Hidrojel İçinde Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin Fotobiyomodülasyon Ogmentasyonu ile Üç Boyutlu Hücre Kültürü

Özet

Burada, adipoz kaynaklı kök hücre (ADSC) kültürü için üç boyutlu (3D) hücre kültürü çerçevesi olarak hidrojelin kullanımını gösteren ve 3D kültür ortamında ADSC'lerin proliferasyonunu arttırmak için fotobiyomodülasyonu (PBM) tanıtan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Kök hücrelere benzer multipotent mezenkimal özelliklere sahip olan yağ kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler), çok çeşitli hücre farklılaşması kapasiteleri ve göçü, proliferasyonu artırma ve iltihabı hafifletme yetenekleri nedeniyle rejeneratif tıpta sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ADSC'ler, öncelikle elverişsiz enflamatuar koşullar nedeniyle, yaralarda sağkalım ve aşılamada sıklıkla zorluklarla karşılaşırlar. Bu sorunu çözmek için, yaralarda ADSC canlılığını sürdürmek ve yara iyileşme sürecini hızlandırmak için hidrojeller geliştirilmiştir. Burada, fotobiyomodülasyonun (PBM) ADSC proliferasyonu ve sitotoksisite üzerindeki sinerjik etkisini 3 boyutlu hücre kültürü çerçevesinde değerlendirmeyi amaçladık. Ölümsüzleştirilmiş ADSC'ler, 2.5 x 10³ hücre yoğunluğunda 10 μL hidrojellere ekildi ve 5 J /^cm2 ve 10 J /^cm2 akıcılıklarında 525 nm ve 825 nm diyotlar kullanılarak ışınlamaya tabi tutuldu. Morfolojik değişiklikler, sitotoksisite ve proliferasyon, PBM maruziyetinden 24 saat ve 10 gün sonra değerlendirildi. ADSC'ler yuvarlak bir morfoloji sergiledi ve jel boyunca tek tek hücreler veya sferoid agregalar olarak dağıldı. Daha da önemlisi, hem PBM hem de 3D kültür çerçevesi hücreler üzerinde sitotoksik etki göstermezken, PBM ADSC'lerin proliferasyon oranlarını önemli ölçüde arttırdı. Sonuç olarak, bu çalışma, hidrojelin ADSC kültürü için uygun bir 3D ortam olarak kullanımını göstermekte ve PBM'yi, özellikle 3D hücre kültürü ile ilişkili yavaş proliferasyon oranlarını ele alan önemli bir büyütme stratejisi olarak tanıtmaktadır.

Giriş

ADSC'ler, kendi kendini yenileme ve çeşitli hücre soylarına farklılaşma kapasitesine sahip mezenkimal multipotent progenitör hücrelerdir. Bu hücreler, bir lipoaspirasyon prosedürü sırasında yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan (SVF) alınabilir¹. ADSC'ler, rejeneratif tıpta kullanmak için ideal bir kök hücre tipi olarak ortaya çıkmıştır, çünkü bu hücreler bol miktarda bulunur, hasat için minimal invazivdir, kolay erişilebilir ve iyi karakterize edilmiştir². Kök hücre tedavisi, hücre göçünü, proliferasyonu, neovaskülarizasyonu uyararak ve yaralardaki iltihabı azaltarak yara iyileşmesi için olası bir yol sunar

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Protokol, Şekil 1'de grafiksel olarak özetlenmiştir.

1. İki boyutlu (2D) hücre kültürü

NOT: Ölümsüzleştirilmiş ADSC'ler (1 x10⁶ hücreli), 1 mL hücre dondurma ortamı içeren bir kriyoprezervasyon şişesinde sıvı nitrojen içinde -195.8 °C'de saklanır.

1. 2D hücre geri kazanım ortamının ve 2D kültür şişesinin hazırlanması
   1. Bazal ortamın 39 mL'sini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın
   2. Bazal ortamı% 20....

Tartışmalar

ADSC'ler, yara iyileşmesine yardımcı olmak için çeşitli süreçleri uyardıkları için rejeneratif tıp için ideal bir hücre tipidir ^3,4. Bununla birlikte, aşılması gereken birkaç zorluk vardır, örneğin, zayıf hayatta kalma oranları ve bir yaralanma bölgesindeki hücrelerin etkisiz aşılanması⁹. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, birincil hücrelere kıyasla daha fazla nesil boyunca geçebildikleri, hasat edilmeleri ge.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader