Temel Araştırma Çalışmalarında İstihdam için Tarımsal Plastik Filmlerden Mikro ve Nano Plastiklerin Oluşturulması

Özet

Mikro ve nanoplastiklerin (sırasıyla MP'ler ve NP'ler) oluşumunu ve boyutsal karakterizasyonunu, kademeli bir mekanik frezeleme, taşlama ve görüntüleme analizi süreci kullanarak gösteriyoruz.

Özet

Tarımsal ekosistemlerde dağılmış mikroplastikler (MP'ler) ve nanoplastikler (NP'ler) toprakta ve yakındaki su yollarında biyota için ciddi bir tehdit oluşturabilir. Ek olarak, NP'ler tarafından adsorbe edilen pestisitler gibi kimyasallar toprak organizmalarına zarar verebilir ve potansiyel olarak besin zincirine girebilir. Bu bağlamda, plastik malç filmleri gibi tarımsal olarak kullanılan plastikler, tarımsal ekosistemlerdeki plastik kirliliğine önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır. Bununla birlikte, kader ve ekotoksisite ile ilgili en temel çalışmalar, polistiren mikrosferleri gibi idealize edilmiş ve zayıf temsili MP malzemeleri kullanmaktadır.

Bu nedenle, burada açıklandığı gibi, bu tür çalışmalar için temsili milletvekilleri ve NP'leri mekanik olarak oluşturmak için laboratuvar ölçeğinde çok adımlı bir prosedür geliştirdik. Plastik malzeme, kriyojenik arıtma (CRYO) veya çevresel ayrışma (W) yoluyla kırılganlaştırılan polibütirat adipat-ko-tereftalatın (PBAT) ticari olarak temin edilebilen plastik malç filmlerinden ve işlenmemiş PBAT peletlerinden hazırlanmıştır. Plastik malzemeler daha sonra 46-840 μm boyutunda milletvekilleri oluşturmak için mekanik frezeleme ile işlendi ve plastik parçaların rüzgar ve mekanik makineler tarafından aşınmasını taklit etti. Milletvekilleri daha sonra daha fazla analiz sağlamak için birkaç boyut fraksiyonuna elendi. Son olarak, 106 μm elek fraksiyonu, karasal milletvekilleri için yavaş boyut küçültme işlemini taklit eden bir işlem olan 20-900 nm'lik NP'ler üretmek için ıslak taşlamaya tabi tutuldu. Milletvekilleri için boyutlar ve şekil, stereomikrografların görüntü analizi ile belirlendi ve NP'ler için parçacık boyutunu değerlendirmek için dinamik ışık saçılması (DLS) kullanıldı. Bu süreçle oluşturulan milletvekilleri ve NP'ler, tarım alanlarından kurtarılan milletvekillerinin geometrik özelliklerine uygun düzensiz şekillere sahipti. Genel olarak, bu boyut küçültme yöntemi, tarımsal özel mahsul üretimi için kullanılan malç malzemelerini temsil eden polibütilen adipat-ko-tereftalat (PBAT) gibi biyolojik olarak parçalanabilen plastiklerden oluşan milletvekilleri ve NP'ler oluşturmak için etkili olduğunu kanıtladı.

Giriş

Son yıllarda, hızla artan küresel plastik üretimi ve plastik atıkların uygun olmayan şekilde bertaraf edilmesi ve geri dönüşüm eksikliği, deniz ve karasal ekosistemleri etkileyen çevre kirliliğine yol açmıştır ^1,2,3. Plastik malzemeler, çağdaş tarım için, özellikle sebzeleri, küçük meyveleri ve diğer özel mahsulleri yetiştirmek için gereklidir. Malç filmleri, yüksek ve alçak tünel kaplamaları, damlama bandı ve diğer uygulamalar olarak kullanımları, mahsul verimini ve kalitesini artırmayı, üretim maliyetlerini düşürmeyi ve sürdürülebilir tarım yöntemlerini teşvik etmeyi amaçlamaktadır ^4,5. Bununla birlikte, "plastikültür" ün artan istihdamı, plastik parçaların tarımsal ortamlarda oluşumu, dağıtımı ve tutulması ile ilgili endişeleri artırmıştır. Hizmet ömrü boyunca çevresel bozulma yoluyla gevrekleşmenin neden olduğu sürekli bir parçalanma işleminden sonra, daha büyük plastik parçaları, toprakta devam eden veya su akışı ve rüzgar yoluyla bitişik su yollarına göç eden mikro ve nanoplastikler (MNP'ler) oluşturur ^6,7,8. Güneş ışığı yoluyla ultraviyole (UV) radyasyonu, suyun mekanik kuvvetleri ve biyolojik faktörler gibi çevresel faktörler, çevresel olarak dağılmış plastiklerin plastik gevrekleşmesini tetikler ve bu da daha büyük plastik parçaların makro veya mezo-plastik parçacıklara parçalanmasına neden olur ^9,10. Daha fazla birleştirme, ortalama büyüklükteki parçacıkları (nominal çap; d_p) sırasıyla 1-5000 μm ve 1-1000 nm,¹¹. Bununla birlikte, NP'ler için üst d_p sınırı (yani, milletvekilleri için bir alt sınır) evrensel olarak kabul edilmemiştir ve birkaç makalede bu 100 nm¹² olarak listelenmiştir.

