Noções Básicas de Histologia e Detecção de Morte Celular em Tecido de Abelhas Melíferas

Resumo

Métodos imuno-histoquímicos são úteis na pesquisa de abelhas para detectar e avaliar o nível de apoptose e necrose no intestino médio e nas glândulas hipofaríngeas de abelhas adultas.

Resumo

As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) dentro da colmeia (enfermeiras e outras abelhas da colmeia) e fora da colmeia (forrageiras) estão expostas a mudanças climáticas e climáticas, vários pesticidas, patógenos e desnutrição, entrando principalmente pela boca e afetando principalmente os tratos digestivos das abelhas adultas. Para entender e prevenir os efeitos de tais estressores externos e internos nas abelhas, um método de pesquisa útil é o método imuno-histoquímico. Um protocolo básico é descrito para preparar o intestino médio (ventrículo) e as glândulas hipofaríngeas (HPGs) de abelhas adultas para análise histológica. Uma metodologia detalhada é descrita para avaliar o nível de dano celular e distinguir necrose de morte celular programada (apoptose) como um processo natural de regeneração tecidual. Os resultados do tratamento de abelhas adultas com ácido oxálico e pesticidas (inseticida e acaricida) e a determinação da morte celular no ventrículo e HPGs são apresentados. Os prós e contras da metodologia também são discutidos.

Introdução

As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são, entre outros polinizadores silvestres, os mais importantes polinizadores das plantas agrícolas. Ao longo de milhares de anos, o ambiente em mudança influenciou as abelhas a adaptar sua morfologia, fisiologia, comportamento e tolerância a vários patógenos e parasitas. Portanto, as abelhas desenvolveram uma gama altamente diversificada de espécies e subespécies em todo o mundo¹. Esses resultados são consistentes com achados anteriores, de que há variação genética na estrutura do trato digestivo da abelha, mas também sugerem que as alterações do intestino médio são devidas a fatores ambientais ^2,3.

O trato digestivo da abelha tem três partes principais: intestino anterior, intestino médio (ventrículo) e intestino posterior⁴. O ventrículo é um órgão essencial para a digestão do pólen e néctar/mel; no intestino posterior, o controle osmótico ocorre por meio da absorção de água e íons². As glândulas hipofaríngeas (HPGs) das operárias das abelhas estão localizadas na cabeça e sintetizam e secretam componentes de geleia real para alimentar a ninhada, a rainha e os membros da colônia. Seu tamanho muda com a idade e as tarefas e depende de uma nutrição adequada (pólen de qualidade). Enfermeiros trabalhadores com idade entre 6 e 18 dias realizam a criação de ninhadas, e o tamanho dos HPGs aumenta ^5,6. Nas abelhas forrageiras, os HPGs degeneram e apenas secretam enzimas importantes para converter os açúcares complexos em açúcares simples (α-glucosidases, leucina arilamidase, invertase) no mel⁷.

As abelhas são expostas a vários estressores bióticos e abióticos⁸, e o trato digestivo pode ser afetado por vários estimulantes negativos. A primeira barreira que protege o organismo de patógenos é a membrana peritrófica no intestino médio, que consiste na mucosa intestinal para proteção contra patógenos⁴. O desenvolvimento e a função dos HPGs dependem da dieta, da idade e da condição da^colônia9, e são afetados por inseticidas, acaricidas 10 e patógenos^11,12,13. Os resíduos de acaricidas na colmeia devido ao tratamento de controle de varroa e os agrotóxicos do ambiente afetam abelhas forrageiras e abelhas enfermeiras^14,15. A maior ameaça às colônias de abelhas é o ácaro Varroa destructor, tanto como vetor de vírus que contribuem para a perda de colônias¹⁶ quanto como consumidor do corpo gordo do hospedeiro (importante órgão vital nas abelhas), o que, consequentemente, afeta o corpo do indivíduo e as funções da colônia¹⁷.

No entanto, habitats intensivos de terras agrícolas podem fornecer um suprimento de alimentos a curto prazo para as abelhas. Por conseguinte, os regimes agro-ambientais devem aumentar a disponibilidade de flores de mel nas paisagens agrícolas¹⁸. Para avaliar a morfologia de diferentes subespécies 6,19,20,21 ou os efeitos subletais desses fatores nos níveis celular ou tecidual, especialmente intestino médio e HPGs^, métodos histológicos e imuno-histoquímicos são práticos e suficientemente precisos para serem utilizados em pesquisas histológicas em abelhas.

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Protocolo

1. Histologia básica para pesquisa de abelhas

1. Dissecção do tecido das abelhas melíferas
   NOTA: Para a dissecação de abelhas operárias, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz LED. A ampliação mais útil é ~20x.
   1. Manipulação e dissecação
      1. Pegue cuidadosamente uma abelha operária com fórceps e coloque-a no gelo (ou no congelador a -20 °C) durante 2 minutos para imobilizá-la²². Prenda a abelha na placa de Petri diagonalmente através da porção superior das costas do tórax duas vezes, da esquerda para a direita e da direita para a esquerda.
      2. Despeje soro fisiológico de insetos para cobrir o corpo. Coloque a placa de Petri sob o microscópio, foque e ajuste.
      3. Prepare os instrumentos (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Dissecção do intestino médio
      1. Comece com o abdômen inserindo um ponto da tesoura sob o tergito A5 (Figura 1) no centro do lado direito do corpo da abelha. Corte para o tergito A2.
      2. Mantenha a lâmina interna da tesoura paralela com o lado do corpo para evitar danificar os órgãos internos. Vire a tesoura para a esquerda e faça um corte; vire à direita e faça outro corte. Abra suavemente a parte esquerda do abdômen e fixe-a. Repita do outro lado.
      3. Usando fórceps com uma mão, puxe suavemente o estômago das abelhas para cima e, com uma tesoura na outra mão, corte no final do esôfago. Puxe o estômago e o intestino médio para longe do abdômen e corte no reto. Use uma pipeta com solução salina de insetos e remova quaisquer fezes ou partes do tecido.
   3. Dissecção de HPGs
      1. Imobilizar uma abelha operária no gelo, conforme descrito na etapa 1.1.1. Corte a cabeça e coloque-a na placa menor com as antenas voltadas para cima. Prenda a cabeça com dois pinos: um através do olho composto esquerdo e o segundo através do olho composto direito.
      2. Faça um corte no primeiro olho composto no lado interno dos pinos, continue até o labrum e, em seguida, faça outro corte do outro lado através do segundo olho composto (Figura 2).
      3. Corte as antenas. Retire a máscara e corte onde ainda estiver preso. Pegue a pinça e remova cuidadosamente as glândulas junto com o cérebro e parte dos olhos compostos.
2. Fixação, desidratação e incorporação de parafina
   NOTA: Use luvas de proteção.
   1. Coloque o tecido em frascos de penicilina, preenchidos 3/4 com 10% de formalina. Conservar no frigorífico a 4 °C.
   2. Após 24 h, desidratar o tecido em uma série de álcoois: 70%, 80%, 90%, 100%, por 1 h cada, 100% 2-propanol por 1 h, 100% 2-propanol por 12 h e, finalmente, 100% 2-propanol por 1 h.
   3. Coloque o tecido em histocassetes; marcá-los e colocá-los nas câmaras de vidro com 2-propanol e parafina (1:1) numa incubadora a 60 °C durante 24 h.
   4. Mover as histocassetes para outra câmara com parafina (I.) por mais 24 h. Repetir o procedimento com parafina fresca mais duas vezes (II. e III.), ambas por 24 h.
   5. Finalmente, prepare a estação de montagem e comece a incorporar o tecido em cera.
      1. Abra cada histocassete e remova a tampa. Encha o molde com cera e coloque cuidadosamente o tecido com pinça quente no meio do molde.
      2. Coloque o histocassete no molde e cubra-o ligeiramente com cera. Coloque imediatamente o molde na superfície fria da estação de montagem por alguns segundos e, em seguida, coloque-o na placa fria por alguns minutos até que a cera endureça e se separe do molde e da histocassete.
   6. Armazenar as amostras acabadas em uma caixa, longe de poeira e calor.
   7. Corte seções finas de 4 μm em um micrótomo: primeiro, duas seções anexadas uma à outra e, em seguida, uma separadamente. Transferir as secções com pinça e deixá-las flutuar em água destilada (42 °C) e, em seguida, recolha-as em lâminas limpas, colocando duas secções juntas no lado esquerdo do vidro da objetiva e a terceira no lado direito, permanecendo distintamente separadas. Deixe as lâminas marcadas durante a noite no dispositivo de aquecimento e, finalmente, guarde-as em uma caixa dedicada a amostras de histologia.
3. Desparafinação e reidratação
   NOTA: Use luvas de proteção.
   1. Prepare nove frascos Coplin e coloque as seções em uma série de agentes de compensação (I., II., III.) por 5 minutos cada.
   2. Colocar em 2-propanol, etanol 96% (I., II.), álcool 90% e 80%, e água destilada por 3 min cada.
4. Tingimento com hematoxilina e eosina
   NOTA: Use luvas de proteção.
   1. Prepare seis frascos de Coplin.
   2. Para coloração de hematoxilina e eosina (H & E), coloque as seções desparafinadas e reidratadas em hematoxilina por 5 minutos e, em seguida, coloque-as cuidadosamente sob a água corrente da torneira por 2 minutos. Em seguida, coloque-os em água destilada por 1 min e eosina por 4 min (para eosina, o frasco Coplin não é necessário).
   3. Coloque as lâminas em etanol 96% por 1 min, depois 2-propanol por 2 min e, finalmente, no agente de compensação por 2 min.
   4. Adicione o meio de montagem e um vidro de cobertura e deixe-os secar. Observe sob um microscópio de luz.

Figura 1: Vista dorsal do corpo das abelhas. Tergites A1-A7. As instruções detalhadas sobre a dissecção de abelhas podem ser encontradas em Carreck et ^al.24. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Vista dorsal de HPGs, partes de olhos compostos ligados ao cérebro (não visíveis). Uma jovem abelha operária com idade entre 5 e 6 dias tem HPGs brancos rechonchudos e cremosos. Os ácinos estão localizados no cérebro e preenchem a área da cabeça com ramos que atingem a parte de trás do cérebro. Nas abelhas forrageadoras, essas glândulas são muito encolhidas e deixam apenas restos finos semelhantes a fios. Por esta razão, é melhor remover as glândulas juntamente com o cérebro para facilitar em procedimentos adicionais para evitar a perda do tecido. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Detecção de morte celular em cortes de tecido

1. Kit de detecção de apoptose (Ensaio A)
   NOTA: Siga o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de materiais).
   1. Prepare os frascos de Coplin.
   2. Após a desparafinagem e reidratação (ver passo 1.3), imergir as lâminas em solução de NaCl a 0,85% e, em seguida, em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (5 min).
   3. Coloque as lâminas em paraformaldeído a 4% 2 x 15 min.
   4. Coloque as lâminas planas no recipiente e adicione 100 μL de uma solução de proteinase K (20 μg/mL) e, em seguida, deixe-as por 10-30 min.
   5. Coloque os slides no PBS (5 min).
   6. Coloque as lâminas em paraformaldeído a 4% em PBS (5 min).
   7. Mergulhe os slides em PBS (2 x 5 min).
   8. Coloque as lâminas planas no recipiente, adicione 100 μL de tampão de equilíbrio e deixe-as por 5-10 min.
   9. Adicionar 100 μL de mistura de reacção TdT. Coloque toalhas de papel dentro do recipiente, ao redor dos escorregadores, umedeça as toalhas com água e, em seguida, cubra com filme plástico. Incubar lâminas durante 60 min a 37 °C.
   10. Coloque as lâminas de volta no rack de coloração e mergulhe em 2x citrato salino-sódico (SSC) por 15 min.
   11. Mergulhe as lâminas 3 x 5 min em PBS, depois em peróxido de hidrogênio a 0,3% por 3-5 min e, em seguida, em PBS novamente, 3 x 5 min.
   12. Novamente, coloque as lâminas planas no recipiente, adicione 100 μL de Streptavidin HRP (peroxidase de rábano) e deixe por 30 minutos (cubra com filme plástico).
   13. Mergulhe os slides 3 x 5 min em PBS.
   14. Colocar as lâminas planas no recipiente e adicionar 100 μL de solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Procure um fundo castanho claro.
   15. Devolva as corrediças ao rack e lave-as várias vezes em água (duplamente destiladas).
   16. Monte as lâminas sob tampas de vidro no meio de montagem e deixe planas para secar.
   17. Observe sob um microscópio de luz.
2. Kit de detecção de apoptose (Ensaio B)
   NOTA: Siga o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de materiais).
   1. Prepare frascos de Coplin.
   2. Preparar a proteinase K (20 μg/ml diluídos em PBS).
   3. Após a desparafinagem e reidratação das secções (passo 1.3), colocar as lâminas em PBS durante 5 min.
   4. Colocar as lâminas planas no recipiente e adicionar proteinase K (20 μg/ml, 60 μL por provete de 5 cm²).
