Topikal Elastaz Indüklenen İndüklenen Torasik Aort Anevrizması Murine Cerrahi Modeli

Özet

Farelerde sürekli olarak alçalan torasik aort anevrizmalarını tetikleyen bir cerrahi protokol uyguluyoruz. Prosedür sol torakotomi içerir, torasik aort maruzkalma, ve aort duvarında domuz pankreas elastaz batırılmış bir sünger yerleştirme.

Özet

Hastalık Kontrol Merkezi'ne göre, 1999-2016 yılları arasında tüm ırklarda ve her iki cinste de aort anevrizmaları (AAs) önde gelen ölüm nedeni olarak kabul edildi. Anevrizma, kritik bir çapa ulaştığında yırtılma veya yırtılma yapabilen aortun ilerleyici zayıflaması ve nihai genişlemesi sonucu oluşur. Göğüste alçalan aort anevrizmaları, inen torasik aort anevrizmaları denir (dTAA), Amerika Birleşik Devletleri'nde anevrizma vakalarının büyük bir kısmını oluşturan. Kontrolsüz dTAA rüptürü neredeyse evrensel olarak ölümcüldür ve elektif onarım yüksek oranda morbidite ve mortaliteye sahiptir. Modelimizin amacı özellikle dTAA'yı incelemek, dTAA'nın patofizyolojisini açıklamak ve büyümeyi durdurmak veya dTAA'nın boyutunu küçültmek için moleküler hedefler aramaktır. Torasik patolojiyi tam olarak incelemek için bir murine modeline sahip olarak özellikle dTAA'yı test etmek için hedefli tedaviler geliştirilebilir. Yöntem, cerrahi maruziyet sonrası domuz pankreatik elastazın (PPE) doğrudan dış mürin aort duvarına yerleştirilmesine dayanmaktadır. Bu yıkıcı ve inflamatuar reaksiyon oluşturur, hangi aort duvarı zayıflatır ve aylara haftalar boyunca anevrizma oluşumunu sağlar. Murine modelleri sınırlamalara sahip olsa da, dTAA modelimiz öngörülebilir boyutta sağlam anevrizmalar üretir. Ayrıca, bu model dTAA büyümesini durdurabilecek veya yırtılmayı önleyebilecek genetik ve farmasötik hedefleri test etmek için kullanılabilir. İnsan hastalarda, bu gibi müdahaleler anevrizma rüptürü ve zor cerrahi müdahale önlemeye yardımcı olabilir.

Giriş

Bu yöntemin amacı aort anevrizması oluşumu sırasında inen torasik aortun gelişimi, patofizyolojisi ve yapısal değişikliklerini incelemektir. Modelimiz farelerde torasik aort anevrizmalarını (dTAA) indüklemek için tekrarlanabilir ve tutarlı bir yöntem sunarak çeşitli genetik ve farmakolojik inhibitörlerin test edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu çalışma, dTAA hastalığı olan insanlar için uygulanabilir bir tedavi stratejisine çevrilebilecek ilaçların ve gen terapilerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.

torasik aort duvarı zayıfladığında ve zaman içinde genişlediğinde yırtılma veya yırtılma meydana geldiğinde kritik bir çapa ulaşıncaya kadar dTA'lar oluşur. Klinik olarak, dTAA sessizlik içinde ilerleyebilir, aort duvarının yapısı o kadar bozulmuş ki sonunda başarısız olana kadar boyutu artmaktadır, yıkıcı sonuçlara yol açabilir. Bununla ilgili olarak, semptomlar genellikle sadece anevrizma tehlikeli bir boyuta ulaştığında gelişir (100-150% genişleme) ve diseksiyon veya rüptür için yüksek risk altındadır^1,2. dTAA rüptürü neredeyse evrensel olarak ölümcül^{dür 3}, ve elektif cerrahi onarım önemli morbidite taşır^4,5. Ayrıca, çoğu hasta cerrahi^onarım6 ,⁷önce yaklaşık 5 yıl boyunca bir aort anevrizması tanısı taşımak . Bu pencere, cerrahi olmayan müdahale için uygun bir zamanı temsil eder. Bu nedenle, dTAA'nın tedavisi veya yavaş ilerlemesi için tıbbi tedavilere ihtiyaç duyulmaktadır ve anevrizma araştırmaları alanında önemli bir ilerleme yitirmeolacaktır. Şu anda dTAA patogenezinin eksik anlaşılması nedeniyle dTAA için tıbbi tedavi bulunmamaktadır.

