Plazmonik DNA Origami Nanoantenleri Tarafından Sağlanan Tek Moleküllü Yüzey Geliştirilmiş Raman Saçılma Ölçümleri

Özet

Bu protokol, kolokalize atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve Raman ölçümleri ile birleştirilmiş bir DNA origami nanoanteni (DONA) kullanarak tek moleküllü yüzey geliştirilmiş Raman saçılımı (SERS) ölçümlerini göstermektedir.

Özet

Yüzeyle geliştirilmiş Raman saçılması (SERS), yüksek alan geliştirmesinin gerekli olduğu tek molekülleri tespit etme yeteneğine sahiptir. Tek moleküllü (SM) SER, bireysel moleküller hakkında moleküle özgü spektroskopik bilgi sağlayabilir ve bu nedenle diğer SM tespit tekniklerinden daha ayrıntılı kimyasal bilgi verir. Aynı zamanda, dökme malzemenin Raman ölçümlerinde gizli kalan SM ölçümlerinden elde edilen bilgileri çözme potansiyeli vardır. Bu protokol, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve Raman spektroskopisi ile birlikte bir DNA origami nanoanteni (DONA) kullanarak SM SERS ölçümlerini özetlemektedir. Bir DNA origami çatal yapısı ve iki altın nanopartikül, aralarında 1.2-2.0 nm'lik bir boşluk bulunan DONA'ları oluşturmak için birleştirilir. Bu, 10 adede kadar¹¹ kat SERS sinyal iyileştirmesine izin vererek tek moleküllerin ölçülmesini sağlar. Protokol ayrıca, tek bir analit molekülünün bir SERS sıcak noktasına yerleştirilmesini, AFM görüntüleme işlemini ve ardından tek bir DONA'daki bir analiti ölçmek için Raman görüntülemenin üst üste binmesini göstermektedir.

Giriş

DNA origami, DNA iplikçiklerini belirli şekillere ve desenlere katlamayı içeren bir nanoteknoloji tekniğidir. Nano ölçekte hassas kontrole sahip yapılar oluşturma yeteneği, DNA origami^1'in en önemli avantajlarından biridir. Maddeyi bu kadar küçük bir ölçekte manipüle etme yeteneği, tıp, elektronik ve malzeme bilimi² dahil olmak üzere çok çeşitli alanlarda devrim yaratma potansiyeline sahiptir. Örneğin, DNA origami yapıları, ilaçları doğrudan kanser hücrelerine iletmek için kullanılmıştır^3,4, hastalıkları tespit etmek için nano ölçekli sensörler oluşturmak ^5,6 ve malzemelerin yüzeylerinde karmaşık desenler oluşturmak ^6,7. Ayrıca, karmaşık nano ölçekli yapılar oluşturmak için DNA origami kullanma yeteneği,^{nano ölçekte} 8'de temel biyolojik süreçleri incelemek için yeni fırsatlar yaratmıştır.

Yüzey geliştirilmiş Raman saçılması (SERS), molekülleri son derece düşük konsantrasyonlarda tespit eden ve tanımlayan sağlam bir analitik tekniktir⁹. Dağınık ışığın dalga boyundaki bir değişiklik olan Raman etkisine dayanır¹⁰. SERS, üzerine adsorbe edilen moleküllerin Raman sinyalini arttırmak için bir plazmonik metal substrat gerektirir. Bu geliştirme, geleneksel Raman spektroskopisi ile ölçülen aynı molekülden elde edilen sinyalden 10¹¹ kat daha büyük olabilir, bu da SRERS'i eser miktarda maddeyi analiz etmek için oldukça hassas bir yöntem haline getirir¹¹.

Nanopartiküllerin Raman sinyali arttırılması, çoğunlukla lokalize yüzey plazmon rezonansının (LSPR) uyarılmasına dayanan elektromanyetik geliştirmeden kaynaklanmaktadır12. Bu fenomende, metal nanopartikül içindeki elektronlar, ışık insidansı sırasında metal nanopartikülün yüzeyi etrafında toplu olarak salınır. Bu, gelen ışıkla rezonansa girebilen bir yüzey plazmonu olarak bilinen durağan bir elektron dalgasının yaratılmasıyla sonuçlanır. LSPR, parçacığın yüzeyine yakın elektrik alanını büyük ölçüde arttırır ve parçacığın optik emilimi, plazmon rezonans frekansında maksimumdur. Yüzey plazmonunun enerjisi, metal nanopartikülün şekline ve boyutuna ve ayrıca çevredeki ortamın özelliklerine bağlıdır¹³. Daha yüksek bir gelişme, iki nanopartikülün çap uzunluğunun yaklaşık 2.5 katı veya^14'ten daha az bir mesafede birbirine yakın olması gibi plazmonik kaplinlerle daha da elde edilebilir. Yakınlık, her iki nanopartikülün LSPR'sinin birbirleriyle etkileşime girmesine neden olur ve parçacıklar arasındaki boşluktaki elektrik alanını, tek bir nanopartikül^15,16,17'nin geliştirilmesini çok aşan birkaç büyüklük sırasına göre arttırır. Geliştirmenin büyüklüğü, nanopartiküller arasındaki mesafe ile ters orantılıdır; mesafe azaldıkça, geliştirmenin tek molekülleri (SM'ler) tespit etmek için yeterli olduğu kritik bir nokta ortaya ^çıkar18.

DNA origami, plazmonik kuplajdan yararlanmak ve optimize etmek için plazmonik nanopartikülleri verimli bir şekilde düzenleyebilen anahtar bir teknolojiyi temsil eder¹⁹. Aynı zamanda, ilgilenilen moleküller optik algılamanın en verimli olduğu yere tam olarak yerleştirilebilir. Bu, floresan tespiti için DNA origami bazlı plazmonik nanoantenlerle gösterilmiştir²⁰. Floresan etiketlerin algılanmasının aksine, SERS bir molekülün doğrudan kimyasal parmak izini tespit etme imkanı sunarak, tek moleküllü SERS'i kimyasal reaksiyonları ve mekanik çalışmaları izlemenin yanı sıra algılama için çok çekici hale getirir. DNA origami, iyi tanımlanmış şekillere sahip plazmonik nanoyapıları üretmek için bir maske olarak da kullanılabilir²¹, ancak hedef molekülleri tam olarak sıcak noktaya yerleştirme olasılığı daha sonra kaybolur.

Kolokalize atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve Raman ölçümlerini kullanarak, Raman spektrumlarını tek bir DNA origami nanoanteninden (DONA) ve en yüksek sinyal geliştirme konumuna yerleştirilirse potansiyel olarak tek bir molekülden elde edebiliriz. DONA, bir DNA origami çatalı ve DNA origamiye bağlı genişletilmiş temel iplikçiklere tamamlayıcı DNA ile tamamen kaplanmış, hassas bir şekilde yerleştirilmiş iki nanopartikülden oluşur. DNA hibridizasyonu üzerine, nanopartiküller, nanopartikül yüzeyleri²² arasında 1.2-2.0 nm'lik bir boşluk ile DNA origami çatalına bağlanır. Bu tür bir montaj, sonlu fark zaman alanı (FDTD) simülasyonları^22'den hesaplandığı gibi, 10¹¹ kata kadar sinyal artışı ile nanopartiküller arasında bir sıcak nokta oluşturur ve böylece SM SERS ölçümlerine izin verir. Bununla birlikte, en yüksek geliştirmenin hacmi küçüktür (1-10 nm³ aralığında) ve sonuç olarak hedef moleküllerin tam olarak bu sıcak noktaya yerleştirilmesi gerekir. DNA origami çatalı, bir DNA çatal köprüsü ve uygun bağlantı kimyası kullanarak iki nanopartikül arasında tek bir molekülün konumlandırılmasına izin verir. Bununla birlikte, bu tür SM'leri Raman spektrumlarında gözlemlemek çok zordur²². Alternatif olarak, nanopartiküller, daha yüksek bir SERS yoğunluğu²¹ ile tek DONA ölçümlerine izin vermek için bir TAMRA boyası gibi hedef molekülle tamamen kaplanabilir. Bu durumda, TAMRA kovalent olarak DNA kaplama ipliğine bağlanır (Şekil 1).

Protokol

1. DNA origami çatal montajı

1. DNA origami yapısını tek bir kapta kendi kendine birleştirin. İlk olarak, 15 mM MgCl 2 tamponu ile desteklenmiş 1x TAE'de (tris [hidroksimetil] aminometan [tris], asetik asit, etilendiamin asetik asit [EDTA]) içine_2.5 nM dairesel iskele ipliği M13mp18 (7.249 nükleotit, bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) ve 100 nM 201 kısa oligonükleotid (Tablo 1) ekleyin. Ardından, ultra saf su kullanarak toplam ses seviyesini 100 μL'ye ayarlayın.
2. Çözeltiyi daha sonra bir termosikletçideki bir sıcaklık gradyanı ile tavlayın, önce hızlı bir şekilde 80 ° C'ye ısıtın, daha sonra 1 ° C / 12 dakikada 80 ° C'den 20 ° C'ye soğutularak, daha sonra 1 ° C / 6 dakikada 20 ° C'den 16 ° C'ye soğutun, ardından 16 ° C'den 8 ° C'ye hızla soğutun.
3. Karışımı fazla zımbalardan arındırmak için 100 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) Amicon filtreleri kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   1. Amicon filtrelerine 100 μL DNA origami çözeltisinin yanı sıra 400 μL ultra saf su ekleyin, ardından oda sıcaklığında (RT) 8 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj yapın.
   2. Filtreyi çıkararak ve lavabodaki yıkamayı gidermek için tüpü çevirerek filtreyi atın, ardından filtreye 400 μL ultra saf su ekleyin ve tekrar santrifüj yapın. Bu adımı bir kez daha yineleyin.
   3. Saflaştırılmış nanoyapı çözeltisini toplamak için, üreticinin talimatlarını izleyerek filtreyi yeni bir tüp ve santrifüjde (1.000 x g, 2 dakika, RT) baş aşağı çevirin (bkz. Bu çözelti buzdolabında 8 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
      NOT: Amicon filtre arıtma adımı için ultra saf su yerine 1x TAE tamponu veya 15 mM MgCl₂ tamponu ile desteklenmiş 1x TAE kullanın, çünkü su stabiliteyi azaltır ve elde edilen DNA origami çatallarının konsantrasyonunu düşürür. Tek bir boya molekülü ölçümü için, DNA elyaf ipliği karışımı, 5' ucunda bir TAMRA boyası içeren modifiye edilmiş bir iplik karışımı ile değiştirilir. Bu modifiye iplikçik, nanofork köprüsünün ortasındadır (Tablo 2).

2. Altın nanopartikül (AuNP) kaplama

NOT: AuNP'leri kaplamak için Liu ve ^ark.23 protokolünün değiştirilmiş bir versiyonu kullanıldı ve kaplama işlemi AuNP-DNA çözeltisinin dondurulmasını içeriyordu.

1. Santrifüj (3.500 x g, 5 dak, RT) 400 μL 60 nm çapında AuNP çözeltisi (ticari olarak elde edilir; bkz. Ardından, peleti 25 μL ultra saf suda çözündürün. AuNP'lerin son konsantrasyonu ~ 0.3 nM'dir.
2. 4 μL tiol modifiye DNA'ya (üretici tarafından sağlanan 100 μM; Malzeme Tablosuna bakınız) 1 μL 100 mM tris (2-karboksiyetil) fosfin (TCEP) çözeltisi ekleyin ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, 5 μL karışımını konsantre AuNP çözeltisine (adım 2.1), 5 s vortekse ekleyin ve -20 ° C'de en az 2 saat dondurun.
4. RT'de çözüldükten sonra, aşırı eklenen kaplama DNA'sını çıkarmak için karışımı santrifüj (3.500 x g, 5 dakika, RT) santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak, süpernatanı çıkarın ve peleti 10 μL su içinde çözünürleştirin.
   NOT: Nanofork üzerindeki AuNP'lerin her biri için iki kaplama ipliği vardır (Tablo 2). Adımlar, DNA kaplama ipliğinin dizisi dışında aynıdır. Parçacıklar kaplandıktan sonra, çok kararlıdırlar; buzdolabında aylarca olduğu gibi kalabilir ve hatta dondurulabilirler. Tamamen kaplanmış boya AuNP'ler için, kaplama DNA iplikçikleri dahili bir TAMRA boyasına sahiptir.

3. DONA meclisi

1. Kaplanmış AuNP çözeltisini, 1.5: 1 konsantrasyon molar oranına sahip nanofork çözeltisine ekleyin.
2. 50 mM MgCl 2 stok çözeltisi kullanarak 4 mM'lik son konsantrasyona MgCl₂ ekleyin. Son ses seviyesini ultra saf su kullanarak 20 μL'ye ayarlayın.
3. DONA'ları bir termosiklusta bir sıcaklık gradyanı kullanarak hibritleştirin. İlk olarak, hızlı bir şekilde 40 ° C'ye ısıtın, daha sonra 1 ° C / 10 dakikada 40 ° C'den 20 ° C'ye soğutun ve ardından 20 ° C'den 8 ° C'ye hızla soğutun.

4. Jel elektroforezi

NOT: DONA çözeltisindeki bağlanmamış nanopartiküller agaroz jel elektroforezi ile uzaklaştırılır.

1. % 1 agaroz jeli hazırlayın. Bunun için, 5 mM_{MgCl 2} ile desteklenmiş 80 mL 1x TAE içinde 0.8 g agarozu çözün.
2. Adım 3.2'de 4 mM'den 5 mM MgCl 2'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için 18 μL DONA çözeltisine 2,25 μL yükleme tamponu (% 30 gliserol, 13 mM MgCl₂; bkz. Yükleme tamponu ayrıca numunenin jelin cebinde kalmasını sağlar.
3. Jeli buzlu su banyosunda 70 V'ta 60 dakika boyunca çalıştırın. Çalışan tampon, 5 mM MgCl 2 ile desteklenmiş 1x TAE'dir_.
4. İlgilendiğiniz bandı kesin ve parafin plastik film sarılı mikroskopi slaydına yerleştirin ve ardından ikinci bir parafin plastik film sarılı mikroskopi slaydı kullanarak çözeltiyi sıkın. Bir pipet kullanarak, sıkılmış sıvıyı 500 μL'lik bir tüpe toplayın.

5. AFM ve Raman ölçümlerinin kolokalizasyonu

1. Plazma, bir silikon çipi (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 dakika boyunca işlemden geçirir, daha sonra 10 μL saflaştırılmış DONA çözeltisini artı 10 μL 100 mM MgCl_2'yi çip üzerinde 3 saat boyunca inkübe eder. Ardından, çipi iki kez 1:1 etanol ve su karışımı (hacme göre) ile yıkayın ve basınçlı hava ile fön ile kurutun. Ardından, çipi manyetik bir diske bantlayın ve görüntüleme için cihaza yerleştirin.
   NOT: Ölçümlere başlamadan önce, Raman uyarma lazerinin konumu AFM prob ucunun üstünde olacak şekilde ayarlanır. Bu çalışmada bir HORIBA LabRAM HR Evolution Raman mikroskobu ile HORIBA Omegaskop AFM birleştirilmiştir. Cihaz, LabSpec ve AST yazılımı kullanılarak kontrol edilir.
2. AFM ölçümü için, ACCESS-NC-A (rezonans frekansı: 300 kHz; yay sabiti: 45 N/m) uçları²⁴ ile kılavuz çekme modunu (AC modu) kullanın. AC modu, 1 Hz'e ayarlanan tarama hızı dışındaki tüm parametreleri otomatik olarak kontrol eder.
   NOT: AFM görüntülemeyi takiben, AFM ucu Raman lazerin yolunda olmayacak şekilde çekilir. Bu, sistemde programlanmış bir makro işlevi olan "Prob uzakta" kullanılarak yapılır. Bu şekilde, AFM görüntüsünde seçilen herhangi bir nokta için, lazer AFM'ye kıyasla ofset olmadan aynı konumda olacaktır.
3. Raman ölçümleri için istenen lazer dalga boyunu, gücünü ve birikim süresini seçin, çünkü tüm bu parametreler ölçülen numuneye bağlıdır.
   1. Tam kaplamalı bir TAMRA AuNP ölçümü için belirtilen parametreleri kullanın: 633 nm lazer, 100 μW güç ve 1 s entegrasyon süresi.
   2. Tek bir TAMRA ölçümü için belirtilen parametreleri kullanın: 633 nm lazer, 400 μW güç ve 4 s entegrasyon süresi.
4. Parametreleri ayarladıktan sonra, imleci AFM görüntüsünde istenen DONA'nın üzerine getirin; Yazılımdaki "imleci hareket ettir" işlevi bunu yapar. Ardından, Raman ölçümünü başlatın.
   NOT: Spektrumları elde etmek için farklı modlar vardır: tek nokta ölçümü-tek boyutlu zaman haritalaması-burada tek bir noktanın zaman içinde ölçüldüğü²⁵; ve bir XY ızgarası^26'daki bir dizi noktadan spektrum elde etmek için motorlu bir aşamanın lazer altında hareket ettirildiği iki boyutlu XY alan haritalaması.

Tartışmalar

SM SERS, araştırmacıların bir örnek¹ içindeki bireysel moleküllerin davranışlarını ve etkileşimlerini incelemelerini sağlayan güçlü bir araçtır. Böyle bir teknik, sistemlerin benzeri görülmemiş bir hassasiyet seviyesinde analiz edilmesine izin verir, tek moleküllerin temel davranışlarına ve kimyasal veya fiziksel özelliklerin bir molekül topluluğu üzerindeki dağılımına yeni bakış açıları sağlar ve kimyasal işlemlerde ilgili ara ürünlerin tanımlanmasına yardımcı olur. Bununla birlikte, sıcak noktaya tek bir molekül yerleştirirken, aynı zamanda sıcak noktanın yeterli yüzey iyileştirmesine sahip olduğundan emin olmak oldukça zor olabilir²⁷. Bu protokolde açıklanan DONA'lar, 10^{adet 11} kat yüzey iyileştirmesine ulaşılmasını sağlarken, iki altın nanopartikül arasındaki sıcak noktaya tek bir molekülü hassas bir şekilde yerleştirebilir.

Nanopartiküller arasındaki boşluk, DONA düzeneğinin SM SERS çalışmaları için gerekli yüzey iyileştirmesine ulaşması için kritik öneme sahiptir. DONA'lar, 60 ila 80 nm arasındaki boyutlara sahip küresel nanopartiküller için optimize edilmiştir. Ayrıca, nanopartiküllerin kalitesi, nanopartiküllerin DNA origami çatalları ile hibridizasyonunu önemli ölçüde etkileyebilir; Kaplama adımında kullanılan nanopartiküller 6 aydan daha eski olduğunda, hibridizasyonun verimliliği düşmeye başlar.

Protokolün bir diğer kritik yönü, bileşenler arasında kesin bir oran gerektiren adımların tam olarak izlenmesi gerektiğidir, aksi takdirde DONA'lar doğru şekilde oluşturulmaz. DNA origami çatalı, yapının bütünlüğünü etkileyen veya çatalların oluşmasını önleyen değişikliklerle sıcaklık artırma protokolüne karşı son derece hassastır.

Amorf karbon üretimi, SERS ölçümleri sırasında önemli bir konudur, çünkü zirveleri tipik olarak birçok molekül için parmak izi alanıyla aynı aralıktadır (1.200-1.700 ^cm-1). Oluşum henüz tam olarak anlaşılmamış olsa da, genellikle yüksek lazer gücü veya uzun entegrasyon süreleri^{ile ilişkilidir 28}. Önlem olarak, mümkün olan en düşük lazer gücü ve mümkün olan en kısa entegrasyon süresi kullanılmalıdır. Bununla birlikte, bu kolayca başarılamaz, çünkü istenen SERS sinyalini elde etmek ve amorf karbon oluşumunu önlemek arasında bir denge sağlanmalıdır.

DONA'lar, gümüş küreler, altın çiçekler veya yıldızlar gibi kullanılabilecek farklı nanopartikül türleri ve şekilleri ile ilgili bir SM sistemi olarak çok yönlüdür. Ek olarak, incelenen molekül, prosedürde herhangi bir değişiklik yapılmadan, sadece köprünün ortasındaki DNA ipliğini değiştirerek kolayca değiştirilebilir. Sitokrom C gibi proteinlere geçiş, köprüde piridin modifiye edilmiş bir DNA yakalama ipliğine sahip olarak yapılabilir, bu da sitokrom C'yi bağlayacak ve SM SERS ölçümleri için sıcak noktada olmasını sağlayacaktır²². Bu aynı zamanda lazeri ışınlama için esnek bir şekilde seçmek, potansiyel olarak maksimum iyileştirme sağlayan bir lazer kullanmak anlamına gelir.

Özetle, bu yöntem DONA yapılarını monte etmek ve bunları tek moleküllü yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi ölçümleri için kullanmak için güvenilirdir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL	Merck	UFC5100BK
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA)	SIGMA Aldrich	T9650
60 nm goldspheres, bare (citrate)	NanoComposix	AUCN60
ACCESS-NC-A AFM probes	SCHAEFER-TEC
Agarose powder	SIGMA Aldrich	9012-36-6
AuNP DNA coating strands	IDT
AuNP DNA coating strands (TAMRA)	SIGMA Aldrich
Glycerol	SIGMA Aldrich	56-81-5
Heraeus Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution	HORIBA
Magnesium chloride	SIGMA Aldrich	7786-30-3
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA)	Metabion
Nanofork DNA staple strands	SIGMA Aldrich
ParafilmM	Carl Roth	CNP8.1
Primus 25 Thermocycler	Peqlab/VWR
Silicon wafer	Siegert wafer	BW14076
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18)	Tilibit nanosystems
TCEP solution	SIGMA Aldrich	51805-45-9