   5. Lave as lâminas 2 x 2 min em água destilada.
   6. Têmpera em peroxidase endógena (em peroxidase de hidrogênio a 3%) à temperatura ambiente.
   7. Lave as lâminas 2 x 5 min com PBS ou água.
   8. Coloque as lâminas planas no recipiente e aplique o tampão de equilíbrio (75 μL/5 cm²) por 10 s à temperatura ambiente.
   9. Limpe cuidadosamente ao redor do tecido.
   10. Adicionar a enzima TdT (desoxinucleotidil transferase terminal) a cada secção e incubar numa câmara humidificada durante 1 h a 37 °C. Coloque toalhas de papel dentro da bandeja, ao redor das lâminas, umedeça as toalhas com água e cubra-as com filme plástico.
   11. Após a incubação, coloque os corpos de prova no rack e deixe-os em tampão stop/wash (10 min).
   12. Aqueça o conjugado antidigoxigenina à temperatura ambiente.
   13. Lave as lâminas em PBS (3 x 1 min).
   14. Limpe cuidadosamente ao redor do tecido.
   15. Adicionar duas gotas de conjugado Anti-Digoxigenina-Peroxidase (65 μL/5 cm²) às secções e incubar durante 30 minutos num recipiente humidificado.
   16. Após a lavagem em PBS 4 x 2 min, prepare o substrato de peroxidase resistente ao trabalho e bata suavemente o excesso de líquido e aspirar ao redor da seção.
   17. Cobrir as seções com substrato de peroxidase (75 μL/5 cm²) e corar por 5 min. Coloque uma lâmina sob o microscópio e determine o tempo de coloração ideal.
   18. Lave as lâminas em um suporte de coloração em água destilada (3 x 1 min).
   19. Incubar as lâminas em água destilada por 5 min.
   20. Contra-mancha usando hematoxilina por 2 min.
   21. Coloque o escorregador sob água corrente da torneira por 3 min.
   22. Lave o escorregador em água destilada.
   23. Monte as lâminas sob tampas de vidro no meio de montagem e deixe planas para secar.
   24. Observe sob um microscópio de luz.
3. Kit de detecção de apoptose (Ensaio C)
   NOTA: Siga o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de materiais).
   1. Prepare os frascos de Coplin.
   2. Descerar e reidratar as secções de tecido (ver passo 1.3).
   3. Incubar o tecido com proteinase K (15-30 min a 37 °C).
   4. Coloque as corrediças de volta no rack e enxágue 2x em PBS.
   5. Cobrir com 50 μL de «mistura de reacção TUNEL». Coloque as toalhas de papel molhadas dentro do recipiente, cubra-as com filme plástico e deixe-as por 60 min a 37 °C.
   6. Enxaguar 3x com PBS.
   7. Coloque as lâminas no recipiente e seque a área ao redor da amostra de tecido.
   8. Adicionar 50 μL de Converter-AP à amostra e incubar num recipiente humidificado durante 30 minutos a 37 °C.
   9. Enxaguar 3x em PBS.
   10. Adicione 50-100 μL de solução de substrato e deixe por 10 min no escuro.
       NOTA: Observe a coloração sob um microscópio de luz.
   11. Lave as lâminas 3x com PBS.
   12. Contra-manchar transferindo seções para hematoxilina por 2 minutos e, em seguida, enxaguar cuidadosamente em água corrente da torneira por 5 minutos.
   13. Monte as lâminas sob as tampas de vidro em um meio de montagem aquoso e deixe-as planas para secar.
   14. Observe sob um microscópio de luz. Avalie as células afetadas (positivas) contando de 70 a 100 células em cada amostra do intestino médio ou HPGs sob um microscópio de luz.

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Resultados

Detecção de morte celular no intestino médio
Abelhas operárias recém-surgidas (Apis mellifera carnica) do apiário experimental do Instituto Agrícola da Eslovênia em Liubliana foram tratadas individualmente com ácido oxálico (OA) a 3%²³. O OA é frequentemente usado na apicultura para controle de destruidores de Varroa . Após o tratamento, as abelhas operárias (três de cada grupo) foram imobilizadas sobre gelo. O intestino médio foi dissecado e fi...

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Discussão

Em organismos vivos, a morte celular é definida como apoptose ou necrose²⁵ e pode ser acompanhada de autofagia²⁶. A diferença entre células apoptóticas e necróticas é que a apoptose é uma forma de morte celular programada e aparece em células normais, enquanto a necrose ocorre devido a condições letais (por exemplo, acidente, doença)^27,28. A apoptose pode ser detectada usando kits de ensaio baseados na t?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101
Covers
DeadEnd Colorimetric TUNEL system	Promega	G7360	Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Dissecting microscope  (for bee dissection)	Zeiss
Distilled water
Embedding cassette
EnVision System alkaline phosphatase kit	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		alcoholic
Ethanol			95% (or less pure), 90%, 80%
Faramount mounting medium, aqueous	Dako		mounting medium
Flattening table	Leica	HI1220
Forceps  (for bee dissection)	Fine science tools	11294-00	Standard #4
Formalin 10%			Formaldehyde
Hematoxylin	Sigma-Aldrich
HistoChoice Clearing Agent	Sigma-Aldrich		clearing agent
Hydrogen peroxidase 3%
Incubator	BioRad
Insect pins  (for bee dissection)	Entosphinx	44594	Insect pins stainless steel – white, size 2
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Light microscope	Leica
Microscope slides			Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust
Microtome	Leica
Modular tissue embedding station	Leica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast	Leica
Pasteur pipettes			1.5 mL; 3 mL
PBS
Petri dish  (for bee dissection)			Filled with condensation silicon  (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)
Proteinase K	Merck	21627
Ringers' solution  (for bee dissection)			7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water
Scissors  (for bee dissection)	Fine science tools	1406-09, 14061-09	Straight and curved, 9 cm
Universal liquid plus activator  (for bee dissection)	Kulzer
Watchmaker’s forceps (for bee dissection)	Fine science tools	91100-12
Water bath	Leica
Watercolor brush			2x
Xantoprene L blue  (for bee dissection)	Kulzer