Histologische Grundlagen und Zelltodnachweis in Honigbienengewebe

Zusammenfassung

Immunhistochemische Methoden sind in der Honigbienenforschung nützlich, um den Grad der Apoptose und Nekrose in den Mitteldarm- und Hypopharynxdrüsen erwachsener Bienen zu erkennen und zu beurteilen.

Zusammenfassung

Honigbienen (Apis mellifera L.) innerhalb des Bienenstocks (Ammenarbeiter und andere Bienenstöcke) und außerhalb des Bienenstocks (Sammler) sind Klima- und Wetteränderungen, verschiedenen Pestiziden, Krankheitserregern und Unterernährung ausgesetzt, die hauptsächlich durch den Mund gelangen und hauptsächlich den Verdauungstrakt erwachsener Bienen betreffen. Um die Auswirkungen solcher externen und inneren Stressoren auf Honigbienen zu verstehen und zu verhindern, ist eine nützliche Forschungsmethode die immunhistochemische Methode. Es wird ein grundlegendes Protokoll beschrieben, um den Mitteldarm (Ventriculus) und die hypopharyngealen Drüsen (HPGs) erwachsener Bienen für die histologische Analyse vorzubereiten. Eine detaillierte Methodik wird beschrieben, um den Grad der Zellschädigung zu beurteilen und die Nekrose vom programmierten Zelltod (Apoptose) als natürlichen Prozess der Geweberegeneration zu unterscheiden. Die Ergebnisse der adulten Honigbienenbehandlung mit Oxalsäure und Pestiziden (Insektizid und Akarizid) und die Bestimmung des Zelltods im Ventriculus und HPGs werden vorgestellt. Die Vor- und Nachteile der Methodik werden ebenfalls diskutiert.

Einleitung

Honigbienen (Apis mellifera L.) sind neben anderen Wildbestäubern die wichtigsten Bestäuber landwirtschaftlicher Pflanzen. Über Tausende von Jahren hat die sich verändernde Umwelt Bienen beeinflusst, ihre Morphologie, Physiologie, ihr Verhalten und ihre Toleranz an verschiedene Krankheitserreger und Parasiten anzupassen. Daher haben Honigbienen rund um den Globus ein sehr vielfältiges Arten- und Unterartenspektrum entwickelt¹. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Befunden überein, dass es genetische Variationen in der Verdauungstraktstruktur der Honigbiene gibt, deuten aber auch darauf hin, dass Veränderungen des Mitteldarms auf Umwel....

Protokoll

1. Grundlagenhistologie für die Honigbienenforschung

1. Dissektion von Honigbienengewebe
   HINWEIS: Verwenden Sie für die Sektion von Arbeiterbienen ein Seziermikroskop mit einer LED-Lichtquelle. Die nützlichste Vergrößerung ist ~ 20x.
   1. Manipulation und Sezieren
      1. Eine Arbeitsbiene vorsichtig mit einer Pinzette nehmen und für 2 min auf Eis (oder in den Gefrierschrank bei -20 °C) legen, um sie zu immobilisieren²². Stecken Sie die Biene auf die Petrischale schräg durch den obersten hinteren Teil des Thorax zweimal, von links nach rechts und von rechts nach links.
      2. Gießen Sie Insektenkochsalzlösung, u....

Ergebnisse

Zelltodnachweis im Mitteldarm
Neu geschlüpfte Arbeiterbienen (Apis mellifera carnica) aus dem Versuchsimkerei des Landwirtschaftsinstituts Sloweniens in Ljubljana wurden einzeln mit 3% Oxalsäure (OA)²³ behandelt. OA wird häufig in der Imkerei zur Varroa-Destruktorkontrolle eingesetzt. Nach der Behandlung wurden die Arbeiterbienen (drei aus jeder Gruppe) auf Eis immobilisiert. Der Mitteldarm wurde seziert und in 10% Formalin fixiert. Das Gewebe wurde dann in.......

Diskussion

In lebenden Organismen wird der Zelltod als Apoptose oder Nekrose²⁵ definiert und kann von Autophagie²⁶ begleitet werden. Der Unterschied zwischen apoptotischen und nekrotischen Zellen besteht darin, dass Apoptose eine Form des programmierten Zelltods ist und in normalen Zellen auftritt, während Nekrose aufgrund tödlicher Bedingungen (z. B. Unfall, Krankheit) ^{auftritt27,28}. Apoptose kann mit Assay-Kits nachgewiese.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101
Covers
DeadEnd Colorimetric TUNEL system	Promega	G7360	Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Dissecting microscope  (for bee dissection)	Zeiss
Distilled water
Embedding cassette
EnVision System alkaline phosphatase kit	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		alcoholic
Ethanol			95% (or less pure), 90%, 80%
Faramount mounting medium, aqueous	Dako		mounting medium
Flattening table	Leica	HI1220
Forceps  (for bee dissection)	Fine science tools	11294-00	Standard #4
Formalin 10%			Formaldehyde
Hematoxylin	Sigma-Aldrich
HistoChoice Clearing Agent	Sigma-Aldrich		clearing agent
Hydrogen peroxidase 3%
Incubator	BioRad
Insect pins  (for bee dissection)	Entosphinx	44594	Insect pins stainless steel – white, size 2
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Light microscope	Leica
Microscope slides			Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust
Microtome	Leica
Modular tissue embedding station	Leica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast	Leica
Pasteur pipettes			1.5 mL; 3 mL
PBS
Petri dish  (for bee dissection)			Filled with condensation silicon  (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)
Proteinase K	Merck	21627
Ringers' solution  (for bee dissection)			7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water
Scissors  (for bee dissection)	Fine science tools	1406-09, 14061-09	Straight and curved, 9 cm
Universal liquid plus activator  (for bee dissection)	Kulzer
Watchmaker’s forceps (for bee dissection)	Fine science tools	91100-12
Water bath	Leica
Watercolor brush			2x
Xantoprene L blue  (for bee dissection)	Kulzer