Plastik atıklardan elde edilen MNP'ler, toprak sağlığı ve ekosistem hizmetleri için ortaya çıkan küresel bir tehdit oluşturmaktadır. Ağır metallerin tatlı sudan milletvekilleri tarafından adsorpsiyonu, çevredeki ortama kıyasla 800 kat daha yüksek ağır metal konsantrasyonuna yol açtı¹³. Ayrıca, sucul ekosistemlerdeki milletvekilleri, ışık penetrasyonunu değiştirerek, oksijen tükenmesine neden olarak ve sucul organizmalarda penetrasyon ve birikim de dahil olmak üzere çeşitli biyotalara yapışmaya neden olarak çoklu stres faktörleri ve kirleticiler oluşturur¹⁴.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, MNP'lerin mikrobiyal topluluklar ve bitkiler de dahil olmak üzere toprak jeokimyasını ve biyotasını etkileyebileceğini göstermektedir^15,16,17. Dahası, NP'ler gıda ağını tehdit ediyor^17,18,19,20. MNP'ler toprakta kolayca dikey ve yatay taşımaya maruz kaldıklarından, pestisitler, plastikleştiriciler ve mikroorganizmalar gibi emilen kirleticileri topraktan yeraltı sularına veya nehirler ve akarsular gibi sucul ekosistemlere taşıyabilirler^21,22,23,24. Malç filmleri gibi geleneksel tarım plastikleri, kullanımdan sonra tarladan çıkarılması ve çöp sahalarında atılması gereken polietilenden yapılır. Bununla birlikte, eksik kaldırma, topraklarda önemli miktarda plastik döküntü birikimine yol açar 9,25,26. Alternatif olarak, toprak-biyobozunur plastik malçlar (BDM'ler), kullanımdan sonra toprağa sürülecek ve zamanla parçalanacakları şekilde tasarlanmıştır. Bununla birlikte, BDM'ler toprakta geçici olarak devam eder ve yavaş yavaş bozulur ve milletvekillerine ve NP'lere^{ayrılır 9,27}.

Mevcut birçok çevresel ekotoksikolojik ve kader çalışması, idealize edilmiş ve temsili olmayan milletvekilleri ve NP'ler model materyalleri kullanmaktadır. En yaygın kullanılan vekil MNP'ler,^12,28 ortamında bulunan gerçek MNP'leri yansıtmayan monodispers polistiren mikro veya nanosferlerdir. Sonuç olarak, temsili olmayan milletvekillerinin ve NP'lerin seçimi yanlış ölçümlere ve sonuçlara neden olabilir. Karasal çevre çalışmaları için uygun model ΜNP'lerin eksikliğine dayanarak, yazarlar bu tür modelleri tarımsal plastiklerden hazırlamak için motive olmuşlardır. Daha önce BDM'lerden ve polietilen peletlerden MNP'lerin oluşumunu, plastik peletlerin ve film malzemelerinin mekanik frezelenmesi ve taşlanması yoluyla ve MNP'lerin boyutsal ve moleküler özelliklerini bildirmiştik²⁹. Mevcut makale, malç filmleri veya peletlenmiş hammaddeleri gibi tüm tarımsal plastiklere daha geniş bir şekilde uygulanabilecek MNP'lerin hazırlanması için daha ayrıntılı bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). Burada, örnek olması için, tarımsal plastikleri temsil etmek için biyolojik olarak parçalanabilen polimer polibütilen adipat tereftalatın (PBAT) bir malç filmi ve küresel peletlerini seçtik.

Protokol

1. Milletvekillerinin plastik peletlerden kriyojenik ön işlem ve frezeleme yoluyla işlenmesi

NOT: Bu metodoloji, sunulan bu çalışma²⁹ için kullanılan aynı malzemeden oluşan bir PBAT filmi kullanan başka bir yerde açıklanan bir prosedüre dayanmaktadır.

1. ~1 g'lık polimer pelet numunelerini tartın ve 50 mL'lik bir cam kavanoza aktarın.
2. "Dikdörtgen teslimat" tüpünü, döner kesme değirmeninin önündeki yuvaya 20 ağ (840 μm) elek ile yerleştirin ve dağıtım borusunu durdurma pimine çarpana kadar kaldırın.
3. Cam plakayı freze odasının yüzünün üzerine yerleştirin ve ayarlanabilir kelepçe ile sabitleyin. Ardından, değirmen çıkışının altına 50 mL'lik bir cam kavanoz yerleştirin (Şekil 2).
4. Kayar yan kol desteğini ön camın ortasındaki değirmene (sağ üst tarafta bulunur) yerleştirin ve tırtıllı cıvata ile sıkın. Değirmenin ön camının güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 2a).
5. Hazne hunisini değirmenin üstüne üst freze odasının açıklığına yerleştirin.
6. Değirmenin çalışmasını başlatmak için bir hat kablosunu elektrik prizine ve basın kablosu anahtarını takın.
   NOT: Sıkışmayı önlemek için, malzemeyi yalnızca değirmen açıldıktan ve döndükten sonra besleyin. Ayrıca, tüm frezeleme prosedürü boyunca göz ve kulak koruması kullanın.
7. Yavaşlamayı veya sıkışmayı önlemek için numuneyi yavaşça hazneye (yaklaşık 10 pelet / dak) besleyin. Duyulabilir gürültü azaldıktan sonra, bir sonraki pelet grubunu (~ 10 adet) ekleyin. Peletleri (1 g) işledikten sonra, soğuması için değirmenin çalışmasını ~ 20 dakika durdurmak için kablo anahtarına basın. Numuneyi beslemek ve parçacıkların besleme haznesi içinde dışarı atılmasını ve yığılmasını önlemek için ahşap bir piston kullanın.
   DİKKAT: Optimum besleme hızı, işleme malzemesinin türüne bağlı olarak değişir. Kesme odasındaki partikül sürtünmesi nedeniyle işlem hızı azalırsa veya cam plakada erimiş polimer oluşumu gözlenirse, polimer parçacıklarının aşırı ısınmasını ve daha fazla erimesini önlemek için değirmeni derhal kapatın.
8. 20 ağ (840 μm) dağıtım tüpünü çıkarın ve ilk partinin tamamlanmasının ardından 60 ağ (250 μm) dağıtım tüpü ile değiştirin (Şekil 2b).
9. Toplanan malzemeyi değirmen haznesine tekrar yerleştirin. 250 μm frezeleme fraksiyonu için 1,1 ve 1,7 numaralı adımları izleyin.
10. Toplanan 250 μm fraksiyonları üç kata kadar yeniden besleyin.
11. Odadaki kalan parçacıkları geri kazanın ve toplanan ana fraksiyona ekleyin.

