевых ампликон последовательности. Синие горизонтальные прямоугольники указывают, что ДНК и желтые круги показывают изменения, вызванные системе ТРИФОСФАТЫ-Cas. Праймеры для T7E1 assay обозначены зеленым цветом, в то время как праймеры для генерации ампликонов для NGS обозначаются красным цветом. (b) дизайн праймера последовательности для assay расщепление T7EI и NGS. Целевой геномной Локус вот экзона 45 CACNA1D гена человека. На сайте предполагаемого изменения обозначается звездочкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
8. Проверка отдельных клонов
Для выполнения генома редактирования эксперимент, ТРИФОСФАТЫ плазмида, выражая sgRNA ориентации, локус интерес должен быть клонированы. Во-первых плазмида переваривается с энзима ограничения (обычно типа IIs фермент) для линеаризации его. Рекомендуется для устранения переваривается прод...
Система ТРИФОСФАТЫ-Cas является мощным, революционная технология для инженер геномов и transcriptomes растений и животных. Содержат ТРИФОСФАТЫ-Cas систем, которые потенциально могут быть адаптированы для генома и транскриптом инженерных целей44были найдены многочисленные виды бак...
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.
M.H.T. поддерживается агентства грант для Объединенного бюро Совета науки, технологий и научных исследований (1431AFG103), Национальный совет медицинских исследований Грант (OFIRG/0017/2016), Национальный исследовательский фонд предоставляет (NRF2013-THE001-046 и NRF2013-THE001-093), Министерство образования Tier 1 Грант (RG50/17 (S)), запуска грант от Nanyang технологический университет и фондов для генетически Инженерная машина (МПСЭ) международного конкурса от Nanyang технологический университет.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201 | |
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | NEB | M0371 | |
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X | 1st Base | BUF-3000-50X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA. |
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X | 1st Base | BUF-3020-10X4L | Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. |
BbsI | NEB | R0539 | |
BsmBI | NEB | R0580 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | 400,000 units/ml |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
Rapid DNA Ligation Kit | Thermo Scientific | K1423 | An alternative to T4 DNA Ligase. |
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit | Thermo Scientific | 451245 | The salt solution comes with the TOPO vector in the kit. |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | Kit for Gibson assembly. |
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli | Thermo Scientific | C737303 | |
LB Broth (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L3022 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
LB Broth with Agar (Lennox), powder | Sigma Aldrich | L2897 | Reconstitute in ddH20, and autoclave before use |
SOC media | - | - | 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth |
Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Biotechnology | A-301 | |
REDiant 2X PCR Mastermix | 1st Base | BIO-5185 | |
Agarose | 1st Base | BIO-1000 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | |
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit | Favorgen | FAPDE 300 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate |
L-Glutamine, 200mM | Gibco | 25030 | |
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL | Gibco | 15140 | |
0.25% Trypsin-EDTA, 1X | Gibco | 25200 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160 | FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min |
Phosphate Buffered Saline, 1X | Gibco | 20012 | |
jetPRIME transfection reagent | Polyplus Transfection | 114-75 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 | Epicentre | LUCG-QE09050 | |
ISOLATE II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52067 | An alternative to QuickExtract |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | NEB | N0447 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA |
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 | Merck | 539134 | |
Nitrocellulose membrane, 0.2µm | Bio-Rad | 1620112 | |
Tris-glycine-SDS buffer, 10X | Bio-Rad | 1610772 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS. |
Tris-glycine buffer, 10X | 1st base | BUF-2020 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine. |
Ponceau S solution | Sigma Aldrich | P7170 | |
TBS, 20X | 1st base | BUF-3030 | Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl. |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
Skim Milk for immunoassay | Nacalai Tesque | 31149-75 | |
WesternBright Sirius-femtogram HRP | Advansta | K12043 | |
Antibody for β-actin (C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | Lot number: C0916 |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Qubit fluorometer | Thermo Scientific | Q33226 | |
EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Scientific | AMF4300 | |
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) | Addgene | 48138 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA | Addgene | 61591 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 | Addgene | 108379 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: hCas9 | Addgene | 41815 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) | Addgene | 71814 | Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid. |
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) | Addgene | 72247 | Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены