Основы гистологии и обнаружение гибели клеток в ткани медоносных пчел

Резюме

Иммуногистохимические методы полезны в исследованиях медоносных пчел для выявления и оценки уровня апоптоза и некроза в средней кишке и гипофарингеальных железах взрослых пчел.

Аннотация

Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) внутри улья (медсестры и другие пчелы-ульи) и вне улья (фуражиры) подвергаются воздействию изменений климата и погоды, различных пестицидов, патогенов и недоедания, в основном попадая через рот и в первую очередь поражая пищеварительный тракт взрослых пчел. Чтобы понять и предотвратить воздействие таких внешних и внутренних стрессоров на медоносных пчел, одним из полезных методов исследования является иммуногистохимический метод. Описан базовый протокол подготовки средней кишки (желудочковой) и гипофарингеальной желез (ГПГ) взрослых пчел к гистологическому анализу. Описана подробная методика оценки уровня повреждения клеток и отличия некроза от запрограммированной гибели клеток (апоптоза) как естественного процесса регенерации тканей. Представлены результаты обработки взрослых медоносных пчел щавелевой кислотой и пестицидами (инсектицидами и акарицидами) и определения гибели клеток в желудочках и ГПГ. Также обсуждаются плюсы и минусы методики.

Введение

Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) являются, среди других диких опылителей, наиболее важными опылителями сельскохозяйственных растений. На протяжении тысячелетий изменяющаяся окружающая среда влияла на пчел, чтобы адаптировать их морфологию, физиологию, поведение и толерантность к нескольким патогенам и паразитам. Поэтому медоносные пчелы развили очень разнообразный диапазон видов и подвидов по всему земному шару¹. Эти результаты согласуются с предыдущими выводами о том, что существует генетическая вариация в структуре пищеварительного тракта медоносной пчелы, но также предполагают, что изменения средней кишки обусловлены факторами окружающей среды ^2,3.

Пищеварительный тракт медоносной пчелы состоит из трех основных частей: передней кишки, средней кишки (ventriculus) и задней кишки⁴. Желудочек является важным органом для переваривания пыльцы и нектара/меда; в задней кишке осмотический контроль происходит путем поглощения воды и ионов². Гипофарингеальные железы (HPG) работников медоносных пчел расположены в голове и синтезируют и выделяют компоненты маточного молочка для питания расплода, матки и членов колонии. Их размер меняется с возрастом и задачами и зависит от правильного питания (качественная пыльца). Работники медсестер в возрасте от 6 до 18 дней занимаются выращиванием расплода, а размер HPG увеличивается на ^5,6. У пчел-фуражиров HPG дегенерируют и выделяют только ферменты, которые важны для превращения сложных сахаров в простые (α-глюкозидазы, лейцинариламидазы, инвертазы) в^{меде 7}.

Медоносные пчелы подвергаются воздействию нескольких биотических и абиотических стрессоров⁸, а на пищеварительный тракт могут влиять несколько негативных стимуляторов. Первым барьером, защищающим организм от болезнетворных микроорганизмов, является перитрофическая мембрана в средней кишке, которая состоит из слизистой оболочки кишечника для защиты от болезнетворных микроорганизмов⁴. Развитие и функция HPG зависят от диеты, возраста и состояния колонии⁹ и подвержены влиянию инсектицидов, акарицидов¹⁰ и патогенов 11,12,13. Остатки акарицидов в улье из-за контрольной обработки варроа и пестицидов из окружающей среды влияют на пчел-фуражиров и^{пчел-кормилиц 14,15}. Наибольшую угрозу для колоний медоносных пчел представляет клещ Варроа-деструктор, как переносчик вирусов, способствующих потерям колоний¹⁶, так и как потребитель жирового тела хозяина (важный жизненно важный орган у медоносных пчел), который, следовательно, влияет на организм человека и функции колонии¹⁷.

Тем не менее, интенсивные места обитания сельскохозяйственных угодий могут обеспечить краткосрочное снабжение продовольствием для медоносных пчел. Поэтому агроэкологические схемы должны повысить доступность медоносных цветов в сельскохозяйственных ландшафтах¹⁸. Для оценки морфологии различных подвидов ^6,19,20,21 или сублетальных эффектов этих факторов на клеточном или тканевом уровнях, особенно средней кишки и HPG, гистологические и иммуногистохимические методы являются практичными и достаточно точными для использования в гистологических исследованиях у медоносных пчел.

протокол

1. Базовая гистология для исследования медоносных пчел

1. Рассечение ткани медоносной пчелы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для вскрытия рабочих пчел используйте рассекающий микроскоп со светодиодным источником света. Наиболее полезное увеличение ~ 20x.
   1. Манипуляции и рассечение
      1. Осторожно возьмите рабочую пчелу с щипцами и положите ее на лед (или в морозильную камеру при -20 °C) на 2 мин, чтобы обездвижить ее²². Прикрепите пчелу к чашке Петри по диагонали через самую верхнюю заднюю часть грудной клетки дважды, слева направо и справа налево.
      2. Налейте физиологический раствор для насекомых, чтобы покрыть тело. Поместите чашку Петри под микроскоп, сфокусируйте и отрегулируйте.
      3. Подготовьте инструменты (см. Таблицу материалов).
   2. Рассечение средней кишки
      1. Начните с живота, вставив одну точку ножниц под тергит А5 (рисунок 1) в центр правой стороны тела пчелы. Вырезать до тергита А2.
      2. Держите внутреннее лезвие ножниц параллельно боковой части тела, чтобы избежать повреждения внутренних органов. Поверните ножницы влево и сделайте один разрез; поверните направо и сделайте еще один разрез. Аккуратно откройте левую часть живота и приколите ее. Повторите с другой стороны.
      3. С помощью щипцов одной рукой аккуратно потяните желудок медоносной пчелы вверх, а ножницами в другой руке срежьте в самом конце пищевода. Оттяните живот и среднюю кишку от живота и срежьте прямую кишку. Используйте пипетку с солевым раствором насекомых и удалите любые калы или части ткани.
   3. Рассечение ХПГ
      1. Обездвижите рабочую пчелу на льду, как описано в шаге 1.1.1. Отрежьте голову и поместите ее на меньшую пластину с антеннами, обращенными вверх. Закрепите голову двумя штифтами: один через левый составной глаз, а второй через правый составной глаз.
      2. Сделайте разрез поперек первого составного глаза на внутренней стороне штифтов, продолжайте движение к лабруму, а затем сделайте еще один разрез на другой стороне через второй составной глаз (рисунок 2).
      3. Отрежьте усики. Снимите маску и срежьте там, где еще прикреплены. Возьмите щипцы и аккуратно удалите железы вместе с мозгом и частью сложных глаз.
2. Фиксация, обезвоживание и встраивание парафина
   ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитные перчатки.
   1. Поместите ткань во флаконы с пенициллином, наполненные на 3/4 10% формалином. Хранить в холодильнике при температуре 4 °C.
   2. Через 24 ч обезвоживают ткани в серии спиртов: 70%, 80%, 90%, 100%, по 1 ч каждый, 100% 2-пропанол в течение 1 ч, 100% 2-пропанол в течение 12 ч и, наконец, 100% 2-пропанол в течение 1 ч.
   3. Поместите ткань в гистокассеты; разметить и поместить их в стеклянные камеры с 2-пропанолом и парафином (1:1) в инкубатор при 60 °C в течение 24 ч.
   4. Переместите гистокассетты в другую камеру с парафином (I.) еще на 24 ч. Повторяют процедуру со свежим парафином еще дважды (II. и III.), оба в течение 24 ч.
   5. Наконец, подготовьте монтажную станцию и начните встраивать ткань в воск.
      1. Откройте каждый гистокассет и снимите крышку. Заполните форму воском и аккуратно положите ткань теплыми щипцами в середину формы.
      2. Поместите гистокассет на форму и слегка накройте ее воском. Немедленно поместите форму на холодную поверхность монтажной станции на несколько секунд, затем поместите ее на холодную пластину на несколько минут, пока воск не затвердеет и не отделится от формы вместе и гистокассетта.
   6. Храните готовые образцы в коробке, вдали от пыли и тепла.
   7. Нарежьте тонкие участки по 4 мкм на микротоме: сначала две секции, прикрепленные друг к другу, а затем один отдельно. Переложите секции щипцами и дайте им плавать на дистиллированной воде (42 ° C), затем соберите их на чистых горках, поместив две секции вместе на левой стороне объективного стекла и третью на правой стороне, оставаясь отчетливо отдельными. Оставьте отмеченные слайды на ночь на нагревательном устройстве и, наконец, храните их в коробке, предназначенной для гистологических образцов.
3. Депарафинизация и регидратация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитные перчатки.
   1. Подготовьте девять банок Коплина и поместите секции в серию очищающих агентов (I., II., III.) на 5 мин каждая.
   2. Вводят в 2-пропанол, этанол 96% (I., II.), спирт 90% и 80%, дистиллированную воду на 3 мин каждый.
4. Окрашивание гематоксилином и эозином
   ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитные перчатки.
   1. Приготовьте шесть банок Коплина.
   2. Для окрашивания гематоксилина и эозина (H&E) поместите депарафинизированные, регидратированные срезы в гематоксилин на 5 мин, затем аккуратно поместите их под проточную водопроводную воду на 2 мин. Затем поместите их в дистиллированную воду на 1 мин и эозин на 4 мин (для эозина банка Коплина не нужна).
   3. Поместите слайды в этанол 96% в течение 1 мин, затем 2-пропанол в течение 2 мин и, наконец, в очищающее средство на 2 мин.
   4. Добавьте монтажную среду и защитное стекло и дайте им высохнуть. Наблюдайте под световым микроскопом.

Рисунок 1: Дорсальный вид тела медоносной пчелы. Тергиты А1-А7. Подробные инструкции по рассечению медоносных пчел можно найти в Carreck et ^al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Дорсальный вид HPG, частей сложных глаз, прикрепленных к мозгу (не видимых). Молодая рабочая пчела в возрасте от 5 до 6 дней имеет пухлые и кремово-белые HPG. Ацины расположены на головном мозге и заполняют область головы ветвями, достигающими задней части мозга. У пчел-кормильцев эти железы сильно сморщиваются и оставляют только тонкие нитевидные остатки. По этой причине лучше удалять железы вместе с мозгом, чтобы облегчить дальнейшие процедуры, чтобы избежать потери ткани. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Обнаружение гибели клеток в срезах тканей

1. Комплект для обнаружения апоптоза (Анализ А)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов).
   1. Приготовьте банки Коплина.
   2. После депарафинизации и регидратации (см. этап 1.3) погружают слайды в 0,85% раствор NaCl, а затем в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (5 мин).
   3. Поместите слайды в 4% параформальдегида 2 х 15 мин.
   4. Поместите слайды в емкость и добавьте 100 мкл раствора протеиназы К (20 мкг/мл), затем оставьте их на 10-30 мин.
   5. Поместите слайды в PBS (5 мин).
   6. Поместите слайды в 4% параформальдегид в PBS (5 мин).
   7. Погрузите слайды в PBS (2 x 5 мин).
   8. Поместите слайды в контейнер, добавьте 100 мкл буфера равновесия и оставьте их на 5-10 минут.
   9. Добавьте 100 мкл реакционной смеси TdT. Положите бумажные полотенца внутрь контейнера, вокруг горок, смочите полотенца водой, а затем накройте полиэтиленовой пленкой. Инкубировать горки в течение 60 мин при 37 °C.
   10. Поместите слайды обратно в стойку для окрашивания и погрузите в 2x физиологический раствор цитрат натрия (SSC) на 15 минут.
   11. Погружают слайды 3 х 5 мин в ПБС, затем в 0,3% перекиси водорода в течение 3-5 мин, а затем в ПБС снова, 3 х 5 мин.
   12. Снова поместите слайды в контейнер, добавьте 100 мкл Стрептавидина HRP (пероксидазы хрена) и оставьте на 30 минут (накройте полиэтиленовой пленкой).
   13. Погрузите слайды за 3 x 5 минут в PBS.
   14. Поместите слайды в контейнер и добавьте 100 мкл раствора 3,3'-диаминобензидина (DAB). Обратите внимание на светло-коричневый фон.
   15. Верните горки в стойку и несколько раз вымойте их в воде (двойной дистилляции).
   16. Установите горки под стеклянные крышки в монтажную среду и оставьте плоскими для высыхания.
   17. Наблюдайте под световым микроскопом.
2. Комплект для обнаружения апоптоза (Анализ B)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов).
   1. Приготовьте банки Коплина.
   2. Готовят протеиназу К (20 мкг/мл, разведенную в PBS).
   3. После депарафинизации и регидратации секций (шаг 1.3) поместите слайды в PBS на 5 минут.
   4. Поместите слайды в контейнер и добавьте протеиназу K (20 мкг/мл, 60 мкл на образец размером 5 см²).
   5. Промойте горки 2 х 2 мин в дистиллированной воде.
   6. Закалка в эндогенной пероксидазе (в 3% водородной пероксидазе) при комнатной температуре.
   7. Промойте горки 2 x 5 минут PBS или водой.
   8. Поместите слайды в контейнер и нанесите буфер равновесия (75 мкл/5^см2) на 10 с при комнатной температуре.
   9. Тщательно протрите вокруг ткани.
   10. Добавляют фермент TdT (концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу) к каждому участку и инкубируют в увлажненной камере в течение 1 ч при 37 °C. Положите бумажные полотенца внутрь лотка, вокруг горок, смочите полотенца водой и накройте их полиэтиленовой пленкой.
   11. После инкубации поместите образцы в стойку и оставьте их в буфере остановки/промывки (10 мин).
   12. Нагрейте анти-дигоксигенин, конъюгированный до комнатной температуры.
   13. Мойте слайды в PBS (3 x 1 мин).
   14. Тщательно вытрите вокруг ткани.
   15. Добавьте две капли конъюгата Анти-Дигоксигенин-Пероксидаза (65 мкл/5 см²) в секции и инкубируйте в течение 30 мин в увлажненном контейнере.
   16. После промывки в PBS 4 x 2 мин, подготовьте подложку из пероксидазы рабочей силы и аккуратно отсоедините лишнюю жидкость и аспират по всему участку.
   17. Накройте участки пероксидазной подложкой (75 мкл/5 см²) и окрашиванием в течение 5 мин. Поместите слайд под микроскоп и определите оптимальное время окрашивания.
   18. Помойте горки в окрашивающей стойке в дистиллированной воде (3 х 1 мин).
   19. Инкубировать горки в дистиллированной воде в течение 5 мин.
   20. Противодействовать с помощью гематоксилина в течение 2 мин.
   21. Поместите горку под проточную водопроводную воду на 3 мин.
   22. Промойте горку в дистиллированной воде.
   23. Установите горки под стеклянные крышки в монтажную среду и оставьте плоскими для высыхания.
   24. Наблюдайте под световым микроскопом.
3. Комплект для обнаружения апоптоза (Assay C)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов).
   1. Приготовьте банки Коплина.
   2. Депаракс и регидратация тканевых срезов (см. шаг 1.3).
   3. Инкубировать ткань протеиназой К (15-30 мин при 37 °С).
   4. Поместите слайды обратно на стойку и промойте 2x в PBS.
   5. Покрыть 50 мкл реакционной смеси TUNEL. Поместите влажные бумажные полотенца внутрь контейнера, накройте их полиэтиленовой пленкой и оставьте на 60 минут при 37 °C.
   6. Смойте 3x с помощью PBS.
   7. Поместите слайды в контейнер и высушите область вокруг образца ткани.
   8. Добавьте к образцу 50 мкл конвертера-АП и инкубируйте в увлажненном контейнере в течение 30 мин при 37 °C.
   9. Промыть 3x в PBS.
   10. Добавить 50-100 мкл раствора субстрата и оставить на 10 мин в темноте.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за окрашиванием под световым микроскопом.
   11. Промойте слайды 3x с помощью PBS.
   12. Противодействуйте окрашиванию, перемещая срезы в гематоксилин в течение 2 мин, а затем тщательно смывайте в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
   13. Установите горки под стеклянными крышками в водную монтажную среду и оставьте их плоскими для высыхания.
   14. Наблюдайте под световым микроскопом. Оцените пораженные (положительные) клетки, насчитав от 70 до 100 клеток в каждом образце средней кишки или HPG под световым микроскопом.

Результаты

Обнаружение гибели клеток в средней кишке
Недавно появившиеся рабочие пчелы (Apis mellifera carnica) с экспериментальной пасеки в Сельскохозяйственном институте Словении в Любляне были индивидуально обработаны 3% щавелевой кислотой (OA)²³. OA часто используется в пчело?...

Обсуждение

У живых организмов гибель клеток определяется как апоптоз или некроз²⁵ и может сопровождаться аутофагией²⁶. Разница между апоптотическими и некротическими клетками заключается в том, что апоптоз является формой запрограммированной гибели клеток и появляется ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101
Covers
DeadEnd Colorimetric TUNEL system	Promega	G7360	Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Dissecting microscope  (for bee dissection)	Zeiss
Distilled water
Embedding cassette
EnVision System alkaline phosphatase kit	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		alcoholic
Ethanol			95% (or less pure), 90%, 80%
Faramount mounting medium, aqueous	Dako		mounting medium
Flattening table	Leica	HI1220
Forceps  (for bee dissection)	Fine science tools	11294-00	Standard #4
Formalin 10%			Formaldehyde
Hematoxylin	Sigma-Aldrich
HistoChoice Clearing Agent	Sigma-Aldrich		clearing agent
Hydrogen peroxidase 3%
Incubator	BioRad
Insect pins  (for bee dissection)	Entosphinx	44594	Insect pins stainless steel – white, size 2
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Light microscope	Leica
Microscope slides			Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust
Microtome	Leica
Modular tissue embedding station	Leica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast	Leica
Pasteur pipettes			1.5 mL; 3 mL
PBS
Petri dish  (for bee dissection)			Filled with condensation silicon  (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)
Proteinase K	Merck	21627
Ringers' solution  (for bee dissection)			7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water
Scissors  (for bee dissection)	Fine science tools	1406-09, 14061-09	Straight and curved, 9 cm
Universal liquid plus activator  (for bee dissection)	Kulzer
Watchmaker’s forceps (for bee dissection)	Fine science tools	91100-12
Water bath	Leica
Watercolor brush			2x
Xantoprene L blue  (for bee dissection)	Kulzer