Son 20 yıl içinde, birkaç dTAA hayvan modelleri geliştirilmiştir, ancak bu modellerin her biri bizimkinden farklı ydı ve sağlam anevrizmalar üretmedi. Bizimkine en çok benzeyen bir murine dTAA modeli, CaCl 2'nin aort adventisine doğrudan uygulanmasını içeren Ikonomidis ve ark.⁸tarafından geliştirilmiştir. Modelimiz Ikonomidis tarafından belirlenen tekniklerin çoğundan uyarlanmış olsa da, modelimiz üç ayrı şekilde benzersizdir. İlk olarak, modelimizde aort 3-5 dakika topikal elastaza maruz kalır, CaCl₂ pozlama 15 dakika ile karşılaştırıldığında. İkinci olarak, aort genişlemesi 2 hafta içinde oluşur, CaCl 16 hafta ile karşılaştırıldığında₂ model. Son olarak, modelimiz sürekli olarak yaklaşık %100 dilatasyon anevrizmaları üretir, CaCl₂ uygulaması tarafından üretilen %20-30 aort dilatasyonlarına göre (aort artışı olarak tanımlandıkları için gerçekten anevrizma olarak kabul edilemezler). çapı >%50). Anevrizma oluşumunun diğer cerrahi olmayan murine modelleri vardır, Apo E nakavt fare gibi, anjiyotensin infüzyonu ile sağlam anevrizmalar oluşturan II. Ancak, bu fareler özellikle alçalan torasik aort^9,10anevrizma yerine supra-renal veya yükselen torasik aort anevrizmaları geliştirmek .

Bu protokol için rasyonel basit, ucuz ve bir murine modelinde dTAA çalışma için uygun bir yol olmasıdır. Fare modeli diğer damar hastalıklarında etkili olduğu tespit edilmiştir birçok genetik ve hücreye özgü nakavt kullanmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bizim özel TAA modelinin kullanımı iyi kabul edilmiş ve deneyler yüksek etkili dergilerde yayınlanmıştır^11,12. Bu noktada, model abdominal aort anevrizması (AAA) mürin modellerinde önemli bir etkiye sahip olası genetik ve farmakolojik tedavileri araştırmak için kullanılmıştır; ancak laboratuvarımız dTAA modelinin kullanımını genişlettikçe, insanlarda hedefli tedaviler olarak kullanılabilecek dTAA oluşumuna özgü hedefler buluyoruz.

Bu model en çok murine mikro-cerrahi yetenekleri olan laboratuvarlar için uygundur. Teknik olarak zor olsa da, daha önce hiçbir cerrahi deneyimi olmayan araştırmacılar tarafından bile sürekli olarak yürütülebilir. Hiçbir murine cerrahi deneyimi olan bir araştırmacı için model yaklaşık 20 ameliyat seans (veya yaklaşık 50 fare) hakim olabilir. Önceki cerrahi deneyimi olan araştırmacı için, model 5 ameliyat seanslarında (yaklaşık 20 fare) hakim olabilir. Biz yüksek kaliteli bir video ile, ustalık için zaman daha da azaltılabilir inanıyoruz. Yeterlilik sağlandıktan sonra ameliyat için 35 dakika, terminal hasat için 20 dakika içinde işlem tamamlanabilir. Laboratuvarımızdaki cerrahlar günde 10-12 tam ameliyat yapabilirler ve ameliyat mortalite oranı %5-10'dur. Mortalitenin en sık nedeni göğüse girişte akciğer hasarı, anestezik toksisite veya diseksiyon sırasında aort un yırtılmasıdır. DTAA araştırmaek, bu model aynı zamanda göğüs diğer müdahaleler ilerleyen araştırmacılar için torasik aort ve akciğer hilum güvenli ve kolay erişim için bir rehber olarak hizmet vermektedir.

Protokol

Hayvan protokolleri Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (No. 3634) tarafından onaylanmıştır.

1. Anestezi indüksiyonu ve entübasyon

1. 8-10 haftalık erkek C57BL/6 fareyi kapalı bir odaya %5 izofluran ve oksijen karışımı ile solunumlar gözle görülür şekilde yavaşlayıncaya kadar 5 dakika boyunca yerleştirin.
   NOT: Deneysel protokole bağlı olarak farelerin farklı suşları, cinsiyetleri ve yaşları kullanılabilir. Dişi farelerin entübe edilmesi daha zor olabilir çünkü daha küçük boyut ve dolayısıyla daha küçük hava yolu.
2. Vandivort ve ark.¹³tarafından açıklandığı gibi fare entübe .
   NOT: Entübasyon adımı, bu modelin hem öğrenmek hem de gerçekleştirmek için en zor kısmıdır. Yukarıda başvurulan yazarlar kendi video adımları açıklayan mükemmel bir iş yok.

2. Fareyi cerrahi tahtaya securing etmek

1. Endotrakeal (ET) tüpünü bağlayın, göğüs teki yükselmeyi onaylayın ve fareyi sağ lateral dekübitus pozisyonuna getirin. Isoflurane'yi yaklaşık %3'e çevirin ve her iki göze de yağlama uygulayın. Ventilatör dakikada yaklaşık 200 nefes ve 225 μL gelgit hacmi sağlayacak şekilde ayarlanmalıdır.
   NOT: Isofluran %5'te bırakılırsa toksisite hızlıdır. Ancak, izoflurana yanıt değişkendir, bu nedenle anestezik akış hızı, spontan diyafragmatik kasılmalar yaklaşık her 10-20'de bir meydana gelecek ve mukoza ve maruz kalan dokunun incelenmesinde oksijenasyon yeterli görünmektedir.
2. ET tüpünü bantla tahtaya sabitleyin. Ön pençe burun ile hizada ve bant ile güvenli böylece sağ kol rostrally genişletin.
3. Sağ kol ve kuyruk arasında gerginlik bir çizgi oluşturmak için kuyruk caudally çekin, omurganın uzantısı üreten.
   NOT: Hem kuyruğun hem de sağ pençenin hizaya getirilmesi, ET tüpünün takılmasını veya yerinden çıkarmasını önler.
4. Sol bacağı doğal konumuna getirin. Sol kol ventrally haddelenmiş gazlı bez ve bant aşağı çizin.

3. Ameliyata hazırlık

1. Farenin sol kanadını sol omuzdan sol karnına kadar elektrikli makaslarla tıraş edin.
2. Betadine çözeltisini cerrahi bölge üzerinde fırçalamak için pamuk uçlu aplikatör kullanın. Cerrahi site üzerinde% 70 etanol çözeltisi fırçalamak için yeni bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. Kurumasını bekleyin. Steril bir perde yerleştirin.
3. DİkKAT: Elektrokoter kullanılmadan önce tüm etanolün tamamen kurutulduğundan ve etanolün tutuşturduğundan emin olun.

4. Toraksa giriş

1. Cerrahi makas kullanarak hemithorax orta noktasında 1 cm lateral kesi yapın. Kaburga görünür olana kadar kas katmanları bölmek için el elektrokoter kullanın.
2. Doğrudan kaburga 2 mm kısmını cauterize.
   NOT: Kaburgaüzerinde elektrokoter kullanırken spontan solunum frekansını gözlemleyin. Farenin kateterlik sırasında diyafram daralması varsa, uç toraksa girebilir ve akciğeri delebilir, bu modelde genellikle ölümcüldür.
3. Kaburga boşluğunda, koterize kısımdan daha üstün ıslak, ince pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, plevral alana girmek için ucu dokunun üzerine döndürün. Akciğerçökmesine yardımcı olmak için toraks içine ıslak 3 mm x 2 mm sünger yerleştirin.
   NOT: Sadece son derece hassas olduğu için yumuşak, ıslak, süngerler akciğertemas sağlar.
4. Diyafram görünür olana kadar, koterize kaburga üst yönü boyunca kesmek için makas kullanın.

5. Aort maruziyeti

1. Kaburga retraktörleri yerleştirin ve torakotomi kesisini açmak için kullanın. Süngeri akciğer yüzeyinden dikkatlice çıkarın.
2. Islak 6 mm x 4 mm sünger yerleştirin, böylece akciğeri kaplayan, uçları rostrally ve caudally işaret ile yatıyor. (Geniş düz) akciğer retraktörü süngerin üzerine yerleştirin ve azalan torasik aort açığa çıkana kadar retraktör ventrally'yi yavaşça kaydırın.
3. Yaklaşık 5 mm'lik bir kesit için bağ dokusunu ve aorttaki yağı incelemek için #7 forseps kullanın.
   NOT: Küçük damarlar aort boyunca enine çalışıyor olabilir; diseksiyon sırasında yırtılma önlemek (en az 14x büyütme kullanarak bu komplikasyonu önlemek için yardımcı olabilir).

6. Elastaz maruziyeti

1. 0,5 mm x 1 mm süngeri 12 μL domuz pankreas elastazı ile doygunlaştırın ve aort yüzeyine yerleştirin.
   NOT: Süngerin kontralateral akciğere dokunmasına izin vermeyin.
2. Önceden belirlenen süreden sonra (genellikle 3-5 dk), #7 forceps ile elastaz süngeri çıkarın. Akciğer retraktörü çıkarın. Göğüs boşluğunu 1 mL steril salin ile sulandırın.
   NOT: Akciğer süngerinin doymuş ve yumuşak olmasını sağlayarak akciğer yüzeyinin çıkarılmasını kolaylaştıracağı için, sulamadan önce akciğer retraktörü tuzlu sula çıkarın.
3. Kalan tuzlu sulama emmek için haddelenmiş 2 "x 2" gazlı bez kullanın. Isoflurane%2'ye düştü.

7. Göğüs kapanması

1. Akciğer süngerini çıkar. Kaudal akciğer retraktörü çıkarın. Rostral akciğer retraktörü çıkarın.
2. Kaburga karşı 3 kesildi 6-0 emilemez dikişler, her gevşek bir düğüm kravat ama aşağı kravat yok. Dikiş iğnesi ile akciğerdokunmamaya özen.
3. Çıkış tüpünü ventilatöre tıkarak veya et tüpünden 0,5-1,0 mL havayı hızla üfleyerek 3 şekilde dur musluğunu kullanarak akciğeri yeniden şişirin.
   NOT: Barotravmayı önlemek için, hava dolu şırınganın aşırı kullanımından kaçının ve en fazla 1,0 mL hava kullanın.
4. Emilemez dikişleri bağlayın. Çalışan 5-0 emilebilir multifilament sütür ile kas tabakalarını yeniden approximate. Isoflurane%1'e düştü.
5. 7-10 kesilen 5-0 emilemez dikişler ile yakın cilt. Isoflurane%0'a dönün.

8. Kurtarma

1. Buprenorfinin 6 μg (0.02 mL 0.3 mg/mL süspansiyon) kısmını subkutan olarak uygulayın. Bandı sağ ayak, kuyruk ve sol koldan ve ardından sağ kol bandından çıkarın.
2. Fare ekstremiteleri hareket ettirdiğinde, ET tüpünden kaymak için kuyruğundan çekerek ektübate edin. Supine pozisyonda yüksek oksijen içeriği ısıtıcı odasında yerleştirin.
   NOT: Fareyi oksijen odasından kafese taşımak, kendini normal duruş pozisyonuna çevirebildiği zaman güvenlidir. Ayrıca, fareler ağrı belirtileri için izlenmeli, sıkıntı, ya da ameliyattan sonra ilk 24-48 saat boyunca sık gelişmek için başarısızlık ve belirtildiği gibi ek analjezi veya yumuşak gıda sağlanan.

9. Aort anevrizması maruziyeti (terminal hasat prosedürü)

NOT: Genel olarak doku hasadı 14 günde yapılır, çünkü bu maksimal dilatasyon dönemini temsil eder. Ancak, deneye bağlı olarak, hasat işleminin zamanlaması deneye bağlı olarak 3 gün ile 4+ hafta arasında herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir.

1. Yukarıda açıklandığı gibi ameliyat alanına entübasyon ve güvenli fare (bölüm 1-3). Periton girmemeye özen alarak sol kanadından orta karına kadar orta derecede deri incise makas kullanın.
2. Dorsal sol kanadından sol omuz seviyesine doğru eğimli deri. Daha sonra 90° açıyla aksilladan göğüs kafesine doğru eğilin.
   NOT: Bu kesi orijinal deri kesisini tamamen çevrelemelidir.
3. Kateter kullanarak, farenin ventral yönü doğru deri flep incelemek, sol hemithorax açığa. Karın girmek için makas kullanın ve sol diyafram alt ortaya çıkarmak için ventral dorsal için sol costal marjı boyunca eğim. Diyaframın lateral kenarı istenilen açılabilir.
4. Önceki adımla oluşturulmazsa, diyaframı en yanal kenarına doğru bükün. Bu deliğe katutery ucu yerleştirin ve ksifoid sürecine costal marjı kapalı diyafram cauterize. Nemli ince uçlu pamuk uçlu aplikatör kullanarak, akciğeri göğüs duvarına yapışıklıklardan hafifçe kurtarın ve akciğeri medial olarak itin.
   NOT: Yapışmalar göğüs duvarından kolayca çıkamazsa, bunları çıkarmak için katüllik kullanın; bunu yapmak ağır kanamaya neden olabilir akciğer yırtılma önlemeye yardımcı olur.
5. Kaburga bir den maliyet marjı göğüs duvarının iç cauterize, orta aksiller çizgi ye dorsal ama aort en az 2 mm. Küretilmiş çizgi boyunca göğüs duvarını kesin.
   NOT: Bu teknik interkostal arterlerden kanamayı önler.
6. Kaburga bir üstün marjı boyunca kesilmiş ve daha sonra göğüs kafesi lateral kenarı boyunca caudally, sol göğüs kafesi kaldırarak. Akciğer üzerine retractors yerleştirin ve medially çekin. Diyafram üzerine retraktör yerleştirin ve mümkün olduğunca çok aort ortaya çıkarmak için caudally çizin.
7. Aort anevrizması ve etkilenmemiş distal segmentteki yapışıklıkları gidermek için kuru pamuk uçlu aplikatör kullanın. Etkilenmemiş kontrol segmentinin çapını ve elastazın en geniş kısmını video mikrometrisi kullanarak anevrizma ile ölçün.
   NOT: Video mikrometri ölçümleri, anevrizmal segmentin yüzde genişlemesini denklem 1'li bir kontrol segmentine göre hesaplamak için kullanılır. Anevrizmal segment 1'e 0,5 mm distal olan bir kontrol segmenti seçilir.
   
   Denklem 1
    
8. Harms forceps ile aort kavramak, sadece tedavi segmentine distal. Forceps distal kesmek için makas kullanın, sonra omurilik kapalı aort incelemek. Tedavi segmentine aort proksimal kesin ve anevrizmal aort kaldırın.
9. Bir tüberkülin şırınga ve iğne kullanarak, aort lülesini istediğiniz gibi tuzlu ve proses dokusu ile yıkayın.

Sonuçlar

Protokolümüzün uygulanması, farelerde tuzlu kontrollere kıyasla sağlam dTAA ile sonuçlanır. Geliştirilen TAA'lar fusiform şeklindedir ve sadece aortun tedavi edilen kısmında görülür (Şekil 1 ve Şekil 2)¹¹. Şekil 2 doku hasat bir video mikrometri ölçüm bir örnek gösterir. Denklem 1'i kullanarak, aort genişlemesi bu örnekte %130'dur.

Johnston ve ark.

Tartışmalar

Torasik ve abdominal aort hücresel ve embriyolojik olarak farklı, hangi anevrizmal hastalık ile ilgili^14,15,16. Bu nedenle, TAA çalışmak için belirli bir hayvan modeli gereklidir. Diğer murine dTAA modelleri⁸yayınlanmış olmasına rağmen , bizim gerçekten anevrizmal olarak kabul edilebilir inen torasik aort dilatasyonu oluşturmak için tek modeldir (üzerinde 50% dilatasyon). Ayrıca, bizim m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiocatheter (22G)			Used for ET Tube
Dumont Tweezers; Pattern #7 x2	Roboz	RS-4982
Graefe Tissue Forceps	Roboz	RS-5158
Harms Forceps x2	Roboz	RS-5097
Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length	Roboz	RS-7800
KL 1500 LED Light Source	Leica	150-400
M205A Dissction Microscope	Leica	CH 94-35
Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide	World Precision Instruments	500216-G
Metal Clip board			Use with the Mouse Retractor Set
Mouse Retractor Set	Kent	SURGI-5001	Need 2 short and 1 tall fixators
Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector	Harvard Apparatus	73-0043	MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled
Sigma Aldrich	Elastase from porcine pancreas	E0258-50MG	Can be purchased in various size bottles
Small Vessel Cauterizer Kit	Fine Science Tools	18000-00	Recommend using rechargable AA batteries
Spring Scissors, 10.5cm	World Precision Instruments	14127
Steril Swabs (Sponges)	Sugi	31603	Can be cut to size
Surgi Suite Surgical Platform	Kent		Attach to clip board
Tech IV Isoflurane Vap	Jorgensen Laboratories	J0561A	Anesthesia vaporizer