Einzelmolekül-oberflächenverstärkte Raman-Streuungsmessungen durch plasmonische DNA-Origami-Nanoantennen ermöglicht

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert Einzelmolekül-Messungen der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS) unter Verwendung einer DNA-Origami-Nanoantenne (DONA) in Kombination mit kolokalisierter Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Raman-Messungen.

Zusammenfassung

Die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) ist in der Lage, einzelne Moleküle zu detektieren, für die eine Hochfeldverstärkung erforderlich ist. Einzelmolekül (SM) SERS ist in der Lage, molekülspezifische spektroskopische Informationen über einzelne Moleküle zu liefern und liefert daher detailliertere chemische Informationen als andere SM-Detektionstechniken. Gleichzeitig besteht das Potenzial, Informationen aus SM-Messungen zu entschlüsseln, die in Raman-Messungen von Schüttgut verborgen bleiben. Dieses Protokoll beschreibt die SM SERS-Messungen unter Verwendung einer DNA-Origami-Nanoantenne (DONA) in Kombination mit Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Raman-Spektroskopie. Eine DNA-Origami-Gabelstruktur und zwei Gold-Nanopartikel werden kombiniert, um die DONAs zu bilden, mit einem Abstand von 1,2-2,0 nm zwischen ihnen. Dies ermöglicht eine bis zu 10-fache^11-fache SERS-Signalverstärkung, die Messungen einzelner Moleküle ermöglicht. Das Protokoll demonstriert außerdem die Platzierung eines einzelnen Analytmoleküls in einem SERS-Hot-Spot, den Prozess der AFM-Bildgebung und die anschließende Überlagerung der Raman-Bildgebung zur Messung eines Analyten in einem einzelnen DONA.

Einleitung

DNA-Origami ist eine Nanotechnologie-Technik, bei der DNA-Stränge in bestimmte Formen und Muster gefaltet werden. Die Fähigkeit, Strukturen mit präziser Kontrolle auf der Nanoskala zu erzeugen, ist einer der Hauptvorteile von DNA-Origami¹. Die Fähigkeit, Materie in einem so kleinen Maßstab zu manipulieren, hat das Potenzial, eine Vielzahl von Bereichen zu revolutionieren, darunter Medizin, Elektronik und Materialwissenschaften². Zum Beispiel wurden DNA-Origami-Strukturen verwendet, um Medikamente direkt an Krebszellen zu verabreichen ^3,4, nanoskalige Sensoren zur Erkennung von Krankheiten^{herzustellen 5,6} und komplizierte Muster auf den Oberflächen von Materialien^{zu erzeugen 6,7}. Darüber hinaus hat die Möglichkeit, DNA-Origami zur Herstellung komplexer nanoskaliger Strukturen zu verwenden, neue Möglichkeiten für die Untersuchung grundlegender biologischer Prozesse auf der Nanoskala^{geschaffen 8}.

Die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) ist eine robuste Analysetechnik, die Moleküle in extrem niedrigen Konzentrationen detektiert und identifiziert⁹. Es basiert auf dem Raman-Effekt, bei dem es sich um eine Änderung der Wellenlänge von Streulicht¹⁰ handelt. SERS benötigt ein plasmonisches Metallsubstrat, um das Raman-Signal der daran adsorbierten Moleküle zu verstärken. Diese Verstärkung kann bis zu 10-^bis 11-mal größer sein als das Signal, das vom gleichen Molekül mit herkömmlicher Raman-Spektroskopie gemessen wird, was SERS zu einer hochempfindlichen Methode für die Analyse von Spurenmengen von Substanzen macht¹¹.

Die Raman-Signalverstärkung von Nanopartikeln ist hauptsächlich auf elektromagnetische Verstärkung zurückzuführen, die auf der Anregung der lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) ^basiert12. Bei diesem Phänomen schwingen Elektronen innerhalb des Metallnanopartikels während des Lichteinfalls kollektiv um die Oberfläche des Metallnanopartikels. Dadurch entsteht eine stehende Welle von Elektronen, die als Oberflächenplasmon bezeichnet wird und mit dem einfallenden Licht in Resonanz treten kann. Das LSPR verstärkt das elektrische Feld in der Nähe der Teilchenoberfläche erheblich, und die optische Absorption des Teilchens ist bei der Plasmonenresonanzfrequenz am größten. Die Energie des Oberflächenplasmons hängt von der Form und Größe des Metallnanopartikels sowie von den Eigenschaften des umgebenden Mediums¹³ ab. Eine höhere Verstärkung könnte weiter durch plasmonische Kopplungen erreicht werden, z. B. wenn zwei Nanopartikel in einem Abstand von etwa dem 2,5-fachen der Durchmesserlänge oder weniger nahe beieinander liegen¹⁴. Die Nähe bewirkt, dass die LSPR beider Nanopartikel miteinander wechselwirken, wodurch das elektrische Feld im Spalt zwischen den Partikeln um mehrere Größenordnungen verstärkt wird, was weit über die Verstärkung eines einzelnen Nanopartikels hinausgeht^15,16,17. Das Ausmaß der Verstärkung ist umgekehrt proportional zum Abstand zwischen den Nanopartikeln; Wenn der Abstand abnimmt, erscheint ein kritischer Punkt, an dem die Verstärkung ausreicht, um einzelne Moleküle (SMs) zu ^erkennen18.

DNA-Origami stellt eine Schlüsseltechnologie dar, mit der plasmonische Nanopartikel effizient angeordnet werden können, um die plasmonische Kopplung auszunutzen und zu optimieren¹⁹. Gleichzeitig können die interessierenden Moleküle genau an der Stelle platziert werden, an der die optische Detektion am effizientesten ist. Dies wurde mit DNA-Origami-basierten plasmonischen Nanoantennen für die Fluoreszenzdetektion^{demonstriert 20}. Im Gegensatz zur Detektion von Fluoreszenzmarkierungen bietet SERS die Möglichkeit, einen direkten chemischen Fingerabdruck eines Moleküls zu detektieren, was das Einzelmolekül-SERS sehr attraktiv für die Sensorik sowie die Überwachung chemischer Reaktionen und mechanistischer Studien macht. DNA-Origami kann auch als Maske verwendet werden, um plasmonische Nanostrukturen mit genau definierten Formen^{herzustellen 21}, obwohl die Möglichkeit, Zielmoleküle präzise im Hot Spot zu positionieren, dann verloren geht.

Mit Hilfe von kolokalisierter Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Raman-Messungen können wir die Raman-Spektren von einer einzelnen DNA-Origami-Nanoantenne (DONA) und möglicherweise einem einzelnen Molekül erhalten, wenn wir sie an der Position mit der höchsten Signalverstärkung platzieren. Das DONA besteht aus einer DNA-Origami-Gabel und zwei präzise positionierten Nanopartikeln, die vollständig mit DNA beschichtet sind, die komplementär zu verlängerten Klammersträngen ist, die am DNA-Origami befestigt sind. Bei der DNA-Hybridisierung werden die Nanopartikel mit einem Abstand von 1,2 bis 2,0 nm zwischen den Nanopartikeloberflächen²² an die DNA-Origami-Gabel gebunden. Eine solche Anordnung erzeugt einen Hot Spot zwischen den Nanopartikeln mit einer Signalverstärkung von bis zu 10^{bis 11-fach}, wie aus Finite-Differenzen-Zeitbereichssimulationen (FDTD)²² berechnet, wodurch SM-SERS-Messungen ermöglicht werden. Das Volumen der höchsten Verstärkung ist jedoch klein (im Bereich von 1-10 nm³ ), so dass die Zielmoleküle genau in diesem Hot Spot positioniert werden müssen. Die DNA-Origami-Gabel ermöglicht die Positionierung eines einzelnen Moleküls zwischen den beiden Nanopartikeln mithilfe einer DNA-Gabelbrücke und einer geeigneten Kopplungschemie. Nichtsdestotrotz ist die Beobachtung solcher SMs in Raman-Spektren eine große Herausforderung²². Alternativ können die Nanopartikel vollständig mit dem Zielmolekül, z. B. einem TAMRA-Farbstoff, beschichtet werden, um einzelne DONA-Messungen mit einer höheren SERS-Intensität zu ermöglichen²¹. In diesem Fall ist die TAMRA kovalent an den DNA-Beschichtungsstrang gebunden (Abbildung 1).

Protokoll

1. DNA-Origami-Gabel-Baugruppe

1. Setze die DNA-Origami-Struktur selbst in einem Topf zusammen. Zunächst werden 2,5 nM kreisförmiger Gerüststrang M13mp18 (7.249 Nukleotide, siehe Materialtabelle) und 100 nM 201 kurze Oligonukleotide (Tabelle 1) in 1x TAE (Tris[hydroxymethyl]aminomethan [tris], Essigsäure, Ethylendiaminessigsäure [EDTA]) zugegeben, ergänzt mit 15 mM MgCl2-Puffer. Stellen Sie dann das Gesamtvolumen mit Reinstwasser auf 100 μl ein.
2. Anschließend wird die Lösung durch einen Temperaturgradienten in einem Thermocycler geglüht, zunächst durch schnelles Erhitzen auf 80 °C, dann durch Abkühlen von 80 °C auf 20 °C bei 1 °C/12 min, dann von 20 °C auf 16 °C bei 1 °C/6 min, gefolgt von raschem Abkühlen von 16 °C auf 8 °C.
3. Verwenden Sie Amicon-Filter mit einem Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) von 100 kDa (siehe Materialtabelle), um das Gemisch von überschüssigen Heftklammern zu reinigen.
   1. Geben Sie 100 μl der DNA-Origami-Lösung sowie 400 μl Reinstwasser in die Amicon-Filter und zentrifugieren Sie sie dann bei 6.000 x g für 8 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
   2. Entsorgen Sie das Filtrat, indem Sie den Filter entfernen und das Röhrchen umdrehen, um die Auswaschung in der Spüle zu entfernen, dann 400 μl Reinstwasser in den Filter geben und erneut zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
   3. Um die gereinigte Nanostrukturlösung aufzufangen, drehen Sie den Filter in einem neuen Röhrchen auf den Kopf und zentrifugieren Sie ihn gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Diese Lösung kann bis zu 2 Wochen im Kühlschrank bei 8 °C aufbewahrt werden.
      HINWEIS: Verwenden Sie 1x TAE-Puffer oder 1x TAE, ergänzt mit 15 mM MgCl_2-Puffer anstelle von Reinstwasser für den Amicon-Filterreinigungsschritt, da Wasser die Stabilität verringert und die Konzentration der erhaltenen DNA-Origami-Gabeln senkt. Für eine Einzelfarbstoffmolekülmessung wird die DNA-Stapelstrangmischung durch eine modifizierte Strangmischung ersetzt, die am 5'-Ende einen TAMRA-Farbstoff enthält. Dieser modifizierte Strang befindet sich in der Mitte der Nanogabelbrücke (Tabelle 2).

2. Gold-Nanopartikel-Beschichtung (AuNP)

HINWEIS: Eine modifizierte Version des Protokolls von Liu et ^al.23 wurde verwendet, um die AuNPs zu beschichten, und der Beschichtungsprozess beinhaltete das Einfrieren der AuNP-DNA-Lösung.

1. Zentrifugieren (3.500 x g, 5 min, RT) 400 μl AuNP-Lösung mit einem Durchmesser von 60 nm (kommerziell erhältlich; siehe Materialtabelle) und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Anschließend wird das Pellet in 25 μl Reinstwasser aufgelöst. Die Endkonzentration der AuNPs beträgt ~0,3 nM.
2. 1 μl 100 mM Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)-Lösung zu 4 μl thiolmodifizierter DNA (100 μM wie vom Hersteller angegeben; siehe Materialtabelle) geben und 10 min bei RT inkubieren.
3. Nach der Inkubation wird das 5-μl-Gemisch in die konzentrierte AuNP-Lösung gegeben (Schritt 2.1), 5 s lang vortex und mindestens 2 h bei -20 °C eingefroren.
4. Nach dem Auftauen bei RT wird das Gemisch zentrifugiert (3.500 x g, 5 min, RT), um die übermäßig zugesetzte Beschichtungs-DNA zu entfernen. Entfernen Sie mit einer Pipette den Überstand und lösen Sie das Pellet in 10 μl Wasser auf.
   HINWEIS: Es gibt zwei Beschichtungsstränge für jeden der AuNPs auf der Nanogabel (Tabelle 2). Die Schritte sind bis auf die Sequenz des DNA-Beschichtungsstrangs die gleichen. Sobald die Partikel beschichtet sind, sind sie sehr stabil; Sie können monatelang im Kühlschrank stehen bleiben und sogar eingefroren werden. Bei vollständig beschichteten Farbstoff-AuNPs haben die Beschichtungs-DNA-Stränge einen internen TAMRA-Farbstoff.

3. DONA Montage

1. Fügen Sie der Nanogabellösung die beschichtete AuNP-Lösung mit einem molaren Konzentrationsverhältnis von 1,5:1 hinzu.
2. Fügen Sie_MgCl2 zu einer Endkonzentration von 4 mM unter Verwendung einer 50 mM MgCl2-Stammlösung hinzu. Stellen Sie das Endvolumen mit Reinstwasser auf 20 μl ein.
3. Hybridisieren Sie die DONAs mit Hilfe eines Temperaturgradienten in einem Thermocycler. Zuerst schnell auf 40 °C erhitzen, dann von 40 °C auf 20 °C bei 1 °C/10 min abkühlen und dann schnell von 20 °C auf 8 °C abkühlen.

4. Gelelektrophorese

HINWEIS: Die ungebundenen Nanopartikel in der DONA-Lösung werden durch Agarose-Gelelektrophorese entfernt.

1. Bereiten Sie 1% Agarose-Gel vor. Dazu lösen Sie 0,8 g Agarose in 80 ml 1x TAE, ergänzt mit 5 mM_MgCl2.
2. Fügen Sie 2,25 μl Beladungspuffer (30 % Glycerin, 13 mM_MgCl2; siehe Materialtabelle) zu 18 μl DONA-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 5 mM MgCl 2 von 4 mM in Schritt_3.2 zu erreichen. Der Ladepuffer sorgt auch dafür, dass die Probe in der Tasche des Gels bleibt.
3. Lassen Sie das Gel 60 Minuten lang bei 70 V in einem Eiswasserbad laufen. Der laufende Puffer besteht aus 1x TAE, ergänzt mit 5 mM_MgCl2.
4. Schneiden Sie das gewünschte Band aus und legen Sie es auf einen mit Paraffinfolie umwickelten Mikroskopieobjektträger, und drücken Sie dann die Lösung mit einem zweiten mit Paraffinfolie umwickelten Mikroskopieobjektträger aus. Sammeln Sie die gepresste Flüssigkeit mit einer Pipette in einem 500-μl-Röhrchen.

5. Kolokalisation von AFM- und Raman-Messungen

1. Plasmabehandlung eines Siliziumchips (siehe Materialtabelle) für 10 min, dann Inkubation von 10 μl der gereinigten DONA-Lösung plus 10 μl 100 mM_MgCl2 auf dem Chip für 3 h. Waschen Sie den Chip dann zweimal mit einer 1:1-Mischung (nach Volumen) aus Ethanol und Wasser und föhnen Sie ihn mit Druckluft. Kleben Sie dann den Chip auf eine Magnetplatte und setzen Sie ihn zur Bildgebung in das Instrument ein.
   Anmerkungen: Bevor Sie mit den Messungen beginnen, wird die Position des Raman-Anregungslasers so eingestellt, dass er sich oben auf der AFM-Sondenspitze befindet. In der vorliegenden Arbeit wird ein HORIBA LabRAM HR Evolution Raman-Mikroskop verwendet, das mit einem HORIBA Omegascope AFM gekoppelt ist. Die Steuerung des Gerätes erfolgt über die Software LabSpec und AIST.
2. Verwenden Sie für die AFM-Messung den Abgriffsmodus (AC-Modus) mit den Spitzen²⁴ ACCESS-NC-A (Resonanzfrequenz: 300 kHz; Federkonstante: 45 N/m). Der AC-Modus steuert automatisch alle Parameter mit Ausnahme der Abtastrate, die auf 1 Hz eingestellt ist.
   Anmerkungen: Nach der AFM-Bildgebung wird die AFM-Spitze zurückgezogen, so dass sie sich nicht im Weg des Raman-Lasers befindet. Dies geschieht über eine im System programmierte Makrofunktion "Probe away". Auf diese Weise befindet sich der Laser für jeden ausgewählten Punkt im AFM-Bild in der gleichen Position ohne Versatz im Vergleich zum AFM.
3. Wählen Sie die gewünschte Laserwellenlänge, Leistung und Akkumulationszeit für die Raman-Messungen, da alle diese Parameter von der gemessenen Probe abhängen.
   1. Verwenden Sie die genannten Parameter für eine vollbeschichtete TAMRA AuNP-Messung: 633 nm Laser, 100 μW Leistung und 1 s Integrationszeit.
   2. Verwenden Sie die genannten Parameter für eine einzelne TAMRA-Messung: 633 nm Laser, 400 μW Leistung und 4 s Integrationszeit.
4. Nachdem Sie die Parameter angepasst haben, platzieren Sie den Cursor auf der gewünschten DONA im AFM-Bild. Die Funktion "Cursor bewegen" in der Software tut dies. Starten Sie dann die Raman-Messung.
   HINWEIS: Es gibt verschiedene Modi für die Erfassung der Spektren: Einzelpunktmessung - eindimensionales Zeitmapping - bei dem ein einzelner Punkt über die Zeit²⁵ gemessen wird; und zweidimensionale XY-Bereichskartierung, bei der ein motorisierter Tisch unter dem Laser bewegt wird, um Spektren von einer Anordnung von Punkten in einem XY-Gitter²⁶ zu erfassen.

Diskussion

SM SERS ist ein leistungsstarkes Werkzeug, mit dem Forscher das Verhalten und die Wechselwirkungen einzelner Moleküle innerhalb einer Probe^{untersuchen können 1}. Eine solche Technik ermöglicht die Analyse von Systemen in einer noch nie dagewesenen Empfindlichkeit, liefert neue Einblicke in das grundlegende Verhalten einzelner Moleküle und die Verteilung chemischer oder physikalischer Eigenschaften über ein Ensemble von Molekülen und hilft, relevante Zwischenprodukte in chemischen Prozessen zu identifizieren. Es kann jedoch eine ziemliche Herausforderung sein, ein einzelnes Molekül im Hot Spot zu platzieren und gleichzeitig sicherzustellen, dass der Hot Spot über eine ausreichende Oberflächenverbesserung verfügt²⁷. Die in diesem Protokoll beschriebenen DONAs können ein einzelnes Molekül präzise im Hot Spot zwischen zwei Goldnanopartikeln platzieren und gleichzeitig eine 10-^{bis 11-fache} Oberflächenverbesserung sicherstellen.

Der Abstand zwischen den Nanopartikeln ist entscheidend für die DONA-Baugruppe, um die erforderliche Oberflächenverbesserung für SM SERS-Studien zu erreichen. Die DONAs sind für sphärische Nanopartikel mit Größen zwischen 60 und 80 nm optimiert. Darüber hinaus kann die Qualität der Nanopartikel die Hybridisierung der Nanopartikel mit den DNA-Origami-Gabeln erheblich beeinflussen; Wenn die Nanopartikel, die im Beschichtungsschritt verwendet werden, älter als 6 Monate sind, beginnt die Effizienz der Hybridisierung zu sinken.

Ein weiterer kritischer Aspekt des Protokolls ist, dass die Schritte, die ein genaues Verhältnis zwischen den Komponenten erfordern, genau befolgt werden müssen, da sonst die DONAs nicht korrekt gebildet werden. Die DNA-Origami-Gabel reagiert extrem empfindlich auf das Temperaturrampenprotokoll, wobei Änderungen die Integrität der Struktur beeinträchtigen oder die Bildung von Gabeln verhindern.

Die Bildung von amorphem Kohlenstoff ist ein wichtiges Problem bei SERS-Messungen, da seine Spitzen typischerweise im gleichen Bereich wie der Fingerabdruckbereich vieler Moleküle liegen (1.200-1.700 ^cm-1). Obwohl die Entstehung noch nicht vollständig verstanden ist, wird sie in der Regel mit hoher Laserleistung oder langen Integrationszeiten in Verbindung gebracht²⁸. Vorsichtshalber sollte eine möglichst geringe Laserleistung und eine möglichst kurze Integrationszeit verwendet werden. Dies ist jedoch nicht einfach zu bewerkstelligen, da ein Gleichgewicht zwischen dem Erhalt des gewünschten SERS-Signals und der Vermeidung der Erzeugung von amorphem Kohlenstoff gefunden werden muss.

Die DONAs sind als SM-System sehr vielseitig in Bezug auf die verschiedenen Arten und Formen von Nanopartikeln, die verwendet werden können, wie z. B. Silberkugeln, Goldblumen oder Sterne. Darüber hinaus kann das zu untersuchende Molekül leicht ausgetauscht werden, indem nur der DNA-Strang in der Mitte der Brücke gewechselt wird, ohne dass sich das Verfahren ändert. Der Wechsel zu Proteinen wie Cytochrom C könnte durch einen Pyridin-modifizierten DNA-Fängerstrang in der Brücke erfolgen, der das Cytochrom C bindet und sicherstellt, dass es sich im Hot Spot für SM SERS-Messungen befindet²². Dies bedeutet auch, dass der Laser für die Bestrahlung flexibel ausgewählt werden kann, möglicherweise mit einem Laser, der eine maximale Verbesserung bietet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode zuverlässig ist, um DONA-Strukturen zusammenzusetzen und sie für oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopiemessungen mit Einzelmolekülen zu verwenden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL	Merck	UFC5100BK
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA)	SIGMA Aldrich	T9650
60 nm goldspheres, bare (citrate)	NanoComposix	AUCN60
ACCESS-NC-A AFM probes	SCHAEFER-TEC
Agarose powder	SIGMA Aldrich	9012-36-6
AuNP DNA coating strands	IDT
AuNP DNA coating strands (TAMRA)	SIGMA Aldrich
Glycerol	SIGMA Aldrich	56-81-5
Heraeus Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution	HORIBA
Magnesium chloride	SIGMA Aldrich	7786-30-3
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA)	Metabion
Nanofork DNA staple strands	SIGMA Aldrich
ParafilmM	Carl Roth	CNP8.1
Primus 25 Thermocycler	Peqlab/VWR
Silicon wafer	Siegert wafer	BW14076
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18)	Tilibit nanosystems
TCEP solution	SIGMA Aldrich	51805-45-9