2. Plastik filmlerin kriyojenik ön işlem ve frezeleme ile işlenmesi

1. Rulodan bir film örneği alın ve numuneyi bir kağıt kesici ile ~ 120 mm (çapraz yön) x 20 mm (makine yönü) şeritler halinde kesin.
2. Parçaları (~1 g) 800 mL deiyonize (DI) suda 1000 mL'lik bir cam kabda 10 dakika bekletin. Bu adım, polimeri önceden ıslatarak sonraki kriyojenik soğutma prosedürü için gevrekleşmeyi iyileştirir.
   DİKKAT: Kriyojenik eldivenler ve güvenlik gözlükleri takarak sıvı azotu güvenlik ekipmanlarıyla birlikte kullanın.
3. Kriyojenik bir kaba yavaşça 200 mL sıvı azot (_N2) ekleyin.
4. Önceden ıslatılmış film parçacıklarını çelik cımbızla kriyojenik kaba dikkatlice aktarın. Sıvı_N2'de 3 dakika bekletin.
5. Dondurulmuş film parçalarını 200 W, 14 vitesli bir karıştırıcıya aktarın.
6. Dondurulmuş cam film yapısını kırmak için dondurulmuş malzemeyi 10 s hız seviyesi 3'te işleyin. Boyutun daha da küçültülmesini teşvik etmek için 400 mL DI su ekleyin ve film suyu bulamacını 5 dakika boyunca karıştırın.
7. Bulamacı filtreli (1 μm ağ) bir Büchner hunisine aktarın ve en az 1 saat boyunca vakum uygulayın.
8. Katı partikülleri 30 °C'de alüminyum bir kapta en az 48 saat vakumla kurutun.
9. Kuru parçacıkları cımbızla değirmene besleyin. Frezeleme için 1.1-1.11 arasındaki adımları izleyin.

3. Çevresel yaşlandırma ve frezeleme yoluyla ön işlemden geçirilmiş plastik filmlerin işlenmesi

1. Tarladan geri kazanılan plastik film parçalarını pürüzsüz bir yüzeye (laboratuvar tezgahı) yerleştirin. Emilen toprak parçacıklarını ve bitki kalıntılarını yumuşak kıllı fırça ile dikkatlice çıkarın.
2. Filmi makasla ~4^cm2 ~1,0 g'lık numuneler halinde kesin.
3. Film parçalarını, 500 mL DI suyuyla doldurulmuş 1000 mL'lik bir beherin içine ekleyin. 1 saat boyunca 20 mm karıştırma çubuğu ile 300 ^dakika-1 oranında karıştırın.
4. Beherin hafif bir çalkalanması altında DI suyunu bir lavaboya veya plastik kovaya boşaltarak ve tekrar sokarak çözünmüş toprak parçacıklarını temizleyin. Bu adımı üç kez yineleyin. Sürekli ajitasyon, toprak parçacıklarının suda dağılmasını sağlar ve daha kolay dökülebilir.
5. Numuneleri beherden alüminyum bir kaba aktarın. Plastik numuneleri 12 saat boyunca hava ile kurutun ve ardından 30 °C'de 24 saat vakumlu fırında aktarın ve kurutun. Frezeleme için 1.1-1.11 arasındaki adımları izleyin.

4. Basamaklı eleklerle eleme prosedürü

1. Elekleri (çapı 3 inç) alttaki tavadan başlayarak, ardından en ince elek (#325; 45 μm) ve ardından giderek daha kaba eleklerle (#140; 106 μm ve #60; 250 μm gibi, #20; 840 μm elek en kaba olanıdır) istifleyin ve kapağı üstüne yerleştirin.
2. Elek çalkalayıcının açıklıklarına dört pim yerleştirerek dört eleğin tümünü çalkalayıcıya monte edin.
3. Adım 1, 2 veya 3'te toplanan tek tek fraksiyonları dört basamaklı eleğin üzerine aktarın. 300 ^{dakika-1'de 10} dakika çalkalayın.
4. Daha büyük (üst) fraksiyonu ayrı ayrı geri kazanın, bu da daha fazla frezelemeye tabi tutulacaktır.
   NOT: Çalkalayıcıdaki sallanma hızını gerektiği gibi ayarlayın. Alternatif olarak, elekleri elle sallamak mümkündür. Örgü #20 elek ile başlayarak bir seferde yalnızca bir elek kullanın: alt kısmı ve kapağı elek karşısında elle sıkıca tutun ve 5 dakika boyunca eksenel ve yatay olarak sallayın.
5. 1.6-1.10 adımlarında açıklandığı gibi 106 μm'nin elenmiş d_p > partiküllerini döner kesme değirmenine yeniden takın.
6. Alt fraksiyonları tavadan geri kazanın ve parçacıkları bir sonraki küçük elek boyutuna yeniden ekleyin. 106 μm parçacıkları ana fraksiyonu temsil edene kadar prosedürü tekrarlayın.
7. Toplanan 106 μm fraksiyonları birleştirin ve parçacıkları kuru bir alanda (kurutucu veya hava geçirmez plastik torba) saklayın.
   NOT: 45 μm fraksiyonu, 106 μm fraksiyonunun bir parçasıdır; Bununla birlikte, önceki fraksiyon izole edilmemiş ve verim genellikle çok düşük olduğu için ayrı ayrı analiz edilmiştir. Tek tek fraksiyonların verim geri kazanımları ve partikül boyutu fraksiyonları, yüksek hassasiyetli bir mikro terazi kullanılarak ilk besleme fraksiyonuna göre her bir eleme fraksiyonu (mesh #20 - mesh #325) için ağırlıkça %cinsinden gravimetrik ölçümlerle belirlenebilir.

5. Islak öğütme için sulu bir NP bulamacının hazırlanması

1. 1000 mL cam beherin içine 800 mL damıtılmış su ekleyerek ve bir karıştırma çubuğu (çap = 8 mm, uzunluk = 50,8 mm) yerleştirerek DI suyuna dağılmış bir milletvekili bulamacı hazırlayın.
2. Adım 1, 2, 3 veya 4'teki 106 μm plastik fraksiyonun 8 gramını DI suyuna sokun ve ağırlıkça% 1'lik bir bulamaç üretin.
3. Cam kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve parçacık yumuşamasını teşvik etmek için parçacıkları suya batırmak için 400 ^dakika-1'de 24 saat boyunca manyetik olarak karıştırın.
4. Partikülleri 1000 mL'lik plastik bir kaba aktarın.
5. Ek iki adet 1000 mL plastik kabı, taşlama işlemi sırasında öğütücünün haznesindeki yapışan parçacıkları durulamak için kullanılacak DI suyuyla doldurun.

6. NP üretimi için ıslak taşlama makinesinin hazırlanması

1. Islak sürtünmeli taşlama makinesine 46 tane büyüklüğünde (taşlama taşı kumu= 297-420 μm) taşlar yerleştirin ve orta somunları 17 mm'lik bir anahtarla elle sıkıca sabitleyin.
2. Hazneyi üstüne ekleyin ve üç somun ve cıvatayı 17 mm'lik anahtarla sabitleyin.
3. Çarpıştırıcının çıkışının altına 1 L'lik bir plastik toplama kavanozu yerleştirin. İşleme sırasında değişim için kullanılacak olan prizin yanına ikinci bir boş 1 L kova yerleştirin.
4. Gösterge boşluğunu, sıfır konumundan pozitif 0,10 μm kaymaya karşılık gelen + 1,0 olarak ayarlayın.
5. Gücü açın ve taşlama taşlarının dokunuşunu duyana kadar ayar tekerleğini saat yönünde dikkatlice çevirin. Ardından, esnek ölçüm halkasını sıfıra ayarlayın ve tekerleği hemen saat yönünün tersine çevirin. Varsayılan olarak, hız 1500 ^dk-1'e ayarlanır.
   NOT: Taşların "kuru öğütülmesinden" kaçının, çünkü bu taşlama taşlarında aşırı ısı yaratır.
6. Taşlar temas edene kadar ayar tekerleğini saat yönünde çevirin ve su-NP bulamacını hazneye yavaşça doldurun. Boşluğu sürekli olarak -2,0'lık bir boşluk göstergesine düşürün, bulamaç tanıtıldıktan sonra sıfır konumundan negatif 0,20 μm'lik bir kaymaya karşılık gelir. İki taş disk arasındaki plastik parçacık-su bulamaçları, milletvekillerinden NP'lere dönüşümü teşvik eder ve taşlama taşları arasında doğrudan sürtünmeyi önler.
7. Kovadaki dolum seviyesi 0,5 L'yi aştığında toplama kovalarını değiştirerek bulamacı toplayın.
8. Partikülleri toplayın ve öğütücüye 30-60 kez tekrar yerleştirin; daha yüksek geçişler (yeniden giriş sayısı) daha küçük parçacık boyutlarıyla sonuçlanır.
9. İşleme sırasında uygun bulamaç karıştırmaya izin vermek için hazneye yapışan parçacıkları hazırlanan DI su şişesi ile yıkayın.
   NOT: İşlem sırasında ara numunelerin toplanması, çıkış akışına 20 mL cam şişelerin tutulmasıyla mümkündür. Bireysel adımlar, proses şiddeti (geçiş sayısı) artarken parçacık parçalanma mekanizmalarını değerlendirecektir. Bulamacı geri kazanın ve iyi karıştırma için 25 ° C'de 400 ^dakika-1'de 4 saat karıştırın; bulamacın stabilize olması için 48 saat bekletin.

7. NP'lerin bulamaçtan geri kazanımı ve kurutulması

1. Bulamaçta birden fazla katman gözlenirse, bulamacı yavaşça ek bir 1000 mL cam kabın içine dökerek alt fraksiyonu (veya en yüksek NP konsantrasyonuna sahip fazı) izole edin.
2. Fraksiyonları santrifüj şişelerine (50 mL) ve 10 dakika boyunca santrifüje aktarın (göreceli santrifüj kuvveti [RCF] = 20 x 10² g). RCF (ayrıca g-kuvveti olarak da adlandırılır), rotor yarıçapının ve rotor hızının bir fonksiyonu olarak üretilen radyal kuvvettir ve bu da daha ağır parçacıkların ve bulamacın suyunun ayrılmasına neden olur.
3. Şeffaf üst tabakayı ayrı bir alüminyum tavaya boşaltarak çıkarın.
4. Kalan alt tabakayı (NP bulamacı içeren) ek bir alüminyum kaba aktarın ve 48 saat boyunca 30 ° C'de vakumlu bir fırına yerleştirin.
5. Solunum maskesi takarken duman başlığı veya torpido gözü altında bir spatula ile kurutulmuş malzemeyi geri kazanın. Kurutulmuş içeriği 100 mL'lik bir cam kaba aktarın ve bir kapakla kapatın.
6. NP'leri bir şişede bulundurun ve hava geçirmez, kuru ve serin bir yerde (örneğin, bir kurutucu) saklayın.
   NOT: Üretim sürecinde çevreye salınan MNP'ler (burada, ıslak öğütme işlemi sırasında veya kurutulmuş parçacıklar olarak) sucul ve karasal ekosistemler için ciddi bir tehdit oluşturabilir. Özellikle, düzenleyici önlemler, mühendislik nanomalzemeleri için üretim ve kullanım riskini en aza indirmek için tasarlanmıştır³⁰. Bu nedenle, MNP'lerin oluşumu, bir duman başlığında veya torpido gözünde malzeme taşıma gibi özel ihtiyati adımlar gerektirir. Ayrıca, NP'lerin izolasyonu sırasında oluşan sulu atık çözeltileri (adım 6.7-6.9), Çevre Sağlığı ve Güvenliği Departmanı tarafından gerçekleştirilen bir kullanım ömrü sonu bertaraf prosedürüne tabi tutulacaktır.

8. Stereo mikroskopi ile MP görüntüleme

1. ~⁴ cm2'lik bir alana ~ 20 mg parçacık (adım 4'te toplanan) dağıtın. Beyaz veya yarı saydam milletvekillerini karanlık bir yüzeye yayın, arka plan kontrastını en üst düzeye çıkarmak için siyah veya koyu renkli milletvekillerini beyaz bir arka plana (kağıt sayfası) yayın.
2. Mümkün olan en büyük alanı (parçacık alanının ortası) yakalamak için mikroskopu en düşük büyütmeye ayarlayın. Ardından, ilgilenilen bölgelerde aydınlatma elde etmek için harici lambayı odak merkezine yönlendirin.
3. Görüş alanının ortasında >50 parçacığın algılanmasını sağlayan bir büyütme uygulayın. Bu miktar, sağlam istatistiksel değerlendirme sonuçları elde etmek için önerilir.
4. Parçacık örtüşmesi olmayan veya küçük olan alanlara ve iyi renk kontrastına odaklanın.
5. Dış parçacık şekillerine odaklanarak en az beş temsili görüntü yakalayın. Görüntüleme için kullanılan yerel bilgisayar, yüksek çözünürlüklü görüntüleri yazılıma bitmap olarak kaydeder.
6. Aşağıdaki nicel veri analizi için stereomikroskopla kaydedilen görüntüleri ImageJ (bitmap, tiff veya jpeg) tarafından tanınan bir dosya biçiminde kaydedin.
   NOT: Ana görüntünün bir cetvel veya görüntüde kayıtlı başka bir referans nesnesi kullanılarak çekildiği tam büyütme ayarlarında bir referans görüntü alın. Bu prosedür, ImageJ yazılımı aracılığıyla hazırlanırken ve analiz edilirken görüntülerin kolay kalibrasyonunu sağlayacaktır.

9. ImageJ ile görüntü analizi

1. ImageJ yazılımı^31'i açın ve Komut bulucuyu açmak için (CTRL + L) girerek dosya içe aktarmayı hazırlayın. Ardından sağ alt köşeye Bio-Formats yazın. Bu işlev, Dosya > İçe Aktar > Bio formatları menü yolunu etkinleştirir (> yazılım içindeki gezinme adımlarını ifade eder). Depolanan resim dosyalarının dizinini arayın.
   NOT: Bio-Formats paketi Command finder'da görünmüyorsa, Bio-Formats ImageJ altında çevrimiçi arama yapın. ImageJ'yi indirmek ve yüklemek için talimatları izleyin. Bio-Formats içe aktarıcı, ImageJ içindeki resim dosyalarını içe / dışa aktarmanın ve komutları aramanın basit bir şekilde işlenmesini sağlar.
2. Adım 4.7'de toplanan dosya konumundaki parçacık görüntüsünü ve adım 1.6'da açıklanan cetvel referanslı görüntüyü seçmek > Dosya > Aç'ı tıklatarak görüntüyü açın (alternatif olarak adım 9.1'de açıklandığı gibi Biyo-Biçimler içe aktarma). Kopya görüntünün eşik ayarları yapılırken orijinal görüntüyle karşılaştırmak için Üst Karakter + Command + D tuşlarına basılarak yinelenen bir görüntü oluşturulması önerilir.
   NOT: Dosya > Aç komutu, adım 8.7'de açıklandığı gibi ImageJ tarafından yerel olarak desteklenen çeşitli biçimleri açar. Alternatif olarak, bilgisayardaki görüntü konumunu seçin ve dosyayı ana ImageJ pencere durum çubuğuna sürükleyip bırakın. Görüntü dosyası otomatik olarak ayrı bir pencerede açılır.
3. Sırasıyla CTRL + ve CTRL - kullanarak görüntüyü yakınlaştırın ve uzaklaştırın.
4. Analiz Et'i > Ölçümleri Ayarla'yı tıklayarak ölçümleri ayarlayın, ardından varsayılan değerler olarak Alan ve Şekil Tanımlayıcıları'nı seçin.
5. Adım 8'de açıklandığı gibi cetvel referans görüntüsünü kullanarak ölçek çubuğunun uzunluğunun üzerine düz bir çizgi çizerek ölçek çubuğunu tanımlayın. Ölçeği Ayarla'> Çözümle'ye basın ve Bilinen mesafe altında çubuk uzunluğunun sayısal değerini ve karşılık gelen uzunluğun birimini girin.
6. Ölçek Çubuğu'> Analiz Et > Araçları'nı tıklatarak görüntüdeki ölçek çubuğunu görselleştirin ve görüntüde net kontrast gösterme gibi ayarları yapın. Görüntüde, ölçek çubuğu ayarları için ölçek çubuğunun yerleştirilmesi gereken bir konum seçin. Çubuğu kalibre edilmiş birimlerde, çubuğun piksel cinsinden yüksekliğini ve ölçek çubuğu etiketinin Yazı Tipi Boyutu'nu ayarlamak için Genişlik'i seçin. Etiket metin kutusunun doldurma rengini ayarlamak için arka planı seçin.
   NOT: Mikrometreler için μm girişi yeterlidir; program μm'yi veri çıkışında otomatik olarak uyarlar.
7. Görüntü > Türü > 8 bit'i seçerek görüntüyü 8 bitlik bir görüntüye dönüştürün.
8. Görüntü > Türü > 8 bit'i seçerek kopyalanan görüntüyü 8 bit'e dönüştürün.
9. Görüntü > > Eşiğini Ayarla > Ayarla'yı seçerek ayarlayın (boyutu orijinal görüntüyle karşılaştırın).
10. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'yı seçerek hangi ölçümlerin alınacağını belirleyin.
11. Parçacıkları analiz et > 0-sonsuz'u seçin, Sonuçları görüntüle'yi ve yerinde göster'i tıklatın.
12. Yatırım getirisi (.zip) sonuçlarını Ölçümleri Kaydet ve Klasör Seç altında saklayın.
13. Sonuçları Kaydet (*.csv) altında Dosya > Farklı Kaydet > Klasör Seç altında.

10. Elektronik tablo yazılımında partikül çapı (d_p) ve şekil faktörü hesaplama

NOT: Partikül çapı ve şekil faktörlerinin bilgisi, ortamdaki parçacık davranışı (kader, taşıma) ve yüzey alanının belirlenmesi için gereklidir. Bu nedenle, milletvekilleri çevresel çalışmalar için kullanıldığında geometri esastır. Örneğin, milletvekillerinin boyutlarına ve şekillerine bağlı olarak, topraktaki parçacık hareketini etkileyen MP-MP ve MP-toprak aglomerasyonları gibi toprakla farklı etkileşim mekanizmaları gözlenmiştir ^15,32. Bu nedenle, d p-parçacık boyutu dağılımını ve geometrik parametresini belirlemek için aşağıdaki adımlar önerilmektedir.

1. ImageJ analizinden (adım 9.13) elde edilen ve kaydedilen ilgili *.csv dosyasını elektronik tablo yazılımına aktarın.
   NOT: Her sütun çizgisindeki sayısal değerler, denklem 1 ve denklem 2'ye göre her parçacık için ayrı ayrı hesaplamaları yansıtır.
2. Döngüsellik (CIR) ve en boy oranı (AR) gibi ortalama şekil parametre değerlerini, her sütunun altına = ortalama (x,y) girerek, burada x'in sütunun ilk satırını ve y son satırını temsil ettiği yerde değerlendirin ve ardından Enter tuşuna basın. CIR değerleri, yansıtılan alan ile tek bir parçacığın CIR = 1 (denklem 1) ile mükemmel daire arasındaki ilişkiyi tanımlar. AR, denklem 2 tarafından tanımlanan parçacık uzunluğu / genişliği oranını temsil eder.
3. Ortalama AR'nin 2,5 < belirleyin, ardından denklem 3'ü kullanarak yeni bir sütundaki d_p değerlerini hesaplayın. AR 2.5 ≥, denklem 4'ü yansıtan d_p değerlerini hesaplayın. ImageJ çıktısından alınan alan sütununa göre d_p'yi hesaplamak için yeni bir sütun ekleyin.
   NOT: AR eşik değerlerinin seçimi ≥ 2.5 daha fazla dikdörtgen şekilli parçacığı temsil ederken, AR < 2.5 daha yuvarlak şekilli parçacıkları yansıtır. Bu seçim, mikroskopi ile ölçülen ve ImageJ ile belirlenen alandan türetilen d_p hesaplama hatasını en aza indirmeye izin verir.
   (1)
   (2)
   (3)
   (4)

11. Milletvekilleri ve NP'ler için istatistiksel analiz

1. *.csv veri dosyasını istatistiksel yazılımla birlikte açın > Dosya > 9.13'te oluşturulan ilgili dosyanın dosya konumunu seçin .
   NOT: Alternatif olarak, tablo kopyala-yapıştır özelliği aracılığıyla doğrudan istatistiksel yazılıma aktarılabilir. Sütun adlarıyla Düzenle ve Yapıştır istatistik yazılımının markası ve sürümü için Malzeme Tablosu> na bakın.
2. > Dağılımını Analiz Et'i seçerek d_p verilerini değerlendirin.
3. Sütunun verilerini yansıtan d_p öğesini seçin, Y sütunlarına sürükleyip bırakın ve OK düğmesine basın. Bu özellik, ayrı bir pencerede Özet İstatistikler, Ortalama ve Std Geliştirme değerlerini içeren istatistiksel bir çıktıya sahip bir histogram oluşturur.
4. Sürekli Sığdırma > d p'nin yanındaki üçgeni seçerek histogramın en iyi uyum eğrisine sahip normal bir dağılımı (veya d_p için en uygun olanı) izleyip izlemediğini değerlendirin ve ardından en uygun olarak alınan eğriyi seçin (örneğin, Normal Sığdır). Bu adım, histogramı normal olarak dağıtılmış bir uyumla üst üste bindirir.
5. Ortalama şekil parametresi değerlerinin döngüsellik (Cir), en boy oranı (AR), yuvarlaklık (Yuvarlak) ve sağlamlık (Sol) değerlerinin özet istatistik çıktılarından ortalama ve standart sapma değerlerini belirleyin ve raporlayın.
   NOT: α = 0.05 istatistiksel anlamlılık düzeyi önerilir ve tüm değerlendirmeler için kullanılmıştır. Anlamlılık düzeyi, sayısal sonuçları karşılaştırırken doğru olduğunda sıfır hipotezini reddetme olasılığıdır.

12. d _p boyut dağılımı ve parçacık şekli faktörlerinin en iyi uyumu

1. Veri kümesini istatistiksel yazılıma yükleyin ve adım 10'da hesaplandığı gibi d_p'nin dağıtımı için aynı *.csv veri kümesini kullanın.
2. Yaşam Dağılımı > Güvenilirliğini ve Hayatta Kalma > Analiz Et'i seçin.
3. d_p sütununu Y, Etkinlik Zamanı alanına sürükleyin ve Tamam'ı seçin. Bu özellik, d_p'nin bir fonksiyonu olarak olasılık grafiğine sahip bir çıktı oluşturur.
4. Nonparametrik, Lognormal, Weibull, Loglojistik ve Normal'i işaretleyerek Dağılımları Karşılaştır altında optimum dağılımı belirleyin.
5. Modelin kalitesini, grafiğin altındaki İstatistik Modeli Karşılaştırma Tablosunda en düşük BIC sayılarına göre Akaike ve Bayes bilgi ölçütleri (sırasıyla AIC ve BIC) için en düşük sayısal değerlere göre değerlendirin. En uygun model varsayılan olarak ilk satırda sunulur. Her dağıtım değerlendirmesi için parametrik veya parametrik olmayan tahmin çıktı alanları, Dağılımları Karşılaştır grafiğinin altında bulunur.
6. Save Script > To Data Table (Veri Tablosuna Komut Dosyasını Kaydet) tarafından sol üst köşedeki kırmızı açılır üçgeni seçerek çıktı komut dosyasını veri tablosuna kaydedin. Ardından, Dosya > > *.jmp dosyasını seçerek orijinal Veri Tablosunu istediğiniz dosya konumuna kaydedin.

