광생물조절 증강을 이용한 하이드로겔 내 지방 유래 줄기세포의 3차원 세포 배양

요약

여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

줄기세포와 유사한 다능성 중간엽 특성을 가진 지방 유래 줄기세포(ADSC)는 다양한 세포 분화 능력과 이동, 증식 및 염증 완화 능력으로 인해 재생 의학에 자주 사용됩니다. 그러나 ADSC는 주로 불리한 염증 조건으로 인해 생존 및 상처 내 생착에 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 이 문제를 해결하기 위해 하이드로겔은 상처에서 ADSC 생존력을 유지하고 상처 치유 과정을 촉진하기 위해 개발되었습니다. 여기서는 3D 세포 배양 프레임워크 내에서 ADSC 증식 및 세포 독성에 대한 광생물 조절(PBM)의 시너지 효과를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 불멸화된 ADSC를 2.5 x 10³ 세포 밀도의 10μL 하이드로겔에 파종하고 5J/^cm2 및 10J/^cm2의 유창성으로 525nm 및 825nm 다이오드를 사용하여 조사했습니다. 형태학적 변화, 세포독성 및 증식은 PBM 노출 후 24시간 및 10일에 평가되었습니다. ADSC는 둥근 형태를 나타내며 개별 세포 또는 스페로이드 응집체로 겔 전체에 분산되어 있습니다. 중요한 것은 PBM과 3D 배양 프레임워크 모두 세포에 대한 세포독성 효과가 없는 반면, PBM은 ADSC의 증식률을 크게 향상시켰다는 것입니다. 결론적으로, 이 연구는 ADSC 배양에 적합한 3D 환경으로 하이드로겔을 사용하는 것을 보여주고, 특히 3D 세포 배양과 관련된 느린 증식 속도를 해결하는 중요한 증식 전략으로 PBM을 소개합니다.

서문

ADSC는 자가 재생 및 여러 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가진 중간엽 다분화능 전구 세포입니다. 이들 세포는 지방 흡인 절차 중 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF)에서 채취할 수 있다¹. ADSC는 줄기세포가 풍부하고, 채취가 최소한으로 침습적이며, 쉽게 접근할 수 있고, 특성이 우수하기 때문에 재생 의학에 사용하기에 이상적인 줄기세포 유형으로 부상하고^{있습니다 2}. 줄기세포 치료는 세포 이동, 증식, 신생혈관 형성을 자극하고 상처 내 염증을 감소시킴으로써 상처 치유를 위한 가능한 방법을 제공한다 ^3,4. ADSC의 재생 능력의 약 80%는 분비체를 통한 파라크린 신호전달에 기인한다⁵. 이전에는, 줄기세포 또는 성장인자를 손상된 조직에 직접 국소적으로 주입하는 것이 충분한 생체 내 복구 메커니즘을 불법화할 수 있다고 제안되었다 ^6,7,8. 그러나 이 접근법은 염증 환경으....

프로토콜

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 프로토콜은 그림 1에 그래픽으로 요약되어 있습니다.

1. 2차원(2D) 세포 배양

참고: 불멸의 ADSC(1 x10⁶ 세포)는 -195.8°C에서 1mL의 세포 동결 배지가 들어 있는 동결 보존 바이알에 액체 질소로 보관됩니다.

1. 2D 세포 회수 배지 및 2D 배양 플라스크 준비
   1. 39mL의 기초 배지를 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
   2. 20% 소 태아 혈청(FBS, 10mL)과 항생제(1mL)(0.5mL 페니실린-스트렙토마이신 및 0.5mL 암포테리신 B)로 기초 배지를 농축합니다.
   3. 6mL의 세포 회수 배지를 플라스크에 옮겨 T75 플라스크를 사전 컨디셔닝하고 37°C, 5% CO₂ 및 85% 습도에서 45분 동안 배양합니다(시간 절약을 위해 세포 회수 단계를 수행하는 동안 수행할 수 있음).
      알림: 사용하기 전에 전체 매체를 37°C로 데우고 최대 4주일 동안....

토론

ADSC는 상처 치유를 돕기 위해 다양한 과정을 자극하기 때문에 재생 의학에 사용하기에 이상적인 세포 유형입니다 ^3,4. 그러나, 예를 들어, 낮은 생존율과 손상 부위에 세포의 비효율적인 생착과 같은 몇 가지 문제를 피해야 한다⁹. 불멸화된 세포는 일차 세포에 비해 더 많은 세대에 걸쳐 전달될 수 있고, 수확할 필요가 없으며, 특성화가 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader