Bal Arısı Dokusunda Histolojinin Temelleri ve Hücre Ölümü Tespiti

Özet

İmmünohistokimyasal yöntemler, yetişkin arıların midgut ve hipofaringeal bezlerindeki apoptoz ve nekroz seviyesini tespit etmek ve değerlendirmek için bal arısı araştırmalarında yararlıdır.

Özet

Kovanın içindeki (hemşire işçiler ve diğer kovan arıları) ve kovanın dışındaki bal arıları (Apis mellifera L.) (toplayıcılar), iklim ve hava değişikliklerine, çeşitli pestisitlere, patojenlere ve yetersiz beslenmeye maruz kalmaktadır, esas olarak ağızdan girmekte ve öncelikle yetişkin arıların sindirim yollarını etkilemektedir. Bu tür dış ve iç stresörlerin bal arıları üzerindeki etkilerini anlamak ve önlemek için, yararlı bir araştırma yöntemi immünohistokimyasal yöntemdir. Histolojik analiz için yetişkin arıların midgut (ventrikül) ve hipofaringeal bezlerini (HPG'ler) hazırlamak için temel bir protokol tanımlanmıştır. Hücre hasarının seviyesini değerlendirmek ve nekrozu doğal bir doku rejenerasyonu süreci olarak programlanmış hücre ölümünden (apoptoz) ayırt etmek için ayrıntılı bir metodoloji açıklanmaktadır. Oksalik asit ve pestisitler (insektisit ve akarisit) ile erişkin bal arısı tedavisinin sonuçları ve ventriküls ve HPG'lerde hücre ölümünün belirlenmesi sunulmaktadır. Metodolojinin artıları ve eksileri de tartışılmaktadır.

Giriş

Bal arıları (Apis mellifera L.), diğer vahşi tozlayıcıların yanı sıra, tarımsal bitkilerin en önemli tozlayıcılarıdır. Binlerce yıl boyunca, değişen çevre arıların morfolojilerini, fizyolojilerini, davranışlarını ve toleranslarını çeşitli patojenlere ve parazitlere uyarlamalarını etkilemiştir. Bu nedenle, bal arıları dünya çapında çok çeşitli türler ve alt türler geliştirmiştir¹. Bu sonuçlar, bal arısının sindirim sistemi yapısında genetik çeşitlilik olduğu yönündeki önceki bulgularla tutarlıdır, ancak aynı zamanda midgut değişikliklerinin çevresel faktörlerden kaynaklandığını düşündürmektedir ^2,3.

Bal arısının sindirim sistemi üç ana bölüme sahiptir: foregut, midgut (ventriculus) ve hindgut⁴. Ventrikül, polen ve nektar/balın sindirimi için gerekli bir organdır; hindgutta, ozmotik kontrol suyun ve iyonların emilimi yoluyla gerçekleşir². Bal arısı işçilerinin hipofaringeal bezleri (HPG'ler) kafada bulunur ve yavruyu, kraliçeyi ve koloninin üyelerini beslemek için arı sütü bileşenlerini sentezler ve salgılar. Büyüklükleri yaş ve görevlerle birlikte değişir ve doğru beslenmeye (kaliteli polen) bağlıdır. 6 ila 18 günlük hemşire işçiler yavru yetiştiriciliği gerçekleştirir ve HPG'lerin boyutu ^5,6 artar. Toplayıcı arılarda, HPG'ler dejenere olur ve sadece karmaşık şekerleri balda basit olanlara (α-glukozidazlar, lösin arylamidaz, invertaz) dönüştürmek için önemli olan enzimleri salgılar⁷.

Bal arıları çeşitli biyotik ve abiyotik stresörlere maruz kalır⁸ ve sindirim sistemi birkaç olumsuz uyarıcıdan etkilenebilir. Organizmayı patojenlerden koruyan ilk bariyer, patojenlere karşı korunmak için bağırsak mukozasından oluşan midguttaki peritrofik zardır⁴. HPG'lerin gelişimi ve işlevi diyete, yaşa ve koloni durumuna bağlıdır⁹ ve insektisitler, akarisitler¹⁰ ve patojenler ^11,12,13'ten etkilenir. Varroa kontrol tedavisine bağlı kovanda bulunan akarisit kalıntıları ve çevreden gelen pestisitler toplayıcı arıları ve hemşire arıları etkilemektedir^14,15. Bal arısı kolonileri için en büyük tehdit, hem koloni kayıplarına katkıda bulunan virüslerin bir vektörü olarak¹⁶ hem de konakçının yağ vücudunun (bal arılarında önemli bir hayati organ) tüketicisi olarak akar Varroa yıkıcısıdır, bu da sonuçta bireyin vücudunu ve koloni işlevlerini etkiler¹⁷.

Bununla birlikte, yoğun tarım arazisi habitatları, bal arıları için kısa vadeli bir gıda kaynağı sağlayabilir. Bu nedenle, tarım-çevre planları, bal çiçeklerinin tarımsal arazilerde kullanılabilirliğini arttırmalıdır¹⁸. Farklı alt türlerin morfolojisini değerlendirmek için 6,19,20,21 veya bu faktörlerin hücre veya doku seviyelerinde, özellikle midgut ve HPG'lerde subletal etkilerini^, histolojik ve immünohistokimyasal yöntemler bal arılarında histoloji araştırmalarında kullanılmak üzere pratik ve yeterince doğrudur.

Protokol

1. Bal arısı araştırmaları için temel histoloji

1. Balarısı dokusunun diseksiyonu
   NOT: İşçi arıların diseksiyonu için, LED ışık kaynağı olan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. En kullanışlı büyütme ~ 20x'tir.
   1. Manipülasyon ve diseksiyon
      1. Forsepsli bir işçi arıyı dikkatlice alın ve 22 dakika boyunca buza (veya -20 ° C'de dondurucuya) koyun ve 22 dakika boyunca hareketsiz^{hale getirin}. Arısı, Petri kabının üzerine, göğüs kafesinin en üst arka kısmından çapraz olarak, soldan sağa ve sağdan sola iki kez sabitleyin.
      2. Vücudu örtmek için böcek salini dökün. Petri kabını mikroskop altına yerleştirin, odaklanın ve ayarlayın.
      3. Aletleri hazırlayın ( bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Midgut diseksiyonu
      1. Arı vücudunun sağ tarafının ortasındaki tergit A5'in (Şekil 1) altına makasın bir noktasını sokarak karın ile başlayın. Tergite A2'ye kesin.
      2. İç organlara zarar vermemek için makasın iç bıçağını vücudun yan tarafına paralel tutun. Makası sola çevirin ve bir kesim yapın; sağa dönün ve başka bir kesim yapın. Karnın sol kısmını yavaşça açın ve sabitleyin. Diğer tarafta tekrarlayın.
      3. Bir elinizle forseps kullanarak, bal arısı midesini yavaşça yukarı doğru çekin ve diğer yandan makasla yemek borusunun en sonunda kesin. Mideyi ve midgutu karından uzaklaştırın ve rektumda kesin. Böcek salin çözeltisi içeren bir pipet kullanın ve dışkıyı veya dokunun parçalarını çıkarın.
   3. HPG'lerin diseksiyonu
      1. Bir işçi arıyı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi buz üzerinde hareketsiz hale getirin. Kafayı kesin ve antenler yukarı bakacak şekilde daha küçük plakaya yerleştirin. Kafayı iki pimle sabitleyin: biri sol bileşik gözden, ikincisi sağ bileşik gözden.
      2. Pimlerin iç tarafındaki ilk bileşik göz boyunca bir kesim yapın, labruma devam edin ve ardından ikinci bileşik göz boyunca diğer tarafta başka bir kesim yapın (Şekil 2).
      3. Antenleri kesin. Maskeyi çıkarın ve hala takılı olan yerde kesin. Forsepsleri alın ve bezleri beyin ve bileşik gözlerin bir kısmı ile birlikte dikkatlice çıkarın.
2. Fiksasyon, dehidrasyon ve parafin gömme
   NOT: Koruyucu eldiven giyin.
   1. Dokuyu penisilin şişelerine yerleştirin,% 10 formalin ile 3/4 doldurun. 4 °C'de buzdolabında saklayın.
   2. 24 saat sonra, dokuyu bir dizi alkolde kurutun:% 70,% 80,% 90,% 100, her biri 1 saat için,% 100 2-propanol, 12 saat boyunca% 100 2-propanol ve son olarak 1 saat boyunca% 100 2-propanol.
   3. Dokuyu histokasetlere yerleştirin; işaretleyin ve 24 saat boyunca 60 ° C'de bir inkübatörde 2-propanol ve parafin (1: 1) ile cam odalara yerleştirin.
   4. Histokasetleri 24 saat daha parafin (I.) içeren başka bir odaya taşıyın. Prosedürü her ikisi de 24 saat boyunca taze parafin ile iki kez daha tekrarlayın (II. ve III.).
   5. Son olarak, montaj istasyonunu hazırlayın ve dokuyu balmumu içine gömmeye başlayın.
      1. Her histokaseti açın ve kapağı çıkarın. Kalıbı balmumu ile doldurun ve kalıbın ortasına ılık forseps içeren dokuyu dikkatlice yerleştirin.
      2. Histokaseti kalıba yerleştirin ve hafifçe balmumu ile örtün. Kalıbı derhal montaj istasyonunun soğuk yüzeyine birkaç saniye yerleştirin, ardından balmumu sertleşene ve kalıptan ve histokasetten ayrılana kadar birkaç dakika soğuk plakaya yerleştirin.
   6. Bitmiş numuneleri toz ve ısıdan uzak bir kutuda saklayın.
   7. Bir mikrotom üzerinde 4 μm ince kesitler kesin: ilk önce birbirine bağlı iki bölüm ve sonra ayrı ayrı bir bölüm. Bölümleri forseps ile aktarın ve damıtılmış su (42 ° C) üzerinde yüzmelerine izin verin, ardından iki bölümü objektif camın sol tarafına ve üçüncüsünü sağ tarafa yerleştirerek temiz slaytlarda toplayın, belirgin bir şekilde ayrı kalın. İşaretli slaytları gece boyunca ısıtma cihazında bırakın ve son olarak histoloji örnekleri için ayrılmış bir kutuda saklayın.
3. Mum giderme ve rehidrasyon
   NOT: Koruyucu eldiven giyin.
   1. Dokuz Coplin kavanozu hazırlayın ve bölümleri her biri 5 dakika boyunca bir dizi temizleme maddesine (I., II., III.) koyun.
   2. 2-propanol,% 96 etanol (I., II.), alkol% 90 ve% 80 ve her biri 3 dakika damıtılmış suya koyun.
4. Hematoksilin ve eozin ile boyama
   NOT: Koruyucu eldiven giyin.
   1. Altı Coplin kavanoz hazırlayın.
   2. Hematoksilin ve eozin (H & E) boyama için, mumdan arındırılmış, rehidre edilmiş bölümleri 5 dakika boyunca hematoksilin içine koyun, ardından 2 dakika boyunca akan musluk suyunun altına dikkatlice yerleştirin. Daha sonra bunları 1 dakika boyunca damıtılmış suya ve 4 dakika boyunca eozine koyun (eozin için Coplin kavanozu gerekli değildir).
   3. Slaytları 1 dakika boyunca% 96 etanol, daha sonra 2 dakika boyunca 2-propanol ve son olarak 2 dakika boyunca temizleme maddesine yerleştirin.
   4. Montaj ortamı ve bir kapak camı ekleyin ve kurumasını bekleyin. Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

Resim 1: Bal arısı gövdesinin dorsal görünümü. A1-A7 tergitleri. Bal arısı diseksiyonu ile ilgili ayrıntılı talimatlar Carreck ve ^ark.24'te bulunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: HPG'lerin dorsal görünümü, beyne bağlı bileşik gözlerin parçaları (görünmez). 5 ila 6 günlük genç bir işçi arı, dolgun ve kremsi beyaz HPG'lere sahiptir. Acini beyinde bulunur ve baş bölgesini beynin arkasına ulaşan dallarla doldurur. Yiyecek arayan arılarda, bu bezler büyük ölçüde küçülür ve sadece ince iplik benzeri kalıntılar bırakır. Bu nedenle, dokuyu kaybetmemek için daha sonraki prosedürlerde daha kolay hale getirmek için bezleri beyinle birlikte çıkarmak daha iyidir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Doku kesitlerinde hücre ölümünün tespiti

1. Apoptoz tespit kiti (Tahlil A)
   NOT: Üreticinin protokolünü izleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Coplin kavanozlarını hazırlayın.
   2. Mumdan arındırma ve rehidrasyondan sonra (bkz. adım 1.3), slaytları% 0.85 NaCl çözeltisine ve ardından fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın (5 dakika).
   3. Slaytları% 4 paraformaldehit 2 x 15 dakika içine koyun.
   4. Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve 100 μL bir Proteinaz K (20 μg / mL) çözeltisi ekleyin, ardından 10-30 dakika bekletin.
   5. Slaytları PBS'ye yerleştirin (5 dk).
   6. Slaytları PBS'de% 4 paraformaldehit içine yerleştirin (5 dk).
   7. Slaytları PBS'ye daldırın (2 x 5 dakika).
   8. Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin, 100 μL denge tamponu ekleyin ve 5-10 dakika bekletin.
   9. 100 μL TdT reaksiyon karışımı ekleyin. Kağıt havluları kabın içine, slaytların etrafına koyun, havluları suyla nemlendirin ve ardından plastik ambalajla örtün. Slaytları 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
   10. Slaytları tekrar boyama rafına yerleştirin ve 15 dakika boyunca 2x salin-sodyum sitrat (SSC) içine daldırın.
   11. Slaytları 3 x 5 dakika PBS'ye, daha sonra% 0.3 hidrojen peroksitte 3-5 dakika ve sonra tekrar PBS'ye 3 x 5 dakika batırın.
   12. Yine, slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin, 100 μL Streptavidin HRP (yaban turpu peroksidaz) ekleyin ve 30 dakika bekletin (plastik ambalajla örtün).
   13. Slaytları PBS'ye 3 x 5 dakika daldırın.
   14. Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve 100 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi ekleyin. Açık kahverengi bir arka plan arayın.
   15. Slaytları rafa geri koyun ve birkaç kez suda yıkayın (çift damıtılmış).
   16. Kızakları cam kapakların altına monte edin, montaj ortamında kaymaları ve kurumaya bırakın.
   17. Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
2. Apoptoz tespit kiti (Tahlil B)
   NOT: Üreticinin protokolünü izleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Coplin kavanozları hazırlayın.
   2. Proteinaz K (PBS'de seyreltilmiş 20 μg / mL) hazırlayın.
   3. Bölümleri mumdan arındırdıktan ve yeniden sulandırdıktan sonra (adım 1.3), slaytları 5 dakika boyunca PBS'ye yerleştirin.
   4. Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve Proteinaz K (20 μg / mL, 5 cm² numune başına 60 μL) ekleyin.
   5. Slaytları 2 x 2 dakika damıtılmış suda yıkayın.
   6. Oda sıcaklığında endojen peroksidaz (% 3 hidrojen peroksidaz) içinde söndürün.
   7. Slaytları PBS veya su ile 2 x 5 dakika durulayın.
   8. Kızakları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 s boyunca denge tamponu (75 μL / 5^cm2) uygulayın.
   9. Mendilin etrafını dikkatlice silin.
   10. TdT enzimini (terminal deoksinükleotidil transferaz) her bölüme ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. Kağıt havluları tepsinin içine, slaytların etrafına koyun, havluları suyla nemlendirin ve plastik ambalajla örtün.
   11. Kuluçkadan sonra, numuneleri rafa koyun ve durdurma / yıkama tamponunda bırakın (10 dakika).
   12. Anti-digoxigenin konjugatını oda sıcaklığına ısıtın.
   13. Slaytları PBS ile yıkayın (3 x 1 dakika).
   14. Dokunun etrafını dikkatlice silin.
   15. Bölümlere iki damla Anti-Digoxigenin-Peroksidaz konjugatı (65 μL / 5 cm²) ekleyin ve nemlendirilmiş bir kapta 30 dakika boyunca inkübe edin.
   16. PBS 4 x 2 dakika içinde yıkadıktan sonra, çalışma mukavemetli peroksidaz substratını hazırlayın ve fazla sıvıya hafifçe dokunun ve bölümün etrafına aspirasyon yapın.
   17. Bölümleri peroksidaz substratı (75 μL/5 cm²) ile örtün ve 5 dakika boyunca lekeleyin. Mikroskop altına bir slayt yerleştirin ve en uygun boyama süresini belirleyin.
   18. Slaytları bir boyama rafında damıtılmış suda (3 x 1 dakika) yıkayın.
   19. Slaytları 5 dakika boyunca damıtılmış suda inkübe edin.
   20. 2 dakika boyunca hematoksilin kullanarak karşı boyama.
   21. Kaydırağı 3 dakika boyunca akan musluk suyunun altına yerleştirin.
   22. Slaytı damıtılmış suda yıkayın.
   23. Kızakları cam kapakların altına monte edin, montaj ortamında kaymaları ve kurumaya bırakın.
   24. Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
3. Apoptoz tespit kiti (Tahlil C)
   NOT: Üreticinin protokolünü izleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Coplin kavanozlarını hazırlayın.
   2. Doku bölümlerini balmumundan arındırın ve yeniden sulandırın (bkz. adım 1.3).
   3. Dokuyu Proteinaz K ile inkübe edin (37 ° C'de 15-30 dakika).
   4. Slaytları tekrar rafa yerleştirin ve PBS'de 2 kat durulayın.
   5. 50 μL 'TUNEL reaksiyon karışımı' ile örtün. Islak kağıt havluları kabın içine yerleştirin, plastik ambalajla örtün ve 37 ° C'de 60 dakika bekletin.
   6. PBS ile 3 kat durulayın.
   7. Slaytları kaba yerleştirin ve doku örneğinin etrafındaki alanı kurutun.
   8. Numuneye 50 μL Converter-AP ekleyin ve nemlendirilmiş bir kapta 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
   9. PBS'de 3 kat durulayın.
   10. 50-100 μL substrat çözeltisi ekleyin ve karanlıkta 10 dakika bekletin.
       NOT: Boyama işlemini ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
   11. Slaytları PBS ile 3 kat durulayın.
   12. Kesitleri 2 dakika boyunca hematoksiline aktararak karşı leke yapın ve ardından 5 dakika boyunca akan musluk suyunda dikkatlice durulayın.
   13. Kızakları cam kapakların altına monte edinSulu bir montaj ortamında kaymaları ve kuruması için düz bırakın.
   14. Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Etkilenen (pozitif) hücreleri, midgut veya HPG'lerin her bir örneğinde ışık mikroskobu altında 70 ila 100 hücre sayarak değerlendirin.

Sonuçlar

Midgutta hücre ölümü tespiti
Ljubljana'daki Slovenya Tarım Enstitüsü'ndeki deneysel arı kovanından yeni ortaya çıkan işçi arılar (Apis mellifera carnica), bireysel olarak% 3 oksalik asit (OA) ²³ ile muamele edildi. OA, arıcılıkta Varroa yıkıcı kontrolü için sıklıkla kullanılır. Tedaviden sonra, işçi arılar (her gruptan üç) buz üzerinde hareketsiz hale getirildi. Midgut diseke edildi ve% 10 formalin ile sabitlendi. Doku daha sonr...

Tartışmalar

Canlı organizmalarda, hücre ölümü apoptoz veya nekroz²⁵ olarak tanımlanır ve otofaji²⁶ eşlik edebilir. Apoptotik ve nekrotik hücreler arasındaki fark, apoptozun programlanmış hücre ölümünün bir şekli olması ve normal hücrelerde ortaya çıkması, nekrozun ise ölümcül koşullar (örneğin, kaza, hastalık) nedeniyle ortaya ^{çıkmasıdır27,28}. Apoptoz, TUNEL tekniğine dayanan tahlil kitleri ku...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101
Covers
DeadEnd Colorimetric TUNEL system	Promega	G7360	Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Dissecting microscope  (for bee dissection)	Zeiss
Distilled water
Embedding cassette
EnVision System alkaline phosphatase kit	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		alcoholic
Ethanol			95% (or less pure), 90%, 80%
Faramount mounting medium, aqueous	Dako		mounting medium
Flattening table	Leica	HI1220
Forceps  (for bee dissection)	Fine science tools	11294-00	Standard #4
Formalin 10%			Formaldehyde
Hematoxylin	Sigma-Aldrich
HistoChoice Clearing Agent	Sigma-Aldrich		clearing agent
Hydrogen peroxidase 3%
Incubator	BioRad
Insect pins  (for bee dissection)	Entosphinx	44594	Insect pins stainless steel – white, size 2
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Light microscope	Leica
Microscope slides			Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust
Microtome	Leica
Modular tissue embedding station	Leica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast	Leica
Pasteur pipettes			1.5 mL; 3 mL
PBS
Petri dish  (for bee dissection)			Filled with condensation silicon  (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)
Proteinase K	Merck	21627
Ringers' solution  (for bee dissection)			7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water
Scissors  (for bee dissection)	Fine science tools	1406-09, 14061-09	Straight and curved, 9 cm
Universal liquid plus activator  (for bee dissection)	Kulzer
Watchmaker’s forceps (for bee dissection)	Fine science tools	91100-12
Water bath	Leica
Watercolor brush			2x
Xantoprene L blue  (for bee dissection)	Kulzer