13. Dinamik ışık saçılması yoluyla NP'lerin boyutsal karakterizasyonu

1. Masaüstü simgesine çift tıklayarak dinamik ışık saçılımı (DLS) yazılımını başlatın. Dosya > Yeni > SÇP'yi seçin. DLS yazılımında Numune Kurulumu altında damıtılmış su için 1,33'e ve polimerler^33'e numune adı ekleyin ve malzeme kırılma indisini seçin. Açılır menüde Malzeme'yi seçin ve Tamam'a tıklayın.
   NOT: Açılır menüye tıklandığında, Kırılma indisini ve Emilimini değiştirerek yeni numuneler eklemeyi veya mevcut numuneleri değiştirmeyi öneren Malzeme Yöneticisi açılır. Dispersan Su olarak seçin.
2. Hücre > Hücre Türü altında uygun hücreyi seçin ve her ölçümden sonra hangi çıktının sunulacağını belirlemek için Raporlar'ı seçin.
3. Cihazın kapağını kapatarak ve kapağı kapatarak (açıksa) ve ON düğmesine basarak sistemi açarak cihazı çalıştırın. İlk bip sesinden sonra bekleyin ve ışının stabilizasyonuna izin vermek için yaklaşık 30 dakika bekleyin.
4. Başlatma rutini tamamlanana kadar bekleyin ve önceden ayarlanmış sıcaklığa (genellikle 25 ° C) ulaşıldığını gösteren ikinci bir bip sesi bekleyin.
5. NP'lerden (adım 7'de alındığı gibi) ve DI suyundan oluşan bir numune bulamacını, iyi karışmasına izin vermek için ~ 1 saat boyunca manyetik olarak karıştırarak ağırlıkça% 0.1 konsantrasyonda ~% 0.1 konsantrasyonda hazırlayın.
6. 4,5 mL kuvars küvete ~1,0 mL aktarmadan önce bulamacı çalkalayın ve kapağı açın. Ardından, numune hücresini DLS cihazının numune tutucusuna dikkatlice yerleştirin.
   NOT: Aynı bulamaç partisinden, adım 13.5'te açıklandığı gibi aynı konsantrasyonda üç numune hazırlayın.
7. Her numune için üç ölçüm (DLS yazılımında seçim) gerçekleştirin. Ölçümler arasında, numune hücresini çıkarın ve numunenin karıştırılmasına izin vermek için numuneleri 5 s boyunca hafifçe sallayın.
8. DLS yazılımı aracılığıyla verileri ayıklayın ve dışa aktarın, veri kümesini elektronik tablo yazılımına aktarın ve 11.1-11.5 adımlarında açıklandığı gibi milletvekilleri ve NP'ler için histogramlar oluşturun (Şekil 1). Kayıt Görünümü Sekmesinden, elektronik tablo yazılımı gibi başka bir uygulamaya yapıştırılabilen Düzenle-kopyala'yı seçerek bir Tablo veya Grafik kopyalayın.

14. Fourier transformasyon kızılötesi (FTIR) spektrometrisi ile zayıflatılmış toplam yansıma (ATR) kullanılarak MNP'lerin kimyasal analizi

NOT: MNP'lerin Fourier transformasyon kızılötesi (FTIR) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopileri ile kimyasal analizleri, ıslak öğütmenin kimyasal bağlanma özellikleri üzerindeki etkisinin yanı sıra ana bileşenlerin ve polimerlerin monomerik bileşenlerinin nispi miktarlarını değerlendirmek için çok uygun araçlardır, sırasıyla¹⁰. Ek olarak, MNP'lerin polimerik bileşenlerinin termal özellikleri ve stabilitesi, sırasıyla diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) ve termogravimetrik analiz (TGA) ile değerlendirilebilir²⁹.

1. Algılama sistemini (ATR kristal yüzeyi) etanol ve tüy bırakmayan bir bezle temizleyin.
2. Yazılımı başlatın ve cihazın ışın yolunu temizleyerek havada bir Arka Plan Taraması gerçekleştirmek için komut çubuğundaki Arka Plan Düğmesine basın. Arka plan spektrumu, koleksiyondan kısa bir süre sonra görüntülenir.
3. Cihaz ayarları araç çubuğuna Örnek Kimliği ve Örnek Açıklaması girin.
4. Spektral dalga sayısını 4000 cm-1 ile 600 cm-1 arasında ayarlayın ve absorbans modunda 2,0 ^cm-1 çözünürlük seçin. Spektrum başına 32 tarama seçin ve başlayın.
5. Kristal yüzeye, iç çapı ~10 mm veya eşdeğeri olan bir çelik yıkayıcının içine plastik bir numune (~20 mg veya ~ 1-3^{mm 3}) MP (106 μm) ve NP'ler (~ 300 nm) yerleştirin.
   NOT: Yıkayıcı, numune tutucu numuneyi sıkıştırdığında kristal üzerinde dağılmayı önler, bu da tutarsız ölçümler nedeniyle malzeme homojensizliklerine ve veri yanlılığına neden olur.
6. Yıkayıcıyı ATR kristalinin ortasına yerleştirin ve polimer numunesini yıkayıcı açıklığının ortasına bir spatula ile ekleyin.
7. Yukarıdaki numune kolunu numunenin merkezine doğru döndürün ve Kuvvet Ölçer kuvvetini 50-90 arasında izleyerek düğmeyi saat yönünde çevirin. Örnek ön spektrumları göstermektedir. Spektrumu toplamak için Tara düğmesine ikinci kez basın.
8. Tara düğmesine tıklayarak 8-10 spektrum arasında toplayın ve temsili sonuçların toplanmasına izin vermek için her ölçümden sonra numuneleri bir spatula ile dikkatlice karıştırın.
9. Görüntüleme alanında üst üste bindirilmiş toplanan tüm örnekleri görüntülemek için Veri Gezgini'ndeki Örnek Görünüm klasörüne tıklayın. İlk olarak, aykırı değerleri temsil eden önemli ölçüde sapan spektrumları kaldırın. Ardından, araç çubuğunda Absorbans veya Transmittance modunu seçin.
10. Spektrumları içeren Örnek Görünüm klasörünü ve dosya menüsünden Farklı Kaydet'i seçerek spektrumları kaydedin. İletişim penceresi dosya adını, hedef dizini ve tüm spektrumlar için varsayılan konum değişikliğini etkinleştirir.
    NOT: Alternatif olarak, spektrumlar bir spektrum seçilerek ve İkili seçeneği görüntülemek için sağ tıklatılarak *.sp dosyası olarak kaydedilebilir. İkili Kaydet'i seçin ve son Kaydet konumuna göz atın.
11. Yazılım aracılığıyla veya bir sonraki adımda menüden İşlem ve Normalleştirme'yi seçerek Veri Gezgini'nde tek bir spektrum seçerek taban çizgisi düzeltmesi >ve ortalama normalleştirme gerçekleştirin.
    NOT: Ortalama normalleştirme, numunedeki kalınlık veya malzeme varyasyonundan kaynaklanan spektral hataları telafi eder.
12. Veri toplama işlemini tamamladıktan sonra kristal alanı etanol ve tüy bırakmayan bezle temizleyin.
13. Milletvekilleri ve NP'ler arasındaki farkları, atanmış FTIR titreşim bantlarına göre yorumlayın, önceki bir yayında atanan ve değerlendirilen¹⁰.

Sonuçlar

Deneysel prosedür yöntemini ve analizini doğrulamak için, milletvekilleri ve NP'ler pelet ve film malzemelerinden oluşturuldu ve mikroskobik görüntüler kullanılarak boyut ve şekle göre karşılaştırıldı. Şekil 1'de açıklanan yöntem, biyolojik olarak parçalanabilen plastik peletlerden ve filmlerden verimli bir şekilde milletvekilleri ve NP'ler oluşturmuştur; bu, kriyojenik soğutma, frezeleme ve ıslak taşlama ve karakterizasyon yoluyla elde edildi. İlk adım, çevres...

Tartışmalar

Bu yöntem, başlangıçta önceki bir yayın^29'da tanımlanan, çevresel çalışmalar için pelet ve malç filmlerinden elde edilen MNP'leri hazırlamak için etkili bir süreci tanımlamaktadır. Boyut küçültme işlemi, model MNP'leri üretmek için kriyojenik soğutma (yalnızca film için), kuru frezeleme ve ıslak taşlama aşamalarını içeriyordu. Bu yöntemi, düşük yoğunluklu polietilen (LDPE), polibütirat adipat-ko-tereftalat (PBAT) ve polilaktik asit (PLA)²⁹

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum dish, 150 mL	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	08-732-103	Drying of collected NPs
Aluminum dish, 500 mL	VWR International, Radnor, PA, USA	25433-018	Collecting NPs after wet-grinding
Centrifuge	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Centrific 228	Container for centrifugation
Delivery tube, #20, 840 µm	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	3383M30	Sieving of the first fraction during milling
Delivery tube, #60, 250 µm	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	3383M45	Sieving of the second fraction (3x)  during milling
Thermomixer,  5350 Mixer	Eppendorf North America, Enfield, CT, USA	05-400-200	Analysis of sieving experiments
FT-IR Spectrum Two, spectrometer with attenuated total reflectance (ATR)	Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	L1050228	Measuring FTIR spectra
Glass beaker, 1000 mL	DWK Life Sciences, Milville, NJ, USA	02-555-113	Stirring of MPs-water slurry before grinding
Glass front plate	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	3383N55	Front cover plaste for Wiley Mini Mill
Glass jar, 50 mL	Uline, Pleasant Prairie, WI, USA	S-15846P	Collective MPs after milling
Glove Box, neoprene	Bel-Art-SP Scienceware, Wayne, NJ, USA	BEL-H500290000	22-Inch, Size 10
Zetasizer Nano ZS 90 size analyzer	Malvern Panalytical, Worcestershire, UK	Zetasizer Nano ZS	Measuring nanoplastics dispersed in DI-water
Microscope camera	Nikon, Tokyo, 108-6290, Japan	Nikon Digital Sight 10	Combined with Olympus microscope to receive digital images
Microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan	Model SZ 61	Imaging of MPs
Nitrogen jar, low form dewar flasks	Cole-Palmer, Vernon Hills, IL, USA	UX-03771-23	Storage of liquid nitrogen during cryogenic cooling
Accurate Blend 200, 12-speed blender	Oster, Boca Raton, FL, USA	6684	Initiating the size reduction of cryogenically treated plastic film
PBAT film, - BioAgri™ (Mater-Bi®)	BioBag Americas, Inc, Dunedin, FL, USA	0.7 mm thick	Feedstock to form MPs and NPs, agricultural mulch film
PBAT pellets	Mobius, LLC, Lenoir City, TN, USA	Diameter 3 mm	Feedstock to form microplastics (MPs) and nanoplastics (NPs) trough milling and grinding
Plastic centrifuge tubes, 50 mL	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	06-443-18	Centrifugation of slurry after wet-grinding
Plastic jar, 1000 mL, pre-cleaned, straight sided	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	05-719-733	Collection of NPs during and after wet grinding
Polygon stir bars, diameterø=8 mm, length=50.8 mm	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	14-512-127	Stirring of MPs slurry prior to wet-grinding
Scissors, titanium bonded	Westcott, Shelton, CT, USA	13901	Cutting of initial PBAT film feedstocks
Square glass cell with square aperture and cap, 12 mm O.D.	Malvern Panalytical, Worcestershire, UK	PCS1115	Measuring of NPs particle size
Stainless steel bottom, 3 inch, pan	Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA	8401	For sieving after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 140 (106 µm)	Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA	1308	For sieving after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 20 (850 µm)	Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA	1296	Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 325 (45 µm)	Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA	1313	Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel sieve, 3 inch, No. 60 (250 µm)	Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA	1303	Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel top cover, 3 inch	Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA	8406	Sieving of MPs after Wiley-milling
Stainless steel tweezers	Global Industrial, Port Washington, NY, USA	T9FB2264892	Transferring of  frozen film particles from jar into blender
Vacuum oven, model 281A	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	13-262-50	Vacuum oven to dry NPs after wet-grinding
Friction grinding machine, Supermass Colloider	Masuko Sangyo, Tokyo, Japan	MKCA6-2J	Grinding machine to form NPs from MPs
Wet-grinding stone, grit size: 297 μm -420 μm	Masuko Sangyo, Tokyo, Japan	MKE6-46DD	Grinding stone to form NPs from MPs
Wiley Mini Mill, rotary cutting mill	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	NC1346618	Size reduction of pellets and film into MPs and NPs
Software
FTIR-Spectroscopy software	Perkin Elmer, Waltham, MA, USA	Spectrum 10	Collection of spectra from the initial plastic, MPs and NPs
Image J, image processing program	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	Version 1.53n	Analysis of digital images received from microscopy
Microscope software, ds-fi1 software	Malvern Panalytical , Malvern, UK	Firmware DS-U1 Ver3.10	Recording of digital images
Microsoft, Windows,  Excel 365, spreadsheet software	Microsoft, Redmond, WA, USA	Office 365	Calculating the average particle size and creating FTIR spectra images
JMP software, statistical software	SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2021	Version 15	Statistical analysis of particle size and perform best fit of data set
Unscrambler software	Camo Analytics, Oslo, Norway	Version 9.2	Normalizing and converting FTIR spectra into .csv fromat