Dreidimensionale Zellkultur von aus Fett gewonnenen Stammzellen in einem Hydrogel mit Photobiomodulationsaugmentation

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Verwendung von Hydrogel als dreidimensionales (3D) Zellkulturgerüst für die ADSC-Kultur (Adipose-Derived Stem Cells) demonstriert und Photobiomodulation (PBM) einführt, um die Proliferation von ADSCs innerhalb der 3D-Kulturumgebung zu verbessern.

Zusammenfassung

Aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die multipotente mesenchymale Eigenschaften ähnlich wie Stammzellen besitzen, werden häufig in der regenerativen Medizin eingesetzt, da sie eine Vielzahl von Zelldifferenzierungen ermöglichen und die Migration und Proliferation verbessern und Entzündungen lindern können. ADSCs stehen jedoch oft vor Herausforderungen beim Überleben und der Transplantation in Wunden, vor allem aufgrund ungünstiger entzündlicher Bedingungen. Um dieses Problem anzugehen, wurden Hydrogele entwickelt, um die Lebensfähigkeit von ADSC in Wunden zu erhalten und den Wundheilungsprozess zu beschleunigen. Hier wollten wir den synergistischen Einfluss der Photobiomodulation (PBM) auf die ADSC-Proliferation und Zytotoxizität innerhalb eines 3D-Zellkulturrahmens bewerten. Immortalisierte ADSCs wurden in 10-μl-Hydrogele mit einer Dichte von 2,5 x 10³ Zellen ausgesät und mit 525-nm- und 825-nm-Dioden bei Fluenzen von 5 J/^cm2 und 10 J/^cm2 bestrahlt. Morphologische Veränderungen, Zytotoxizität und Proliferation wurden 24 Stunden und 10 Tage nach der PBM-Exposition bewertet. Die ADSCs wiesen eine abgerundete Morphologie auf und waren als einzelne Zellen oder Sphäroidaggregate über das Gel verteilt. Wichtig ist, dass sowohl PBM als auch 3D-Kulturrahmen keine zytotoxischen Wirkungen auf die Zellen zeigten, während PBM die Proliferationsraten von ADSCs signifikant erhöhte. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Verwendung von Hydrogel als geeignete 3D-Umgebung für die ADSC-Kultur und führt PBM als signifikante Augmentationsstrategie ein, die insbesondere die langsamen Proliferationsraten im Zusammenhang mit 3D-Zellkulturen berücksichtigt.

Einleitung

ADSCs sind mesenchymale multipotente Vorläuferzellen mit der Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und in mehrere Zelllinien zu differenzieren. Diese Zellen können während eines Lipoaspirationsverfahrens aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) des Fettgewebes entnommen werden¹. ADSCs haben sich als idealer Stammzelltyp für den Einsatz in der regenerativen Medizin herausgestellt, da diese Zellen reichlich vorhanden, minimalinvasiv zu ernten, leicht zugänglich und gut charakterisiert sind². Die Stammzelltherapie bietet einen möglichen Weg zur Wundheilung, indem sie die Zellmigration, Proliferation, Neovaskularisation stim....

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden. Das Protokoll ist in Abbildung 1 grafisch zusammengefasst.

1. Zweidimensionale (2D) Zellkultur

HINWEIS: Immortalisierte ADSCs (1 x10⁶ Zellen) werden bei -195,8 °C in flüssigem Stickstoff in einem Kryokonservierungsfläschchen mit 1 ml Zellgefriermedium gelagert.

1. Vorbereitung des 2D-Zellrückgewinnungsmediums und des 2D-Kulturkolbens
   1. 39 ml des Basalmediums in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen....

Diskussion

ADSCs sind ein idealer Zelltyp für die regenerative Medizin, da sie verschiedene Prozesse stimulieren, um die Wundheilung zu unterstützen ^3,4. Es gibt jedoch mehrere Herausforderungen, die umgangen werden müssen, z. B. schlechte Überlebensraten und eine ineffektive Transplantation der Zellen an einer Verletzungsstelle⁹. Immortalisierte Zellen wurden als kommerziell erhältliche Zelllinie verwendet, da sie im Vergleich zu Primärzellen .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader