Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, birincil insan yumurtalık yüzey epitel (hOSE) hücrelerinden üç boyutlu (3D) doku organoidlerinin oluşturulmasını açıklar. Protokol, yeni toplanan yumurtalıklardan hOSE'nin izolasyonunu, hOSE'nin hücresel genişlemesini, kriyoprezervasyon-çözme prosedürlerini ve organoid türevini içerir. İmmünofloresan, kantitatif analiz ve bir tarama platformu olarak sergileme yardımcı programı dahildir.

Özet

Yumurtalığın en dış tabakası olan yumurtalık yüzey epiteli (OSE), her yumurtlama sırasında yırtılmaya uğrar ve yumurtalık bütünlüğünü sağlarken yumurtalık yara iyileşmesinde çok önemli bir rol oynar. Ek olarak, OSE epitelyal yumurtalık kanserlerinin kaynağı olarak hizmet edebilir. OSE rejeneratif özellikleri farelerde iyi çalışılmış olmasına rağmen, insan yumurtalıklarındaki doku onarımının kesin mekanizmasının anlaşılması, insan yumurtalıklarına sınırlı erişim ve uygun in vitro kültür protokolleri nedeniyle engellenmektedir. Orijinal organın hem yapısal hem de fonksiyonel yönlerini kopyalayan minyatür in vitro modeller olan dokuya özgü organoidler, organ fizyolojisi, hastalık modellemesi ve ilaç testi çalışmaları için yeni fırsatlar sunar.

Burada, birincil insan OSE'sini (hOSE) tüm yumurtalıklardan izole etmek ve hOSE organoidleri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Donörler arasındaki heterojenliği gösteren morfolojik ve hücresel bir karakterizasyon dahil ediyoruz. Ek olarak, bu kültür yönteminin 2 haftalık bir süre boyunca OSE-organoid büyümesi üzerindeki hormonal etkilerini değerlendirme kapasitesini gösteriyoruz. Bu yöntem, OSE rejenerasyonuna katkıda bulunan faktörlerin keşfedilmesini sağlayabilir ve malign OSE için hastaya özgü ilaç taramalarını kolaylaştırabilir.

Giriş

Yumurtalık, vücuttaki en dinamik organlardan biri olarak kabul edilir ve bireyin üreme ömrü boyunca sürekli yara iyileşmesi ve yeniden şekillenme döngülerinden geçer. Her yumurtlama döngüsünden sonra yumurtalık dokusunun yenilenmesinde rol oynayan ana oyuncu yumurtalık yüzey epitelidir (OSE)1. OSE, tüm yumurtalık yüzeyini kaplayan düz, küboidal ve kolumnar epitel hücreleri içeren mezotelyum türevi tek bir tabakadır2. Yumurtlamadan önce, yumurtlama folikülünün yüzeyindeki yumurtalık stromal dokusu, kümülüs-oosit kompleksinin salınmasına izin vermek için proteolitik bozulmaya uğrar. Yumurtlama stigması olarak bilinen yaralı bölge daha sonra onarılır ve farelerde 72 saatten daha kısa bir sürede yumurtalık yüzeyinin tamamen kapanması sağlanır3. OSE'nin yumurtlama yarasını çoğaltma ve kapatma konusundaki yüksek verimli kapasitesi, yerleşik bir kök hücre popülasyonunun varsayılan varlığını vurgulamaktadır4. İnsan yumurtalıklarının üreme çağındaki donörlerden sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, OSE onarımının mekanizmaları hakkındaki bilgilerin çoğu hayvan modellerinden gelmektedir. Bununla birlikte, türe özgü özellikler, hayvan temelli yumurtalık araştırmalarından insanlara geçişi engellemektedir5.

İn vitro çalışmalar ağırlıklı olarak insan OSE'nin 2 boyutlu (2D) hücre kültürünü kullanmıştır, bu sayede hücreler, maliyet etkinliği ve kolay kültürü nedeniyle bir kültür plakasının yüzeyine tutturulmuş tek tabaka halinde büyümüştür 6,7,8. Bununla birlikte, bu yaklaşımın yumurtalık dokusu dinamiklerininkarmaşıklığını kopyalayan sınırlamaları vardır 9. Bu bağlamda, yumurtalık organoidlerine özel olarak odaklanan 3D hücre kültürü platformları, yumurtalık araştırmalarında devrim yaratmıştır10. Doku organoidleri, türetildikleri organın minyatür in vitro temsilleridir, 3 boyutlu kendi kendine organizasyon kapasitesi sergiler ve in vivo muadillerinin temel işlevlerini ve yapılarını taklit eder11. Bu teknoloji, insan yumurtalığında gelişim, rejenerasyon ve doku onarımı ile ilgili temel sorulara ışık tutma imkanı sunar10. Son yıllarda, araştırmacılar, hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıp için hastaya özgü yumurtalık kanseri (OC) organoidlerinin üretilmesi için yumurtalık organoidleri hakkındaki bilgileri de uyguladılar 12,13,14.

Fare OSE organoidleri ve fallop tüpü (FT) organoidleri15,16 ile insan OSE organoidleri12 ve FT organoidleri17'nin üretilmesi için kullanılan farklı yöntemlere dayanarak, burada insan OSE organoidlerinin insan yumurtalıklarından türetilmesi için bir protokol açıklıyoruz ve OSE rejenerasyon çalışmalarında potansiyel uygulamalar sunuyoruz. Bu protokol, birincil OSE hücrelerini tüm insan yumurtalıklarından verimli bir şekilde izole eder ve 2D hücre genişlemesi ve 3D hOSE organoid üretiminin adım adım tanımını içerir. HoSE organoidleri, morfoloji ve büyümede (donöre özgü) değişkenlik gösterdi ve kişiselleştirilmiş çalışmalar için faydalarını vurguladı. Ek olarak, bu protokol aynı kültür plakası içinde hOSE organoid bakımı, pasajı ve immünofloresan içerir. Ayrıca, hOSE organoidlerinin benimseyebileceği farklı morfolojinin bir tanımını sağlar ve kültür sırasında immünofenotip değişikliklerini karakterize eder. Son olarak, yumurtalık hormonları gibi çevresel ipuçlarının, hOSE organoid sayısı ve boyutuna bağlı olarak hOSE organoid oluşumu ve büyümesi üzerindeki etkisini araştırarak faydayı göstermektedir.

HoSE organoid teknolojisinin uygulanması, olağanüstü rejeneratif kapasitesinden sorumlu mekanizmalara özel bir vurgu yaparak, yumurtalık hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir. 3D insan yumurtalık modelleri gelişmeye devam ettikçe, yumurtalık araştırmalarında hayvan modellerine olan bağımlılık azalacak ve rejeneratif tıp alanında yenilikçi tedavilere yol açacaktır18.

Protokol

Çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin yönergelerine göre yürütülmüştür. Çalışma tasarımı Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi (LUMC) Tıbbi Etik Kurulu'na sunulmuş ve çalışma öncesinde itiraz edilmediğine dair bir yazı (B18.029) alınmıştır. Kullanılan birincil insan yumurtalık dokusu, VUmc hastanesinde (Amsterdam, Hollanda) cinsiyeti onaylayan cerrahi geçiren transmaskülin insanlardan toplandı. Tüm bağışçılardan imzalı bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. İnsan birincil OSE hücre izolasyonu

  1. Ooferektomiyi takiben, yumurtalıkları% 0.9 NaCl veya benzeri steril tuzlu su çözeltisine yerleştirin ve buz üzerinde laboratuvara taşıyın.
  2. Tek tek yumurtalıkları 2-3 mL sindirim ortamı (Tablo 1) veya yumurtalığı kaplayacak kadar içeren 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
    DİKKAT: Yumurtalık sağlam değilse (organın bir kısmı histolojik analiz için kesilmişse), bu kısmı sindirim ortamı ile kapatmamak çok önemlidir.
  3. Tüpü önceden ısıtılmış boncuk banyosuna (veya su banyosuna) 37 °C'de 30 dakika boyunca yerleştirin.
  4. Yumurtalığı dikkatlice 10 mL toplama ortamı içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın (Tablo 1).
  5. HOSE hücrelerini içeren yumurtalık yüzeyini bir hücre kazıyıcı kullanarak nazikçe kazıyın. Sıyırıcıyı orta ortamda yıkayın ve bu adımı en az üç kez tekrarlayın (Şekil 1).
    DİKKAT: Yumurtalık sağlam değilse, istenmeyen hücre tipleriyle kontaminasyonu en aza indirmek için hasarlı alanı hem kazımaktan hem de suya batırmaktan kaçının.
  6. Toplama ortamındaki hOSE hücrelerini 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  7. HOSE hücrelerini 5 dakika boyunca 240 x g'da döndürün.
    1. Pelet, kırmızı kan hücreleri (RBC) ile kontaminasyonun göstergesi olan kırmızı bir renk gösteriyorsa, peleti 1 mL RBC lizis tamponu ile yeniden süspanse edin. Ara sıra pipetleme ile oda sıcaklığında (RT) 3 dakika inkübe edin, kalsiyum ve magnezyum (PBS+/+) içeren 4 mL PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 240 x g'da santrifüjleyin. RBC devam ederse, bu adımı tekrarlayın.
  8. HoSE hücre peletini kriyoprezervasyon yapın (Bölüm 2), 2D kültür (Bölüm 3) veya 3D organoidler (Bölüm 4) için kullanın (Şekil 1).

2. HoSE hücrelerinin kriyoprezervasyonu-çözülmesi

  1. Kriyoprezervasyon
    1. HoSE hücre peletini 1 mL hücre dondurma ortamında yeniden süspanse edin.
    2. Hücre süspansiyonunu kriyoviallere aktarın (yumurtalık başına 2x kriyovial).
    3. Kriyovialleri bir dondurma kabına koyun ve gece boyunca -80 °C'de bekletin.
    4. Dondurulmuş kriyoviyalleri uzun süreli saklama için sıvı nitrojen tankına aktarın.
  2. Çözdürme:
    1. Kriyoviali sıvı nitrojenden çıkarın.
    2. Kriyoviali önceden ısıtılmış bir boncuk banyosuna (veya su banyosuna) 37 °C'de 5 dakika boyunca veya kriyoviyalin içinde sadece küçük bir donmuş çekirdek görünene kadar yerleştirin.
    3. HOSE hücre süspansiyonunu 10 mL toplama ortamı olan 15 mL'lik bir tüpe pipetleyin (Tablo 1).
    4. 5 dakika boyunca 240 x g'da santrifüjleyin.
    5. 2D kültür (Bölüm 3) veya 3D organoidler (Bölüm 4) için hOSE hücre peletini kullanın.

3. Tek tabakada 2D hOSE kültürü

  1. HOSE peletini 1 mL OSE_2D besiyerinde (Tablo 1) yeniden süspanse edin ve 12 oyuklu bir plakadan bir oyuğa aktarın.
  2. Kuyucuğa 1 mL fazladan OSE_2D ortamı ekleyin ve hOSE hücrelerinin ilk ortam değişiminden önce yapışmasını sağlamak için nemlendirilmiş bir inkübatörde (%5 CO2) 37 ° C'de 72 saat boyunca kültürleyin.
  3. HoSE hücreleri %70-90 birleşmeye (P0) ulaşana kadar ortamı her 2-3 günde bir yenileyin (Şekil 2A).
    NOT: Kültürde RBC'ler hala mevcutsa, ilk ortam değişikliği sırasında çıkarılacaklar ve sadece hOSE hücreleri kuyuya bağlı kalacaktır.
  4. HOSE hücrelerini geçirmek için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
    1. Kültür ortamını kuyudan çıkarın.
    2. 1 mL steril PBS ile yıkayın.
    3. PBS'yi çıkarın ve hücreleri kaplamaya yetecek kadar% 0.05 Tripsin / EDTA ekleyin.
    4. Plakayı 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre (% 5 CO2) 4-7 dakika boyunca hücrelerin yuvarlandığını ve kuyudan ayrıldığını fark edene kadar yerleştirin.
    5. 1 mL toplama ortamı ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
    6. HOSE hücrelerini toplayın ve 5 dakika boyunca 240 x g'da santrifüjleyin.
    7. İstenilen yoğunlukta yeni kuyucukta tohum hücreleri, hOSE hücreleri% 70 -% 90 birleşmeye ulaşana kadar her 2-3 günde bir ortamı yenileyin ve adım 3.4'ü tekrarlayın.
      NOT: Birincil hOSE hücreleri üç pasaja kadar kültürlenebilir. Daha sonra hücrelerin çoğu yaşlanacaktır (Şekil 2A).
  5. Kültür ortamının etkilerini test etmek için immünofloresan (Şekil 2B) (Şekil 2B) veya 3D organoidler (Bölüm 4) kullanarak daha fazla karakterizasyon için genişletilmiş hOSE hücrelerini kullanın.

4. 3D hOSE organoid kültürü

  1. 37 °C'de önceden ısıtılmış çok kuyulu odacıklı sürgü.
  2. Otomatik bir hücre sayacı ile veya bir hemositometre ile manuel olarak (yeni izole edilmiş veya dondurulmuş-çözülmüş) hOSE hücrelerini sayın.
  3. İstenilen sayıda hOSE hücresini 1.5 mL'lik bir tüpte 1 mL buz gibi soğuk OSE organoid bazik ortama (Tablo 1) yeniden süspanse edin.
  4. 5 dakika boyunca 240 x g'da santrifüjleyin.
  5. 1 x 104 hücre / 10 μL BME'lik bir hücre konsantrasyonu elde etmek için hOSE peletini istenen miktarda buz gibi seyreltilmemiş bazal membran özü (BME) çözeltisinde yeniden süspanse edin.
  6. Homojen dağılımı sağlamak için hOSE-BME çözeltisini yukarı ve aşağı pipetleyin.
  7. Önceden ısıtılmış çok kuyulu odacıklı slaytta oyuk başına 10 μL hOSE-BME çözeltisi damlacıkları yapın.
    NOT: Bir damla şekli elde etmek için her damlacığın kuyunun merkezinde olduğundan emin olun.
  8. Jel katılaşmasına izin vermek için plakayı damlacıklar 37 °C'de baş aşağı olacak şekilde nemlendirilmiş bir inkübatöre (%5 CO2) 15 dakika boyunca yerleştirin.
  9. 100 μL OSE_3D ortamı ekleyin (Tablo 1) ve nemlendirilmiş bir inkübatörde (% 5 CO2) 37 ° C'de kültürleyin.
  10. Ortamı her 3-4 günde bir yenileyin.
    NOT: hOSE organoidleri kültürde en az 28 güne kadar büyümeye devam eder (Şekil 3A, B), ancak hücre proliferasyonunu ve organoid sağkalımını uyarmak için her 14-28 günde bir geçiş (büyüme hızı donöre bağlıdır, kriyo hOSE'ye karşı tazedir) tavsiye edilir. Üç bağımsız hOSE organoid hattı, yaşlanma belirtisi olmadan en az 4 kez geçildi. hOSE organoidleri farklı morfolojiler gösterir (Şekil 3C).
  11. ESOSE organoidlerini geçirmek için:
    1. Ortamı çıkarın ve her oyuğa 100 μL buz gibi gelişmiş DMEM / F12 ekleyin.
    2. Jel damlacıklarını ayırmak için kuyucukların dibini bir P1000 pipet ucuyla kazıyın.
    3. Her yüzen jel damlacığını 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
    4. Tüpleri jel damlacıkları ile 240 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı çıkarın, peleti 300 μL hücre ayrışma tamponunda yeniden süspanse edin ve tüpleri 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de önceden ısıtılmış bir boncuk banyosuna (veya su banyosuna) yerleştirin.
      NOT: Bazı organoidler sağlam kalırsa, onları mekanik olarak bozmak için fetal sığır serumu kaplı, buz gibi pipet ucuyla birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Pipet uçlarının fetal sığır serumu ile kaplanması, organoidlerin uca yapışmasını önler.
    6. 300 μL hOSE organoid bazik ortam ekleyin ve 5 dakika boyunca 240 x g'da santrifüjleyin.
    7. Peletleri istenen miktarda seyreltilmemiş BME çözeltisi içinde yeniden süspanse edin, uygun bir oranda yeniden tohumlayın (1 damlacık içeriğini 1-4 damlacığa dağıtın) ve yukarıda belirtildiği gibi kültürleyin.
      NOT: Organoidler tek hücrelere ayrışmaz ve bu nedenle hücreler daha sonraki geçiş için doğru bir şekilde sayılamaz.

5. 3D hOSE organoidlerinin tam montajlı immünofloresan

NOT: Mikroskopi tekniklerine uygun çok kuyulu odacıklı slaytlar kullanılıyorsa, tam montajlı immünofloresan aynı kültür kuyusunda (damlacık içinde) gerçekleştirilebilir.

  1. Damlacıklardaki hOSE organoidlerini RT'de 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin.
  2. Dönen/sallanan bir platformda RT'de 5 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
  3. RT'de 15 dakika boyunca 100 μL geçirgenlik tamponu (Tablo 1) kullanarak damlacıklardaki hOSE organoidlerini geçirgenleştirin.
  4. RT'de 15 dakika boyunca 100 μL bloke edici tampon (Tablo 1) ile üç kez yıkayın ve dönen/sallanan bir platformda 4 ° C'de gece boyunca (o / n) bloke edin.
  5. Dönen/sallanan bir platform üzerinde 4 °C o / n'de bloke edici tampon içinde seyreltilmiş 100 μL primer antikor karışımı ile inkübe edin.
    NOT: Kullanılan birincil antikorların listesi, işaretlenen hücre tipi ve 12,19,20,21,22,23,24,25 ifadesini doğrulamak için kullanılan hayvan modeli için Malzeme Tablosuna bakın.
  6. Plakayı RT'ye getirin ve dönen/sallanan bir platform üzerinde RT'de 15 dakika boyunca 100 μL engelleme tamponu ile üç kez yıkayın.
  7. Dönen / sallanan bir platform üzerinde RT'de 2 saat boyunca bloke edici tampon içinde seyreltilmiş 100 μL ikincil antikor karışımı ile inkübe edin, ancak ışıktan korunun.
    NOT: Kullanılan ikincil antikorların bir listesi için Malzeme Tablosuna bakınız. Işıktan korumak için plakayı karanlık bir kutunun içine yerleştirin veya alüminyum folyo ile kaplayın.
  8. Dönen/sallanan bir platformda RT'de 15 dakika boyunca 100 μL PBS'de üç kez yıkayın.
  9. Görüntülemeye kadar plakayı 4 °C'de alüminyum folyo ile kaplı olarak saklayın (Şekil 4).

6. HOSE organoid boyutunun ölçülmesi

  1. Mikroskopta 10x parlak alan resimleri (TIFF görüntüsü) çekin.
  2. Fiji'yi indirin ve yükleyin (https://imagej.net/software/fiji/)26.
  3. ImageJ yazılımı Fiji ile hOSE organoidlerinin görüntü alanını ölçün:
    1. Fiji'de görüntü TIFF dosyalarını yükleyin.
    2. Yazılımın yüklenen parlak alan görüntüsündeki hOSE organoidlerini (daha koyu alan) tanıması için bir eşik oluşturun > Görüntü > Eşiğini Ayarlayın. Arka planın çoğu kaldırılana ve tek tek organoidler tutulana kadar aşağıdaki ve yukarıdaki değerleri ayarlayın.
    3. ROI aracını açmak için ROI aracını açın > Aracını Analiz Et > ROI'ye tıklayın.
    4. Değnek aracını seçin ve tüm organoid çevresini çevreleyen sarı bir çizgi görene kadar bir hOSE organoidi olan bölgeye tıklayın. ROI panelinde, söz konusu OSE organoidinin alan değerini elde etmek için Ekle ve Ölç'e tıklayın.
    5. Adım 6.3.4'ü tekrarlayın. ölçülecek her hOSE organoidi için.

Sonuçlar

2D hOSE kültürü
Taze izole edilen hOSE hücreleri 12 oyuklu bir plaka üzerine kaplandı ve 3 hafta boyunca kültürlendi. Bu süre zarfında, hücreler üç kez geçti (Şekil 2A). Kültürdeki primer hOSE hücreleri, pasaj 3'e (P3) kadar parke taşı benzeri bir morfoloji sergiledi, ancak daha sonra yaşlanma belirtileri göstermeye başladı, önceki sonuçlara göre, sınırlı süre hOSE'nin geçebileceğini bildiren27. Ayrıca, murin OSE'nin in vitro olarak epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) uğradığı ve aktin hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi ve kollajen I19'un birikmesi gibi fibroblast benzeri özellikler gösterdiği gösterilmiştir. Anlaşmaya göre, ACTA2 + CD44 + hOSE, P2 ve P3 arasında COL1A1'in belirgin bir şekilde yukarı regülasyonunu gösterdi (Şekil 2B), bu da hOSE hücrelerinin kültür sırasında EMT'ye maruz kaldığını düşündürdü.

TGF-β sinyali, çeşitli epitel hücre tiplerinde29 EMT'yi indükleyebilen EMT28'in ana düzenleyicisidir. TGF-β OSE_2D ortamına eklenmemiş olmasına rağmen, eklenen FBS bu sitokinin saptanabilir seviyelerini içerebilir30,31. Bu nedenle, TGF-β inhibitörü tip I reseptörü SB-431542'nin eklenmesinin EMT'yi önleyip önleyemeyeceğini ve uzun süreli 2D kültüre izin verip vermeyeceğini test ettik. Şaşırtıcı bir şekilde, OSE_2D ortamının 10 μM SB-43154232ile takviyesi hücre proliferasyonunu engelledi (Şekil 2C). TGF-β sinyalizasyonunun OSE proliferasyonu için gerekli olduğu sonucuna vardık ve inhibitör olmadan daha fazla 2D kültür deneyi yapıldı.

3D hOSE organoid kültürü
İnsan OSE organoidlerini12 büyütmek için yayınlanmış kültür koşullarına dayanarak, BME damlacıklarına gömülü ve 28 güne kadar OSE_3D ortamda (standart 100 nM estradiol konsantrasyonu içeren) büyüttük. 7 gün içinde, yeni izole edilmiş OSE hücrelerinden türetilen birçok hOSE organoidi, ortalama 130 mm çapında kistik idi (Şekil 3A, B). Bu sonuçlar, Kopper ve meslektaşları tarafından kıyılmış ve enzimatik olarak sindirilmiş insan yumurtalık dokusundan hOSE organoidlerinin türetilmesi üzerine bildirilenlere benzerdi12. İlginç bir şekilde, taze izole edilmiş OSE hücrelerinden türetilen hOSE organoidleri, kültürde 14 gün sonra 2D genleşmiş OSE hücrelerinden (ortalama çap 100 mm) hOSE organoidlerinden daha büyük (ortalama 160 mm çap) büyüdü (Şekil 3B), muhtemelen 2D genleşmiş OSE hücrelerinin proliferasyonu azaltma eğilimi nedeniyle. Ayrıca, birçok 3D hOSE organoidi, düz epitel hücrelerinin tek tabakasından oluşurken (Şekil 3C sol üst panel), bazıları küboidal bir tek hücre tabakası sergiledi (Şekil 3C sağ üst panel), diğerleri çok katmanlıydı (Şekil 3C alt sağ panel) veya lümenize olmayan bir hücre kümesi oluşturdu (Şekil 3C sol alt panel).

HoSE organoidlerinin OSE_2D ortamı kullanılarak da türetilip türetilemeyeceğini test etmek için, taze izole edilmiş hOSE hücreleri BME damlacıklarına gömüldü ve 12 gün boyunca OSE_2D ortamda büyütüldü. 6 gün sonra, iğ benzeri hücreler görüldü, bu da hOSE hücrelerinin damlacıklarda EMT'ye maruz kaldığını düşündürdü. Daha da önemlisi, OSE_2D ortamı kullanılarak hiçbir hOSE organoidi oluşturulmamıştır (Şekil 3D).

HoSE organoidlerinin hücresel özellikleri
İnsan yetişkin yumurtalığında, keratin 8 (KRT8) özellikle OSE popülasyonunu işaretler (Şekil 4A) ve buna göre, hOSE organoidleri hücre kimliklerini doğrulayarak KRT8 ekspresyonunu korumuştur (Şekil 4B). Fare OSE hücrelerinde, Yes1 ile ilişkili proteinin (YAP1) nükleer lokalizasyonu, yumurtlamadan sonra yaralı alanı genişletebilen ve iyileştirebilen OSE kök / progenitör hücreleri ile spesifik olarak ilişkilendirilmiştir24,33. YAP, boyutlarından bağımsız olarak hOSE organoidlerindeki hücrelerin çoğunda nükleer lokalizasyon gösterdi (Şekil 4B). CD4420 ve LGR522 gibi fare OSE hücrelerinde eksprese edildiği bildirilen diğer belirteçler de araştırılmıştır. İlginç bir şekilde, hem CD44 hem de LGR5, küçük hOSE organoidlerinde (<100 μm çap) eksprese edilirken, daha büyük organoidlerde, CD44 ve LGR5 aşağı regüle edilmiş gibi görünüyordu (Şekil 4B).

Daha sonra, hOSE organoidlerinin BME'ye gömülü organoidlerde (apikal) tipik olarak gözlenen apikal-bazal polariteyi gösterip göstermediğini araştırdık (apikal)34. Bazolateral protein integrin beta 1 (ITGB1) ve apikal protein podokaliksin (PODXL), hOSE organoidlerindeki hücre polaritesini göstermek için kullanıldı ve hOSE organoid boyutundan bağımsız olarak net bir apikal polariteyi doğruladı (Şekil 4B).

İnsan OSE'sinin mezenkimal belirteç N-kaderini (CDH2) eksprese ettiği bilinirken, epitelyal belirteç E-kaderin (CDH1) ekspresyonu kolumnar OSE hücreleri ile sınırlıdır (Şekil 4A)2. İlginç bir şekilde, bu çalışmada türetilen hOSE organoidleri mezenkimal belirteçler CDH2 ve vimentin (VIM) eksprese etti ve küboidal / kolumnar epiteli olan büyük kistik hOSE organoidleri hem CDH1 + hem de CDH2 + VIM + idi (Şekil 4C). CDH1+ hOSE organoidlerinin primer CDH1+ OSE hücrelerinden mi yoksa in vitro25,35 epitelyal farklılaşma veya (neoplastik) transformasyon geçiren CDH1-OSE hücrelerinden mi türetildiği belirsizliğini korumaktadır.

HOSE organoidlerinin kullanımının sergilenmesi: yumurtlama ipuçlarının hOSE organoidleri üzerindeki etkisi
Folikül uyarıcı hormon ve insan koryonik gonadotropin hormonları foliküler büyümeyi ve yumurtlamayı indüklemek için kullanılabilirken, yumurtlamadan sonra progesteron ve estradiol36 gibi yumurtalık tarafından üretilen hormonların konsantrasyonunda belirgin bir artış olur. HoSE organoidlerinin bir tarama platformu olarak kullanılabilirliğini göstermek için, bu hormonların hOSE organoidleri üzerindeki etkisini, organoidlerin sayısını ve boyutunu kantitasyon çıktısı olarak kullanarak (Fiji kullanarak) inceledik. Bunun için östradiol içermeyen (hormonsuz) OSE_3D ortamda ve farklı konsantrasyonlarda FSH, hCG, estradiol veya progesteron içeren OSE_3D ortamda hOSE organoidleri elde ettik (Şekil 5A).

3 farklı donörden (n = 3) kriyoprezervasyonla korunmuş-çözülmüş (genleşmemiş) hOSE hücrelerinden türetilen hOSE organoidlerinin sayısı, 7 günlük kültürden sonra damlacık başına ölçüldü (Şekil 5A, B). Kültür medyası her 3 günde bir değiştirildi. Orta içeren hormonlarda oluşan damlacık başına toplam hOSE organoid sayısında, hormonsuz ortama kıyasla anlamlı bir fark gözlenmemiştir (Şekil 5A, B). Hormonların organoid boyutu üzerindeki etkisini ölçmek için, kültürde 14 gün sonra, her damlacık (her koşuldan) görüntülendi ve en büyük 4 hOSE organoidinin alanı Fiji kullanılarak ölçüldü. İlginç bir şekilde, progesteron (1000 nM) veya estradiol (200 nM) varlığında iki farklı donörden (n = 2) hOSE organoidleri üretmek, damlacık başına en az bir çok büyük organoid (yaklaşık 700 μm çapında) ile sonuçlanmıştır (Şekil 5C, D).

figure-results-8177
Şekil 1: Tüm yumurtalıklardan hOSE hücrelerinin izolasyonunun şematik gösterimi. Yumurtalıklar 37 ° C'de 30 dakika boyunca sindirim çözeltisi içinde inkübe edildi. hOSE hücreleri, nazikçe kazınarak yumurtalık yüzeyinden ayrıldı ve ardından kriyoprezervasyon, tek tabaka halinde doğrudan 2D OSE kültürüne kaplandı veya 3D hOSE organoid kültürü için bazal membran ekstraktına (BME) gömüldü. Dondurularak çözülmüş hOSE hücreleri, 2D kültür veya 3D organoid oluşumu için kullanılabilir ve 2D genişletilmiş hOSE hücreleri, 3D hOSE organoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9122
Şekil 2: hOSE hücrelerinin 2 boyutlu primer kültürü. (A) Tipik epitelyal parke taşı morfolojisini gösteren 0 (P0), 2 (P2) ve 3 (P3) pasajlarındaki hOSE hücrelerinin parlak alan görüntüleri. Ölçek çubukları üst panellerde 750 μm ve alt panellerde 125 μm'dir. (B) P2 ve P3'te 2D hOSE hücrelerinde ACTA2, CD44, COL1A1 için immünofloresan. Ölçek çubukları 50 μm'dir. (C) P0, P2 ve P3'te 10 μM SB-431542 ile kültürlenen hOSE hücrelerinin parlak alan görüntüleri. Hücreler P2'den yaşlanma belirtileri gösterdi ve kültür sırasında yüksek birleşmeye ulaşmadı. Ölçek çubukları üst panellerde 750 μm ve alt panellerde 125 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10167
Şekil 3: HOSE organoidlerinin morfolojik karakterizasyonu. (A) Üç farklı donörden (tOVA86, tOVA87, tOVA88) üç bağımsız hOSE organoid türevinin parlak alan görüntüleri. Görüntüler hücre gömme (D0), 7. gün (D7), 14. gün (D14) ve 28. gün (D28) kültürden sonra çekildi. Ölçek çubukları D0'da 750 μm ve geri kalanı için 50 μm'dir. (B) Yeni izole edilmiş hOSE hücrelerinden (kesikli çizgi) ve 2D genişlemiş hOSE hücrelerinden (düz çizgi) türetilen hOSE organoidlerinin çapı. Gösterilen, D0, D7 ± D14'te ölçülen ortalama boyut ve standart sapmadır. İki farklı donörden (tOVA88 ve tOVA89) elde edilen sonuçlar gösterilmektedir. (C) Farklı morfolojileri gösteren hOSE organoidlerinin parlak alan görüntüleri: tek düz katman (sol üst), tek sütunlu katman (sağ üst), çok katmanlı (sağ alt) ve lümenize edilmemiş hücre agregası (sol alt). Ölçek çubukları 100 μm'dir. (D) BME'ye gömülü ve OSE_2D ortamı ile 12 gün boyunca kültürlenmiş hOSE hücrelerinin parlak alan görüntüleri. Görüntüler hücre gömme (D0), 6. gün (D6), 9. gün (D9) ve 12. gün (D12) sonrasında çekildi. Fibroblast benzeri hücreler kültürü ele geçirdi ve organoid benzeri yapılar oluşmadı. Ölçek çubukları 750 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11779
Şekil 4: HOSE organoidlerinin hücresel karakterizasyonu. (A) İnsan yumurtalık bölümünde KRT8 ve CDH1 için immünofloresan. Sol paneldeki ölçek çubuğu 500 μm, orta ve sağ paneller 50 μm'dir. (B) Farklı boyutlardaki (<50 μm, 50-75 μm, 75-100 μm, >100 μm) hOSE organoidlerinde KRT8 ve YAP, LGR5 ve CD44 ve ITGB1 ve PODXL için immünofloresan. Ölçek çubukları 50 μm'dir. (C) HoSE organoidlerinde VIM, CDH1, CDH2 için immünofloresan. Ölçek çubukları 50 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-12658
Şekil 5: Yumurtlama ipuçlarının hOSE organoid oluşumu üzerindeki etkisi. (A) Farklı kültür ortamlarında 7. günde oluşan damlacık başına toplam hOSE organoid sayısı. Tavşan organoidleri üç farklı donörden (tOVA77, tOVA79, tOVA83) türetilmiştir. Kalın, organoid türetme için kullanılan OSE_3D ortamdır. (B) Hormonsuz ortama kıyasla nispi organoid oluşumu. HoSE organoidlerinden toplanan değerler üç farklı donörden (tOVA77, tOVA79, tOVA83) türetilmiştir. (C) İki farklı donörden test edilen deney koşullarının her birinde 14. günde en büyük 4 hOSE organoidinin görüntü alanını gösteren grafik (tOVA77, tOVA83). (D) İki farklı donörden (tOVA77, tOVA83) hormon içermeyen ortam, 200 nM E2 ve 1000 nM P4 ile 14. gün kültüründe hOSE organoidlerini gösteren parlak alan görüntüleri. Ölçek çubukları 750 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çalışmada kullanılan çalışma solüsyonlarının bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

3D organoid teknolojisi, tıbbi araştırmalar için vazgeçilmez bir araç olarak ortaya çıkıyor. Bir yandan, bu in vitro platform, doku rejenerasyonu, yara iyileşmesi ve gelişimi ile ilgili temel mekanik soruları inceleme imkanı sunar18. Öte yandan, hasta örneklerinden türetilen 3D organoidler, teşhis, ilaç testi ve hücre tedavisi dahil olmak üzere kişiselleştirilmiş tıp çalışmalarına izin verir 12,13,14,37,38. Yumurtalık araştırmaları alanında, horoz, epitelyal yumurtalık karsinomlarının kökeni olarak ortaya çıkmasından bu yana büyük ilgi görmüştür39. En sık görülen epitelyal over kanserlerinden biri olan yüksek dereceli seröz over karsinomunun (HGSOC) fallop tüplerinden(40) kaynaklandığı düşünülse de, farelerde 3D over organoidleri üzerinde yapılan güncel araştırmalar, OSE ve fallop tüpünden HGSOC'un potansiyel bir ikili kökenini önermiştir15,16.

Burada, hOSE 3D organoidlerinin türetilmesi için bir protokol tanımladık ve yumurtalık dokusu rejenerasyonunda yeni mekanik bilgi getirmek için uygulamasını özetledik. Bu protokol, birincil hOSE hücrelerini insan yumurtalıklarından izole etmek ve 3D hOSE organoidleri oluşturmak için adım adım bir yöntem içerir. Etkili hOSE organoid türevini sağlamak için, yumurtalık manipülasyonunu en aza indirmek çok önemlidir. Yumurtalık yüzeyindeki konumu ve tek katmanlı organizasyonu nedeniyle, horoz, ooferektomi ve organ manipülasyonu sırasında hasara ve kayba eğilimlidir. Bu nedenle, hOSE 2,8'i izole etmek için tüm yumurtalığa uygulanan enzimatik ve kazıma yöntemini tercih ettik. Bu protokolde, hOSE hücreler arası bağlantıları bozmak için hafif bir enzimatik tedavi uygulandı, ardından yumurtalık yüzeyi nazikçe kazındı.

2D ile 3D hOSE kültürü karşılaştırıldığında, 2D kültürde hOSE hücrelerinin başlangıçtaki yüksek proliferasyon oranına rağmen, hücresel özelliklerinin EMT nedeniyle değiştiğini ve uygulanan 2D kültür koşullarının epitel morfolojisini sürdürmek için uygun olmadığını düşündürdüğünü belirtmek önemlidir. Buna karşılık, 3D hOSE organoidleri, yaşlanma belirtisi olmadan en az 4 kez geçilebilir. Kullanılan organoid kültür ortamının OSE_3D, Kopper ve meslektaşları tarafından OC ve sağlıklı hOSE organoidlerinintüretilmesi için kullanılanlara 12 ve Kessler ve meslektaşları tarafından insan FT organoidlerinintüretilmesi için 17 kullanılana dayanıyordu. Temel fark, insan Wnt3a ve R-Spondin-1 şartlandırılmış ortamın, tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için ticari olarak temin edilebilen rekombinant proteinlerle değiştirilmesiydi.

İmmünofloresan teknikleri tipik olarak doku örneğinin kültür plakasından çıkarılmasını ve parafin veya kriyo-kesitleme için işlenmesini içerir. Çok küçük yapılarla çalışırken, numune işleme sırasında bunları kaybetme riski yüksektir. Bu protokolde, hOSE organoidlerinin türetilmesi, hOSE organoidlerinin BME matrisinden çıkarılmasına gerek kalmadan doğrudan mikroskopi görüntülemeye izin veren hücre kültürü plakalarında gerçekleşir. Ayrıca, burada kullanılan ve Rezanejad ve meslektaşları tarafından pankreatik duktal organoidler41 için tarif edilen tam montajlı immünofloresan yöntemi, morfolojik olarak bozulmamış organoidler içinde protein lokalizasyonunun yerinde gözlemlenmesini sağlamıştır. Bu immünofloresan protokolünü çok iyi odacıklı slaytlarda türetilen hOSE organoidleri üzerinde gerçekleştirirken, çok düşük bir arka plan sinyali ile yüksek verimli antikor penetrasyonu olduğunu gösterdik.

Bu yöntem kullanılarak türetilen hOSE organoidlerinin çoğu CDH1 ekspresyonundan yoksun olmasına rağmen, bazı CDH1+ hOSE organoidleri oluşmuş ve CDH1-hOSE organoidlerine kıyasla daha büyük boyutlara ulaşmıştır. CDH1 ekspresyonu neoplastik hOSE fenotipleri 2,35 ile ilişkilendirilmiştir. Haroz izolasyonu için kullanılan yumurtalıklar, üreme çağındaki (27.1 ± 5 yaş) sağlıklı transmaskülin donörler tarafından bağışlandı. Bu donörler, ooferektomiden önce 38 ± 15 aylık bir süre boyunca testosteron tedavisi altındaydı. Yumurtalık yüzeyindeki CDH1 + hOSE hücrelerinin testosteron tedavisine atfedilebileceği olasılığını göz ardı edemeyiz. Androjen tedavisi, anovülasyon42, kortikal alanınhiperplazisi 43 ve artmış kortikal sertlik44 gibi yumurtalık değişiklikleri ile bağlantılı olmasına rağmen, genel yumurtalık patolojisi testosteron45 kullanılırken iyi huylu kalır.

Özetle, bu protokol, yumurtalık dokusu rejenerasyonu ile ilgili mekanik soruları çözmek için hOSE 3D organoidleri üretme potansiyelini vurgulamaktadır. Daha da önemlisi, bu yöntem, kanser gelişimi riski taşıyan hastalardan alınan yumurtalık biyopsilerinde bulunan kötü huylu hücrelerin tespiti için de uygulanabilir. Toplu olarak, bu yöntem hem temel yumurtalık fonksiyon çalışmaları hem de kişiselleştirilmiş tıbbi tedaviler için klinik uygulamalar için bu yenilikçi in vitro platformun potansiyel uygulamalarını desteklemektedir.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Bu çalışma için doku bağışında bulunan tüm hastalara, faydalı tartışmalar için Chuva de Sousa Lopes grubunun üyelerine ve Şekil 1'de kullanılan karikatürleri tasarladığı için I. De Poorter'a teşekkür ederiz. Bu araştırma, Avrupa Araştırma Konseyi tarafından J.S.D.V. ve S.M.C.d.S.L. için ERC-CoG-2016- 725722 (OVOGROWTH) hibe numarası ile finanse edilmiştir; ve Novo Nordisk Vakfı (reNEW), J.S.D.V. ve S.M.C.d.S.L. için NNF21CC0073729 numaralı hibe.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin/EDTAInvitrogen25200-056
12-well Culture PlateCorning3336Sterile
15 mL tubesGreiner188271Sterile
28cm Cell ScraperGreiner Bio-One541070
50 mL tubesGreiner227261Sterile
60 mm Petri dishGreiner Bio-One628160
A83-01Stem Cell Technologies72024
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B27 supplement (50x)ThermoFisher Scientific17504-044
Bead bathM714
Bovine serum albumin (BSA)Sigma Aldrich10735086001
Cell Dissociation BufferThermoFisher Scientific13151014
Cryo-container "Mr. Frosty"BD Falcom479-3200
DMEM MediumThermoFisher Scientific41966-029
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 647Invitrogen A-21447
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21202
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 InvitrogenA-21206
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A-21207
Donkey anti-Sheep IgG Alexa Flour 647 Invitrogen A-21448
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher ScientificA4736401
Follicle Stimulating Hormone (FSH)Sigma AldrichF4021
Forskolin Peprotech6652995
Glutamax (100x)Gibco35050-038
Goat anti-CDH2 (N/R-cadherin)Santa Cruz SC-1502Mesenchymal Cells; Wong et al 1999 (human)25
Goat anti-PODXL (podocalyxin of GP135)R&D Systems AF1658Apical Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA-21434
hEGFR&D Systems263-EG
HEPESGibco15630-056
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X; 100x)ThermoFisher Scientific51500-056
Liberase DH Research GradeSigma AldrichA4736401
Luna-II  cell counterLogos BiosystemsL40001
MatrigelSigma Aldrich354277
McCoy’s 5A Medium ThermoFisher Scientific26600-023
Mouse anti-ITGB1 (integrin beta 1)Santa Cruz SC-53711Basolateral Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Mouse anti-KRT8 (cytokeratin 8)Santa Cruz SC-101459OSE Cells; Kopper et al 2019 (human)12
Mouse anti-VIM (vimentin)Abcam AB0809Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Mycozap Plus-CLLonzaV2A-2011
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G
OVITRELLE-Choriogonadotropin alfa (hCG)MerkG03GA08
Progesterone (P4)Sigma AldrichP8783
Rabbit anti-ACTA2 (alpha smooth muscle actin)Abcam AB5694Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Rabbit anti-CDH1 (E-cadherin)Cell Signaling CST 3195SEpithelial Cells; Wong et al 1999 (human)25
Rabbit anti-LGR5Abcam AB75850OSE Progenitor Cells; Flesken-Nikitin et al 2013 (mouse)22
Rabbit anti-YAPCell Signaling 14074SProliferative OSE; Wang et al 2022 (mouse)24
Rat anti-CD44 PE-conjugatedeBioscience12-0441-81OSE Progenitor Cells; Bowen et al 2009 (human)20
Recombinant Human Heregulinβ-1Peprotech100-03
Recombinant Human NogginPeprotech120-10C
Recombinant Human Wnt3aR&D Systems5036-WN-010
Recombinant Rspondin-1  Peprotech120-38
Red blood cells lysis buffereBiosciences00-4333-57
Revitacell Supplement (100x)ThermoFisher ScientificA26445-01
RNAse free DNAseQiagen79254
SB-431542Tocris Bioscience1624/10
Sheep anti-COL1A1 (pro-collagen 1 alpha 1)R&D Systems AF6220Mesenchymal Cells; Hosper et al 2013 (human)23
Y-27632 StemCell Technologies72304
β-Estradiol (E2)Sigma-AldrichE8875
μ-Slide 18-well culture plateIbidi8181Sterile

Referanslar

  1. Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (10), 625-638 (2015).
  2. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22 (2), 255-288 (2001).
  3. Tan, O. L., Fleming, J. S. Proliferating cell nuclear antigen immunoreactivity in the ovarian surface epithelium of mice of varying ages and total lifetime ovulation number following ovulation. Biol Reprod. 71 (5), 1501-1507 (2004).
  4. Carter, L. E., et al. Transcriptional heterogeneity of stemness phenotypes in the ovarian epithelium. Commun Biol. 4 (1), 527 (2021).
  5. Chumduri, C., Turco, M. Y. Organoids of the female reproductive tract. J Mol Med (Berl). 99 (4), 531-553 (2021).
  6. Edmondson, R. J., Monaghan, J. M., Davies, B. R. The human ovarian surface epithelium is an androgen responsive tissue. Br J Cancer. 86 (6), 879-885 (2002).
  7. Karlan, B. Y., Jones, J., Greenwald, M., Lagasse, L. D. Steroid hormone effects on the proliferation of human ovarian surface epithelium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 173 (1), 97-104 (1995).
  8. Nakamura, M., Katabuchi, H., Ohba, T., Fukumatsu, Y., Okamura, H. Isolation, growth and characteristics of human ovarian surface epithelium. Virchows Arch. 424 (1), 59-67 (1994).
  9. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).
  10. Del Valle, J. S., Chuva de Sousa Lopes, S. M. Bioengineered 3D ovarian models as paramount technology for female health management and reproduction. Bioengineering (Basel). 10 (7), 832 (2023).
  11. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  12. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  13. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  14. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121.e7 (2023).
  15. Lohmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat Commun. 11 (1), 2660 (2020).
  16. Zhang, S., et al. Both fallopian tube and ovarian surface epithelium are cells-of-origin for high-grade serous ovarian carcinoma. Nat Commun. 10 (1), 5367 (2019).
  17. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  18. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  19. Abedini, A., Sayed, C., Carter, L. E., Boerboom, D., Vanderhyden, B. C. Non-canonical WNT5a regulates Epithelial-to-Mesenchymal Transition in the mouse ovarian surface epithelium. Sci Rep. 10 (1), 9695 (2020).
  20. Bowen, N. J., et al. Gene expression profiling supports the hypothesis that human ovarian surface epithelia are multipotent and capable of serving as ovarian cancer-initiating cells. BMC Med Genomics. 2, 71 (2009).
  21. Bryant, D. M., et al. A molecular switch for the orientation of epithelial cell polarization. Dev Cell. 31 (2), 171-187 (2014).
  22. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495 (7440), 241-245 (2013).
  23. Hosper, N. A., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition in fibrosis: collagen type I expression is highly upregulated after EMT, but does not contribute to collagen deposition. Exp Cell Res. 319 (19), 3000-3009 (2013).
  24. Wang, J., et al. Selective YAP activation in Procr cells is essential for ovarian stem/progenitor expansion and epithelium repair. Elife. 11, e75449 (2022).
  25. Wong, A. S., et al. Constitutive and conditional cadherin expression in cultured human ovarian surface epithelium: influence of family history of ovarian cancer. Int J Cancer. 81 (2), 180-188 (1999).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J., Nachtigal, M. W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  28. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19 (2), 156-172 (2009).
  29. Miettinen, P. J., Ebner, R., Lopez, A. R., Derynck, R. TGF-beta induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. J Cell Biol. 127 (6 Pt 2), 2021-2036 (1994).
  30. Danielpour, D., et al. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (SELISAs) quantitate and distinguish two forms of transforming growth factor-beta (TGF-beta 1 and TGF-beta 2) in complex biological fluids. Growth Factors. 2 (1), 61-71 (1989).
  31. Oida, T., Weiner, H. L. Depletion of TGF-beta from fetal bovine serum. J Immunol Methods. 362 (1-2), 195-198 (2010).
  32. Halder, S. K., Beauchamp, R. D., Datta, P. K. A specific inhibitor of TGF-beta receptor kinase, SB-431542, as a potent antitumor agent for human cancers. Neoplasia. 7 (5), 509-521 (2005).
  33. Wang, J., Wang, D., Chu, K., Li, W., Zeng, Y. A. Procr-expressing progenitor cells are responsible for murine ovulatory rupture repair of ovarian surface epithelium. Nat Commun. 10 (1), 4966 (2019).
  34. Kawata, M., et al. Polarity switching of ovarian cancer cell clusters via SRC family kinase is involved in the peritoneal dissemination. Cancer Sci. 113 (10), 3437-3448 (2022).
  35. Davies, B. R., Worsley, S. D., Ponder, B. A. Expression of E-cadherin, alpha-catenin and beta-catenin in normal ovarian surface epithelium and epithelial ovarian cancers. Histopathology. 32 (1), 69-80 (1998).
  36. Skory, R. M., Xu, Y., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Engineering the ovarian cycle using in vitro follicle culture. Hum Reprod. 30 (6), 1386-1395 (2015).
  37. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  38. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2, 78 (2019).
  39. Ducie, J., et al. Molecular analysis of high-grade serous ovarian carcinoma with and without associated serous tubal intra-epithelial carcinoma. Nat Commun. 8 (1), 990 (2017).
  40. Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. J Pathol. 211 (1), 26-35 (2007).
  41. Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids. Curr Protoc Cell Biol. 83 (1), e82 (2019).
  42. Asseler, J. D., et al. One-third of amenorrheic transmasculine people on testosterone ovulate. Cell Rep Med. 5 (3), 101440 (2024).
  43. Ikeda, K., et al. Excessive androgen exposure in female-to-male transsexual persons of reproductive age induces hyperplasia of the ovarian cortex and stroma but not polycystic ovary morphology. Hum Reprod. 28 (2), 453-461 (2013).
  44. De Roo, C., et al. Texture profile analysis reveals a stiffer ovarian cortex after testosterone therapy: a pilot study. J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1837-1843 (2019).
  45. Grimstad, F. W., et al. Ovarian histopathology in transmasculine persons on testosterone: A multicenter case series. J Sex Med. 17 (9), 1807-1818 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 210yumurtal kinsanorganoidleryumurtal k y zey epitelidoku k lt rtarama platformu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır