Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Özet

Bu makale, uzun RNA'ların terminal konumlarında çift renkli etiketlenmesini ve tek moleküllü FRET TIRF mikroskobu uygulamaları için fosfolipid veziküllerde kapsülleme yoluyla yüzey immobilizasyonunu açıklamaktadır. Bu tekniklerin birleştirilmesi, RNA dinamiklerinin tek molekül düzeyinde hassas bir şekilde görselleştirilmesini ve analiz edilmesini sağlar.

Özet

Tek moleküllü Förster Rezonans Enerji Transferi (smFRET), zaman içindeki konformasyonel değişikliklerinin hassas bir şekilde gözlemlenmesine izin vererek dinamik biyomoleküllerin incelenmesinde mükemmeldir. smFRET ile RNA dinamiklerini izlemek için, RNA'ları bir FRET florofor çifti ile terminallerinde kovalent olarak etiketlemek için bir yöntem geliştirdik. Bu doğrudan uç etiketleme stratejisi, karbodiimid (EDC)/N-hidroksisüksinamid (NHS) aktivasyonu ile 5'-fosfatı ve periyotat oksidasyonu ile 3'-ribozu hedefler, bu da boyutlarına ve dizilerine bakılmaksızın diğer RNA'lara uyarlanabilir ve bunları yapay modifikasyonlardan bağımsız olarak incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, 5'-EDC/NHS aktivasyonu, 5'-fosfatlı tüm nükleik asitler için genel ilgi çekicidir. Ticari olarak temin edilebilen kimyasalların kullanılması, RNA'ya özgü probların sentezlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu, ilgilenilen yüzeyle hareketsiz hale getirilmiş moleküllerin aydınlatılacak buharlaşma alanı içinde olmasını gerektirir. RNA moleküllerini buharlaşan alan içinde tutmanın karmaşık bir yolu, onları fosfolipid veziküller içinde kapsüllemektir. Kapsülleme, molekülün serbest difüzyonunu sağlarken molekülü yüzeye bağlayarak her iki dünyanın da en iyisinden yararlanır. Her vezikülün yalnızca tek bir RNA molekülü içerdiğinden emin olarak tek moleküllü görüntülemeyi mümkün kılıyoruz. İlgilenilen RNA'nın çift uçlu etiketlenmesi ve kapsüllenmesi üzerine, smFRET ölçümleri, RNA davranışının dinamik ve ayrıntılı bir görünümünü sunar.

Giriş

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), biyomoleküllerin moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerini nano ölçekte incelemek için güçlü ve hassas bir tekniktir. Uyarılmış bir donör molekülden yakındaki bir alıcı moleküle, tipik olarak 1 nm ile 10 nm arasındaki mesafelerde meydana gelen radyasyonel olmayan enerji transferine dayanır. Verici ve alıcı boyalar arasındaki mesafe, bu enerji transferinin verimliliğini belirler ve FRET'i, RNA'lar da dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik sistemlerde ^1,2 moleküler dinamikleri, konformasyonel değişiklikleri ve etkileşimleri incelemek için paha biçilmez bir araç haline getirir. Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobunun smFRET araştırmaları için güçlü bir teknik olduğu kanıtlanmıştır, çünkü molekülleri yalnızca yüzeye yakın seçici olarak aydınlatır ve tek tek moleküllerin yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip FRET dinamiklerine izin verir. Bununla birlikte, smFRET-TIRF deneylerini gerçekleştirmeden önce, ilgilenilen molekül önce uygun bir FRET çifti ile floresan olarak etiketlenmeli ve daha sonra mikroskopi yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirilmelidir. Burada tarif edilen smFRET-TIRF protokolü, iki ekzonik dizisi (915 nükleotid) ile çevrili Saccharomyces cerevisiae mitokondriden vahşi tip grup II intron Sc.ai5γ kullanılarak doğrulanmıştır.3. Floresan etiketleme grubu II intronlarının ve bunların smFRET TIRF mikroskobu için immobilizasyonunun daha ayrıntılı bir görünümü için, incelememize^{bakın 4}.

İdeal bir bölgeye özgü RNA etiketleme stratejisi, RNA'nın yapısını veya işlevini değiştirmeden donör ve alıcı boyaların önceden belirlenmiş konumlarda hassas bir şekilde birleştirilmesine izin vererek doğru ve verimli FRET ölçümleri sağlar. Bu, seçici etiketlemeyi karmaşıklaştıran dört nükleobaz arasındaki kimyasal benzerlikler nedeniyle zordur. Uç etiketleme, 5'-fosfat ve 3'-riboz'u hedefleyerek donör ve alıcı boyaları RNA uçlarına bağlar. Bu yaklaşım, minimal invaziv bir yaklaşım sunarken, yapısal dinamikler ve etkileşimler hakkında değerli bilgiler sağlamaya devam eder. Grup II intron'un Mg²⁺ varlığında kendi kendine birleşme yeteneği, metal iyonuna bağımlı enzimlerin kullanımını kısıtlar. Burada, enzimlere veya özel probların sentezine olan ihtiyacı atlayan çift uç etiketli uzun ve katalitik olarak aktif RNA'lara (ribozimler) bir yaklaşım sunuyoruz.

TIRF mikroskobu için RNA moleküllerini yüzeye bağlamak için yaygın bir yaklaşım, bir biyotin parçasını doğrudan RNA'ya kovalent olarak bağlamak veya biyotin taşıyan bir antisens oligonükleotidi (ASO) hibritleştirmektir5,6,7. Bununla birlikte, bu doğrudan immobilizasyon yöntemi, RNA-yüzey etkileşimlerine bağlı olarak artefaktlara neden olabilir ve bu da potansiyel olarak yanlış katlanmış RNA'lara^{neden olabilir 8}. Bu immobilizasyon artefaktlarını hafifletmek için zarif bir çözüm, RNA'yı yüzeye bağlı nano ölçekli fosfolipid veziküller ^9,10,11 içinde kapsüllemektir. Çapı yaklaşık 100 nm olan bu veziküller, bir biyotin-streptavidin bağı 12,13,14 ile yüzeye tutturulur ve RNA'nın lipid zarı¹⁰ boyunca iyon alışverişine izin verirken içeride serbestçe yayılmasına izin verir. Büyük bir fonksiyonel RNA^3'ü kovalent olarak etiketledikten sonra, RNA işlevselliğini korumak için uyarlanmış yüzey pasivasyonu ve vezikül kapsüllemesi için yerleşik protokolleri birleştirerek bu tür RNA'ları fosfolipid veziküllerde kapsüllemek için bir yaklaşım sunuyoruz 10,11,14. Bu çift uçlu etiketleme ve kapsülleme yaklaşımı, smFRET TIRF mikroskobu için fonksiyonel RNA'ların yüksek oranda mono kapsüllenmesini sağlar.

Protokol

1. RNA çift uç etiketleme

NOT: Aşağıdaki protokol, bir donör boyanın (sCy3) 5'-fosfata ve bir alıcı boyanın (Cy5) 3'-riboza kovalent bağlanmasıyla bir FRET çift florofor ile RNA'ların bölgeye özgü etiketlenmesini açıklar. Katalitik olarak aktif bir uzun RNA, grup II intron ribozimi, ilgilenilen RNA olarak seçilir. Tablo 1 ve Şekil 1 , bu çift uçlu etiketleme protokolünü özetlemektedir. Floroforları içeren tüm adımları karanlık koşullar altında gerçekleştirin.

Gün 0	▪ 1.5 mL tüp başına toplam 55 μL hacme 50-75 μg RNA'yı alikot.
1. Gün	5" -Fosfat aktivasyonu
	▪ 45 μL taze hazırlanmış EDC-NHS, pH 6.0 çözeltisi ddH2O'dakiRNA'ya 100 μL'lik bir nihai hacme ekleyin, iyice karıştırın ve 25 ° C ve 500 rpm'de 4 saat inkübe edin.
	▪ Arınma turu 1: Gece boyunca EtOH yağışı.
2. Gün	▪ 5' ile aktive edilmiş RNA'yı çökeltin, yıkayın ve kurulayın.
	5" -Boya eki
	▪ 95 μL 100 mM MOPS, pH 7.5 içinde yeniden süspanse edin.
	▪ 5 μL 2 mM amin ile işlevselleştirilmiş boya çözeltisi ekleyin.
	▪ İyice karıştırın ve 25 ° C ve 500 rpm'de 16 saat inkübe edin.
3. Gün	▪ Arınma turu 2: EtOH yağışı.
4. Gün	▪ 5' ile aktive edilmiş RNA'yı çökeltin, yıkayın ve kurulayın.
	Engelleme adımı
	▪ 100 μL'lik 100 μM Tris-HCl, pH 7.5'te yeniden süspanse edin ve 25 ° C ve 500 rpm'de 2 saat inkübe edin.
	▪ Saflaştırma turu 3: Santrifüj filtrasyonu.
	→ 5' etiketli RNA'yı elute edin.
5. Gün	3′-Periyoda oksidasyonu
	▪ RNA'yı 50 mM NaOAc tamponunda 20 mM NaIO4 ile inkübe edin, pH 5.5, 100 μL'lik bir son hacimde 25 °C ve 500 rpm'de 2 saat boyunca inkübe edin.
	▪ Fazla periyodu söndürün: 30 μL %50 gliserol ekleyin, iyice karıştırın ve 25 °C ve 500 rpm'de 30 dakika inkübe edin.
	▪ Arınma turu 4: Gece boyunca EtOH yağışı.
6. Gün	▪ 3'-oksitlenmiş RNA'yı çökeltin, yıkayın ve kurutun.
	3′-Boya eki
	▪ 95 μL'lik 50 mM NaOAc, pH 6.0 içinde yeniden süspanse edin.
	▪ 5 μL 2 mM hidrazid ile işlevselleştirilmiş boya çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve 25 ° C ve 500 rpm'de 16 saat inkübe edin.
7. Gün	▪ Arınma turu 5: EtOH yağışı.
8. Gün	▪ Etiketli RNA'yı çökeltin, yıkayın ve kurulayın.
	▪ Santrifüj filtrasyonu.
	→ Çift uçlu etiketli RNA'yı elute.

Tablo 1: RNA çift uçlu etiketleme için protokol özeti. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 1: 5'-fosfat ve 3'-riboz şekerini hedefleyerek çift uçlu etiketlemenin deneysel akışı. 5'-fosfat, NHS varlığında EDC kullanılarak aktive edilir ve daha sonra amin ile işlevselleştirilmiş boya ile birleştirilir. RNA'nın 3'-diol kısmı, periyodat aktivitesi ile dialdehite oksitlenir, bu da hidrazid ile işlevselleştirilmiş boya ile daha fazla reaksiyona girer. Çift uçlu etiketleme için, çapraz etiketlemeyi önlemek için 5' etiketleme ile başlamak ve ardından bir ara engelleme adımıyla 3' etiketleme yapmak önemlidir. Kısaltmalar: EDC = karbodiimid; NHS = N-hidroksisüksinimid; MOPS = 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit; NaOAc = sodyum asetat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. 5' uçlu etiketleme: EDC/NHS aktivasyonu ile 5'-fosfatın hedeflenmesi
   NOT: Bu 5' etiketleme yöntemi sadece RNA için değil, 5'-fosfat içeren herhangi bir tek sarmallı nükleik asit için de geçerlidir. Reaksiyonun özgüllüğü, pH bağımlılığı tarafından yönetilir ve RNA omurgasında çoklu fosfatların varlığına rağmen, yalnızca 5'-fosfatın bölgeye özel olarak hedeflenmesine izin verir. PH 6.0'da, 5'-fosfatın karbodiimidlere karşı benzersiz reaktivitesi, iki oksijenin protondan arındırıldığı ve birinin protonlanmış kaldığı spesifik protonasyon durumundan kaynaklanır. Bu, 5'-fosfatı reaktif hale getirirken, tamamen protondan arındırılmış omurga fosfatları reaktif kalmaz ve EDC/NHS hedeflemesi yoluyla 5'-ucun seçici olarak etiketlenmesini sağlar.
   1. EDC-NHS-NaOAc, pH 6.0 çözeltisini hazırlayın. 35 μL ddH₂O ve 10 μL 0.5 M NaOAc, pH 6.0 (buzlu asetik asit ile ayarlanmış pH) içinde alikot başına 1.5 mg EDC ve 2.0 mg NHS'yi karıştırın.
   2. İlgilenilen RNA'nın 55 μL ddH₂O'da tüp başına yaklaşık 50-75 μg RNA'ya sahip olmasını sağlayın. RNA'ya 45 μL EDC-NHS-NaOAc, pH 6.0 karışımı ekleyin, 78 mM EDC, 174 mM NHS ve 50 mM NaOAc, pH 6.0 nihai konsantrasyonları ile toplam 100 μL hacme ulaşın. 500 rpm'de çalkalarken 25 °C'de 4 saat inkübe edin.
      NOT: Burada 70 μg, in vitro kopyalanmış 250 nt RNA'nın 915 pmol'üne ve 2.5 μL'lik son reaksiyon hacminde 100 μM'ye karşılık gelir.
   3. Saflaştırma turu 1: 5'-fosfatla aktive edilen RNA'yı EtOH çökeltme ile saflaştırın.
   4. Suda 2 mM sülfonatlı Siyanin3 amin (sCy3-amin) çözeltisi hazırlayın.
   5. Aktive edilmiş RNA peletini 95 μL 100 mM 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) tamponunda, pH 7.5'te (NaOH ile ayarlanmış pH) yeniden süspanse edin. Aktive edilmiş RNA'ya 5 μL 2 mM sCy3-amin çözeltisi ekleyin. 500 rpm'de çalkalarken 25 ° C'de 16 saat inkübe ederek floroforu aktive edilmiş 5'-fosfata birleştirin.
      NOT: MOPS tamponunu karanlıkta 4 °C'de saklayın. Grup II intron ribozimi inaktif tutmak için pH ayarlaması için NaOH seçilir. Florofor, RNA'nın en az 40 kat fazla olmalıdır.
   6. Saflaştırma turu 2: Ayırmayı iyileştirmek için 200 μL ddH₂O ekleyerek hacmi artırın. 5'-fosfat etiketli RNA'yı EtOH çökeltme ile saflaştırın ve süpernatant renksiz olana kadar tekrarlayın (genellikle iki tur gerekir).
   7. Bloke etme adımı: RNA'yı 100 μL'lik 100 mM Tris-HCl, pH 7.5'te yeniden süspanse edin ve 25 ° C ve 500 rpm'de 2 saat inkübe edin. Yalnızca 5' uçlu tek etiketleme için, engelleme adımını atlayın, RNA'yı ddH₂O'da yeniden askıya alın ve adım 1.1.8 ile devam edin. Ancak, basitlik için, çift etiketleme varsa, 5'uçlu tek etiketli denetimi yalnızca adım 1.1.9'dan sonra ayırın.
      NOT: Bu adım, hidrazid ile işlevselleştirilmiş florofor ile çapraz etiketleme riskini en aza indirmek için nispeten daha küçük bir birincil amin kaynağı (örneğin, Tris) ile reaksiyona girerek amin ile işlevselleştirilmiş bir florofora bağlanmamış aktif 5'-fosfatları bloke etmeye hizmet eder.
   8. Saflaştırma turu 3: Etiketli RNA'yı santrifüjlü filtrasyon ile toplamda en az 10 mL ddH₂O ile yıkayarak serbest boyaları çıkarın, ardından ddH₂O içinde elüte edin.
      NOT: Filtrenin moleküler kesimi, nükleik asidin boyutunun yarısından daha az olmalıdır. Tercih edilen tampon ddH₂O yerine kullanılabilir. Elüsyon, numunenin tamamen kuruyana kadar döndürülmediğinden emin olarak üreticinin talimatlarına uymalıdır.
   9. UV-Vis spektroskopisi ile RNA ve konjuge boya konsantrasyonlarını belirleyin.
2. 3' uçlu etiketleme: Periyodot oksidasyonu ile 3'-ribozun hedeflenmesi
   1. 90 μL'de tüp başına yaklaşık 50-75 μg RNA'ya sahip olacak şekilde ddH₂O'da 5' uçlu etiketli RNA'yı alikot edin. Önceki adımın elüsyon hacmi yüksekse ve düşük bir konsantrasyonla sonuçlanıyorsa, peleti ddH₂O'da çökelterek ve yeniden süspanse ederek RNA'yı konsantre edin. 5 μL 1.0 M NaOAc tamponu, pH 5.5 (50 mM NaOAc'ye karşılık gelir, 100 μL reaksiyon hacmi için pH 5.5'e karşılık gelir).
      NOT: 5' uçlu tek etiketli RNA'ya benzer şekilde, rutin olarak 3' uçlu tek etiketli RNA'yı kontrol olarak hazırlıyoruz. Bunu yapmak için, etiketlenmemiş RNA'yı 86 μL ddH₂O'da tüp başına yaklaşık 50-75 μg RNA'ya sahip olacak şekilde alikotleyin.
   2. 4 μL taze hazırlanmış 500 mM sodyum meta-periodat (NaIO₄) stok çözeltisi ekleyin (100 μL reaksiyon hacmi için 10 mM NaIO_4'e karşılık gelir). 3' uçlu tek etiketleme için 8 μL NaIO₄ stok çözeltisi ekleyin (100 μL reaksiyon hacmi için 20 mM NaIO_4'e karşılık gelir). İyice karıştırın ve NaIO₄ ışığa duyarlı olduğu için karanlık koşullarda 500 rpm'de çalkalarken 25 °C'de 2 saat inkübe edin.
      NOT: Ekleme sırasını değiştirmeyin veya kuluçka süresini daha fazla artırmayın, çünkü bu, ekli donör boyasının fotoağartılmasına neden olabilir. Kullanılan NaIO₄ konsantrasyonu, 5' uçta zaten eklenmiş olan boyanın su vermesini en aza indirmek için çift uçlu etiketleme için yarı yarıya azaltılır.
   3. 30 μL% 50 gliserol ekleyerek reaksiyonu durdurun. 500 rpm'de çalkalarken 25 °C'de 30 dakika inkübe edin.
      NOT: Gliserol, periodat fazlalığını gidermek için bir diol görevi görür.
   4. Saflaştırma turu 4: 400 μL buz gibi soğuk EtOH-NaOAc çökeltme karışımı ekleyin ve etanol çökeltme işlemini gerçekleştirin.
   5. Oksitlenmiş RNA peletini 95 μL 50 mM NaOAc, pH 6.0 içinde yeniden süspanse edin.
   6. Hidrazid-boya eki: Birkaç kristal Cyanine5 hidrazidini (Cy5-hidrazid) DMSO'da çözerek ve ardından_ddH2Oile 2 mM konsantrasyonuna seyrelterek florofor çözeltisini hazırlayın. Tercih edilen florofor suda çözünürse, çözeltiyi ddH₂O'da hazırlayın. Oksitlenmiş RNA'ya 5 μL 2 mM Cy5-hidrazid çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve 500 rpm'de çalkalarken 25 °C'de 16 saat inkübe edin.
      NOT: Florofor, RNA'nın en az 40 katı fazla olmalıdır.
   7. Saflaştırma turu 5: Çift uçlu etiketli RNA'yı (veya 3'uçlu tek etiketli RNA'yı), sırasıyla 1.2.6 ve 1.2.8 adımlarına benzer şekilde EtOH çökeltme ve santrifüj filtrasyonu ile saflaştırın ve ddH₂O'da elüte edin.
   8. UV-Vis spektroskopisi ile RNA ve konjuge boya konsantrasyonlarını hesaplayın.
   9. Etiketli RNA'yı analitik jel bazlı tahliller, topluluk floresan spektroskopisi ( Temsili Sonuçlar bölümüne bakın) ve/veya başka bir yerde gösterildiği gibi analitik HPLC kullanarak karakterize edin³.

2. Mikroakışkan oda hazırlığı

NOT: Bir seferde altı veya sekiz odayı kullanmanızı öneririz. Sonikasyon, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Bu protokol, eser miktarda safsızlıkların çözünmesini önlemek için aseton gibi organik çözücülerin kullanımını sınırlar. Alternatifler için^15,16 numaralı referanslara bakın.

1. Temizleme
   1. İki kanal oluşturmak için Şekil 2A'da verilen şemaya göre bir elmas delici ile kuvars kızaklarında dört delik açın.
      NOT: Delme sırasında daha kolay kırılabilmelerine rağmen, cam kızaklar, lamel görüntüleme yüzeyi olan objektif tabanlı TIRF mikroskobu kurulumları için kuvars kızaklara uygun maliyetli bir alternatiftir (Şekil 2B). Bu, mikroskopi slaytının arka plan floresansı nedeniyle görüntüleme yüzeyi olduğu prizma tabanlı TIRF kurulumları için bir seçenek değildir.
      NOT: Alternatif olarak, kullanılmış mikroakışkan odalarını¹⁶ geri dönüştürün. Bunun için, kullanılmış hazneleri gece boyunca asetona daldırın (buharlaşmayı en aza indirmek için Coplin boyama kavanozunu alüminyum folyoya sarın) çeker ocakta ve ardından 5 dakika boyunca sonikasyon yapın. Hazneyi sökün ve lamelleri ve çıkartmaları atın. Sökme işlemi hemen işe yaramazsa, odayı 10 dakika daha asetonda sonikleştirin. Adım 2.1.2 ile devam edin.
   2. Delinmiş kuvars slaytları ve yaklaşık iki kat daha fazla lameli (kolayca kırılabilecekleri için) kapaklı bir cam Coplin boyama kavanozuna yerleştirin. 3x'i ddH₂O ile durulayın. ddH₂O'da 5 dakika boyunca sonikate, ardından 3x'i ddH₂O ile durulayın.
   3. 50 ° C'de 30 dakika boyunca% 10 laboratuvar cam eşya temizleme solüsyonunda (Malzeme Tablosuna bakınız) sonikat. Deterjan kabarcıkları gidene kadar ddH₂O ile en az 3 kez durulayın. 5 dakika boyunca ddH₂O'da sonikate. ddH₂O ile 3 kez durulayın.
   4. 30 dakika boyunca 1 M KOH çözeltisinde sonikate, sonra gece boyunca bırakın. 3x'i ddH₂O ile durulayın. ddH₂O'da 5 dakika boyunca sonikate. ddH₂O ile 3 kez durulayın.
      NOT: Aşırı inkübasyondan kaynaklanan korozyon, daha önce Chandradoss ve ^ark.15 tarafından dile getirilen bir endişe olmasına rağmen, Piranha aşındırmasından kaçınmayı sağlayan bu uzun inkübasyonu öneriyoruz.
   5. Slaytları ve lameller N₂(g) ile kurulayın.
   6. Kurumuş slaytları ve lamellere üreticinin talimatlarına göre 30 dakika boyunca oksijen plazma temizleyici ile muamele edin.
2. Aminosilanizasyon
   1. 3 mL Erlenmeyer şişesinde 288.5 mL mutlak EtOH, 1.5 mL ddH₂O ve 9 mL (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) 500 mL Erlenmeyer şişesinde iyice karıştırarak% 500 APTES-EtOH çözeltisini hazırlayın.
   2. Temiz slaytları ve lamelleri bir Coplin boyama kavanozuna koyun,% 3 APTES-EtOH çözeltisine daldırın, 1 dakika sonikat yapın ve 30 dakika inkübe edin.
   3. 3 kez mutlak EtOH ile, ardından 3 kez ddH₂O ile durulayın.
   4. Slaytları ve lameller N₂(g) akış altında kurutun.
3. Yüzey pasivasyonu ve biyotinilasyon
   1. Boş bir pipet ucu kutusunu yarıya kadar ddH₂O ile doldurarak nemli bir kutu hazırlayın. Slaytları, tedavi edilecek tarafı yukarı bakacak şekilde kutunun içine yerleştirin.
   2. 2 mg biotin-polietilen glikol-süksinimidil valerat 5000 (biotin-PEG-SVA) ve 80 mg metoksi polietilen glikol-süksinimidil valerat (mPEG-SVA) 640 μL 100 mM sodyum bikarbonat (NaHCO₃) tamponunda, pH 8.3 içinde hafifçe karıştırarak bPEG-mPEG karışımını 1.5 mL steril-temiz bir mikrosantrifüj tüpünde taze olarak hazırlayın. Hava kabarcıklarını gidermek için bPEG-mPEG karışımını 16.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve her iki kanalı da kaplamak için sürgünün ortasına 30 μL'lik bir damlacık ekleyin. Ekstra bir PEGile lamel elde etmek için sürgünün bir tarafına ek bir damlacık yerleştirin, çünkü kolayca kırılırlar ve yedek bulundurmak faydalıdır. Son olarak, damlayı temiz bir lamel ile örtün, nemli kutuyu kapatın ve karanlık koşullar altında gece boyunca PEGilasyonunu gerçekleştirin.
   4. PEG ile pasifleştirilmiş ve biyotinile edilmiş slaytları ve lameller ddH₂O ile iyice durulayın. İşlem görmüş yüzeylerin hidrofobikliğindeki değişime dikkat edin. N₂(g) akış altında kurutun.
4. Mikroakışkan oda montajı
   1. Kanalları oluşturmak için çift taraflı bir çıkartma kesin. Çıkartmayı, ilgilenilen alanı kapladığından emin olarak slayta yapıştırın. Lameli dikkatlice üstüne yerleştirin ve PE ile yüzeyler birbirine bakacak şekilde hizalayın.
   2. Monte edilmiş her bir hazneyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpleri N₂ (g) ile doldurun ve -20 ° C'de 1 aya kadar saklayın.

Şekil 2: Tek moleküllü FRET-TIRF mikroskobu. (A) TIRF görüntüleme için mikroakışkan oda. (B) FRET etiketli RNA, biyotinile edilmiş bir fosfolipid vezikül içinde kapsüllenir ve steptavidin kaplı bir cam yüzey üzerinde hareketsiz hale getirilir. Bu, ilgilenilen molekülü, TIRF mikroskobunda kritik açıda tamamen yansıtılan gelen ışık tarafından oluşturulan buharlaşan alan (gri gradyan) içinde tutar. Burada, her iki florofor daha sonra ALEX şeması ile uyarılır. Kısaltmalar: FRET = Förster Rezonans Enerji Transferi; TIRF = Toplam İç Yansıma Floresansı; ALEX = alternatif lazer uyarımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Fosfolipid vezikül kapsüllemesi

1. Lipid kek hazırlama
   NOT: Kloroformu her zaman çeker ocak altında tutun.
   1. Steril bir iğne kullanarak, Şekil 3A'da gösterildiği gibi steril temiz 2.0 mL mikrosantrifüj tüplerinin kapağına (içten dışa) delikler açın.
   2. En az 2 mg bPE'yi uygun miktarda kloroform içinde 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona çözerek 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-cap biotinyl (bPE) stok çözeltisini hazırlayın.
   3. En az 10 mg DMPC'yi uygun miktarda kloroform içinde 10 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona çözerek 1,2-dimyristoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC) stok çözeltisini hazırlayın.
   4. 100 μL bPE ve 990 μL DMPC stok çözeltilerini karıştırarak bPE-DMPC karışımını (1:99 w/w oranını koruyarak) hazırlayın. 2 mL tüp başına 109 μL bPE-DMPC karışımını dağıtın.
   5. Bir mikrotüp saklama kutusunun karton hücre bölme ekini, bir tüp tutucu görevi gören bir Schlenk şişesine yerleştirin. Uzun cımbız kullanarak, lipid karışımını içeren tüpleri 500 mL'lik bir Schlenk şişesindeki tüp tutucusuna yerleştirin (Şekil 3B).
      NOT: Dik olduklarından ve eğilmediklerinden emin olun.
   6. Kloroformu gece boyunca (veya çözücü tamamen buharlaşana kadar en az 2 saat) N₂ (g) gibi düşük bir akış altında buharlaştırın.
   7. Delikleri kapatmak için tüpleri Parafilm ile kapatın. Lipid kekleri -20 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. RNA kapsülleme
   1. K⁺ ve Mg²⁺ konsantrasyonlarını ilgilenilen biyolojik sisteme göre ayarlayarak aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
      1. 5x standart tamponu (5x SB) hazırlayın: 2,5 M KCl, 400 mM MOPS; KOH, steril filtre ile pH'ı 6.9'a ayarlayın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın (sırasıyla 1x SB: 500 mM KCl, 80 mM MOPS, pH 6.9).
      2. Yanıp sönme önleyici tamponu (AB): 100 mM MgCl₂, Trolox, 1x SB, steril filtreyi hazırlayın ve karanlıkta 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
         NOT: 10 mL son hacim için bir spatula ucu Trolox kullanın, karıştırmak için girdap yapın ve pH'ı yeniden ayarlayın.
   2. Ekstrüderi 100 nm polikarbonat (PC) membran ve 10 mm polyester (PE) drenaj diski kullanarak monte edin, şırıngayı ve membranları AB ile dengeleyin ve 30 °C'ye ısıtın (veya esasen 24 °C'lik DMPC cam geçiş sıcaklığının üzerinde).
   3. 5 μL 1 μM çift uçlu etiketli RNA ve 45 μL AB'yi (toplam 50 μL hacme kadar) karıştırın.
   4. Lipid kekini bu RNA çözeltisi ile nemlendirin. 30 °C'de 1.400 rpm'de sallayarak 5 dakika, ardından 700 rpm'de 15 dakika karıştırın. 13.000 g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
   5. Numuneyi 250 μL AB ile seyreltin.
   6. Şırıngayı RNA-lipid süspansiyonu ile doldurun. Çift uçlu etiketli RNA'yı 100 nm çapındaki fosfolipid veziküllerde kapsüllemek için bir ısıtma bloğu üzerinde 30 °C'de 35x ekstrüde edin.
      NOT: Ekstrüder kullanıldıktan sonra veziküllerin boyut dağılımı, referans^11'de gösterildiği gibi dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulanabilir.

Şekil 3: Lipid kek hazırlama. (A) Solvent buharlaşmasını sağlamak için tüp kapakları dürtülür. (B) Lipid karışımını içeren tüpler bir Schlenk şişesine yerleştirilir ve bir lipit keki elde etmek için kloroform buharlaştırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. smFRET-TIRF mikroskobu

1. Yüzey immobilizasyonu
   1. Aşağıdaki arabellekleri ve çözeltileri hazırlayın.
      1. Şeker yanıp sönme önleyici tamponu (SAB): AB'de, steril filtrede %1 D-glikoz (a/h) hazırlayın ve karanlıkta 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
      2. 100x OSS'yi hazırlayın: 100x Oksijen süpürme sistemi (OSS): 3 mg glikoz oksidaz (1.7 U'ya karşılık gelir), 10 μL katalaz (22 U'ya karşılık gelir) 90 μL 1x SB içinde, karanlıkta 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
      3. 198 μL SAB ve 2 μL 100x OSS solüsyonunu karıştırarak görüntüleme tamponunu (IB) taze olarak hazırlayın.
   2. Mikroakışkan odanın oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Hazneyi 2x'i 200 μL 1x SB ile yıkayın.
   3. Hazneyi 50 μL 20 μL / mL streptavidin çözeltisi ile doldurun ve 5 dakika inkübe edin.
   4. Hazneyi 200 μL 1x SB ve ardından 100 μL AB ile yıkayın.
   5. 75 μL vezikül süspansiyonu ekleyerek kapsüllenmiş RNA'yı yüzeyde hareketsiz hale getirin ve 10 dakika inkübe edin.
   6. Hazneyi 200 μL taze hazırlanmış IB ile yıkayın ve 5 dakika inkübe edin.
   7. Oda artık veri toplama için hazırdır (Şekil 2B). Uzun ölçümler sırasında buharlaşmayı önlemek için delikleri Şekil 2A'da gösterildiği gibi kapatın. Kanaldan kanala sızıntı söz konusuysa, yüzey immobilizasyon protokolünü başlatmadan önce kullanılmayan kanalı kapatın.
      NOT: Floresan kontaminasyonlarına karşı mikroakışkan odaların ve fosfolipid veziküllerin temizliği için bir kalite kontrolü olarak boş ölçümler yapmanızı öneririz.

Sonuçlar

İlgilenilen 915-nt RNA'nın, maya mitokondriyal Sc.ai5γ grup II intronun, ekzonik dizilerle çevrili, bölgeye özgü tek ve çift floresan etiketlemesini sunuyoruz. FRET florofor çifti, 5'-fosfatın EDC/NHS aktivasyonu ve 3'-ribozun periyodat oksidasyonu ve ardından ilgili boya ekleri yoluyla RNA uçlarına yerleştirilir. Daha sonra RNA-boya konjugatlarını Şekil 4A'da gösterildiği gibi floresan jel elektroforezi ile doğruladık. RNA ve floroforların agaroz jeli üzerindeki birlikte göçü, başarılı etiketlemeyi doğrular. Daha sonra, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, çift etiketli grup II intronunu karakterize etmek için topluluk floresan spektroskopisi kullanıldı. Enerji transferi, yani FRET, RNA'nın ikili etiketlemesini kanıtlayan donör boyanın uyarılması üzerine gözlendi. Özellikle, FRET'in mesafeye bağlı doğası ile tutarlı olarak, metal iyonlarının varlığında grup II intron RNA'nın katlanması, donör emisyonundaki azalma (yeşil ok) ve alıcı (kırmızı ok) emisyonunda karşılık gelen bir artış ile kanıtlandığı gibi FRET verimliliğinde bir artışa yol açmıştır. Bu, bu FRET etiketlemesinin ribozimin konformasyonel değişikliklerini izlediğini gösterir.

Şekil 4: RNA-boya konjugatlarının karakterizasyonu. (A) Tek ve çift floresan etiketli RNA'nın analitik jel bazlı analizi, boyaların %2'lik bir agaroz jel üzerinde RNA ile birlikte göçünü gösterir. Çift etiketli numunedeki floroforların birlikte lokalizasyonu, sırasıyla 532 nm ve 635 nm aydınlatma altında görselleştirilen Cy3 (üst, yeşil) ve Cy5 (orta, kırmızı) kanallarının birleştirilmiş görüntüsündeki (alt) sarı bant ile gösterilir. Şerit 1: 5'-sCy3 yalnızca RNA olarak etiketlendi, şerit 2: 3'-Cy5 yalnızca RNA olarak etiketlendi ve şerit 3: çift uçlu (5'-sCy3 ve 3'-Cy5) etiketli RNA. (B) Topluluk floresan spektroskopisi çift etiketlemeyi doğrular. Donör uyarması üzerine enerji transferi (λex = 515 nm, λem = 670 nm), her iki boyanın da RNA'ya başarılı bir şekilde bağlandığını doğrular. Gri eğri, katalitik öncesi RNA'nın emisyon profilini temsil ederken, siyah eğri, katlanmış grup II intron RNA'sında (3 dakika boyunca 70 ° C'de 500 mM KCl ile inkübe edilir, 5 dakika boyunca 42 ° C'ye soğutulur, ardından 100 mM MgCl₂ ilavesi). Bu rakam Ahunbay ve ark.³ Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Elimizdeki floresan çift etiketli vahşi tip grup II intron ile, şimdi dinamiklerini tek molekül düzeyinde keşfetmek için konumlandık. Fosfolipid veziküller içinde kapsüllendikten sonra, etiketli RNA, smFRET-TIRF için tek molekül çözünürlüğü elde etmek için çok düşük yüzey yoğunluklarında bir mikroskopi yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirilir. Şekil 5A'da görüldüğü gibi, birkaç ayrı molekül aynı anda izlenebilir. TIRF mikroskobu, FRET verimliliğinin ve zaman içindeki değişimlerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Şekil 5B , etiketli ve kapsüllenmiş RNA'nın statik ve dinamik tek moleküllü FRET izlerini örneklemektedir. Tipik bir dinamik iz, FRET verimliliğini dalgalandıran verici ve alıcı sinyaller arasında antikorelasyon sergiler. Donör uyarması üzerine alıcı emisyonu arttığında, donör emisyonu buna bağlı olarak azalır ve bu da boyalar arası mesafede dinamik bir değişikliği gösterir. Bu antikorelasyon, RNA molekülündeki konformasyonel değişiklikleri önerir.

Şekil 5: smFRET ile ortaya konan grup II intron RNA'nın oldukça dinamik davranışı. Çift uçlu etiketli grup II intron RNA, bir fosfolipid vezikül içinde kapsüllenir ve objektif tabanlı bir TIRF mikroskobu ile görüntüleme için yüzeyde hareketsiz hale getirilir. (A) 532 nm uyarılma üzerine donör emisyonu (sCy3, yeşil) ve alıcı emisyonu (Cy5, kırmızı) sergileyen bireysel etiketli RNA moleküllerinin birleştirilmiş görüntüsü. (B) (Solda) verici ve alıcı yoğunluklarının zaman içinde dalgalanmadığı statik bir RNA molekülünün ve (sağda) verici ve alıcı yoğunluklarının antikorreli olduğu dinamik bir RNA molekülünün tipik smFRET yörüngeleri, FRET verimlilikleri sarı renktedir. Tek moleküller MASH-FRET¹⁷ kullanılarak lokalize edilir ve analiz edilir. Doğrudan uyarma, kanama ve γ faktörlü düzeltmeler uygulanır. Kısaltmalar: smFRET = tek moleküllü Förster Rezonans Enerji Transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Tek molekül düzeyinde FRET benzersizdir, çünkü tek tek moleküllerin gözlemlenmesine ve analizine izin verir, numune heterojenliğini ortaya çıkarır ve topluluk ölçümlerinde^{gizlenebilecek} geçici durumları yakalar ^1,2. smFRET kullanarak tek tek RNA moleküllerini gözlemlemek, katlanma yolları ve dinamikleri hakkında yüksek çözünürlüklü bilgiler sağlar. Bu protokol, RNA'nın kimyasal çift uçlu etiketlemesini ve fosfolipid vezikül kapsüllemesi yoluyla yüzey immobilizasyonunu tanımlar ve bunlar birlikte smFRET-TIRF mikroskobu yoluyla dinamik konformasyonel değişikliklerin izlenmesini sağlar.

RNA dinamiklerini incelemek, bölgeye özgü yeni floresan etiketleme stratejilerine ihtiyaç duyulan, sürekli büyüyen bir alandır. RNA uçlarını, 5'-fosfatı karbodiimidlerle ve 3'-riboz şekerini periyodontatla hedefleyerek etiketliyoruz. Bu yaklaşımlar daha önce tanımlanmıştır (5'-uç^18,19 ve 3'-uç^19,20,21,22), ancak daha önce optimizasyon gerektiren vahşi tip Sc.ai5γ grup II intron ribozimine benzer büyüklükte bir RNA'ya uygulanmamıştır. 5'-fosfatın karbodiimid (örneğin, EDC) aktivasyonu geri dönüşümlüdür. Bu nedenle, imidazol, oldukça reaktif bir fosforimidazolit^19,20 oluşturmak için O-açilizoüre ara maddesi ile geri dönüşümsüz bir şekilde reaksiyona girmek için kullanıldı. Bununla birlikte, daha yüksek pH'da, karbodiimidlerin nükleobazları, özellikle guaninleri ve urasilleri değiştirebildiği bilinmektedir, bu da son zamanlarda yapısal sondalama ajanları olarak kullanılmalarına yol açmıştır^23,24.

Çapraz reaktiviteyi önlemek için, boya birleştirme adımı için pH'ı 7.5'e yükseltmeden önce aktive edilmiş RNA'nın EDC'den saflaştırılması çok önemlidir. Bununla birlikte, aktivasyon ile boya eki²⁵ arasına bir saflaştırma adımı eklediğimizde, çok düşük verimler elde ettik. Benzer şekilde, protein etiketlemesinde, yüzeye erişilebilir lizin kalıntıları karbodiimidlerle aktive edilebilir. Bununla birlikte, aktivasyonun tersine çevrilmesini önleyen imidazol yerine, NHS rutin olarak kullanılmaktadır. Biz de bu stratejiyi benimsedik, böylece fosforimidazolid ara ürününü bir NHS-fosfat ara maddesi ile değiştirdik. Bu şekilde, pH kontrolünün yanı sıra daha düşük sıcaklıklarda ve daha kısa inkübasyon sürelerinde artan etiketleme yoğunluğu elde ettik, yani 16 saat için 37 °C'ye kıyasla 4 saat boyunca 25 °C. RNA için geliştirilen bu 5' etiketleme stratejisi, 5'-fosfatlı diğer herhangi bir tek sarmallı nükleik aside uygulanabilir.

5'-fosfat aktivasyonu ve 3'-riboz oksidasyonu birbirini dışladı, çünkü kimyalar ortogonal değildir. Bu zorluğun üstesinden gelmek ve çapraz etiketlemeyi önlemek için, 5' uç ile başladık, ardından 3' uç etiketlemeye devam etmeden önce etkinleştirilmiş ancak etiketlenmemiş siteleri engellemek için bir engelleme adımı izledik. 3'-diol'ü oksitlerken, fazla sodyum meta-periyodat (NaIO₄), 5' ucunda zaten bağlı olan floroforu söndürebilir. Bu nedenle, tek etiketleme için kullanılan NaIO₄ konsantrasyonunu 20 mM'den 10 mM'ye düşürdük.

Reaksiyonları büyütmek yerine paralel olarak birden fazla alikotla çalışmanızı öneririz. Bu protokol, birden fazla etanol (EtOH) çökeltme adımı gerektirir. Paralel olarak birkaç alikotla çalışırken, bir çökeltme karışımı hazırlayın (30 mL% 100 mutlak EtOH ve 1 mL 3 M NaOAc, pH 5.2). NaCl, EtOH'deki düşük çözünürlüğü nedeniyle kullanılmaz. RNA'yı 3.1 hacim ile çökeltin. bu karışımın -20 ° C'de gece boyunca inkübe edilmesi ve ardından santrifüjleme ile çökeltin. RNA peletini 500 μL buz gibi %70 EtOH ile iki kez yıkayın, her seferinde 4 °C'de döndürün ve vakum altında kurutun. EtOH çökeltisi, RNA'nın çözünmezliğinden ve serbest boyaların %70 etanol içindeki çözünürlüğünden yararlanır. Santrifüjlü filtrasyon, RNA'dan önemli boyut farkları nedeniyle serbest boyaları etkili bir şekilde uzaklaştırır ve tampon değişimini kolaylaştırarak tuzları ortadan kaldırır. EtOH çökeltme ve santrifüjlü filtrasyon yöntemlerine ek olarak, serbest boyalar jel ekstraksiyonu ve/veya kromatografi teknikleri (örn., HPLC) kullanılarak da çıkarılabilir; Ancak ölçek buna göre uyarlanmalıdır. Uzun RNA'ları yeniden süspanse etmek için girdap yapmayın, çünkü bu mekanik kesmeye^{neden olabilir 26}. Protokolü duraklatmak için en uygun zaman, RNA'nın peletlendiği zamandır. Nükleik asit geri kazanımını iyileştirmek için DNA düşük bağlayıcı tüpler kullanıyoruz. Son reaksiyon hacmi 100 μL olmasına rağmen, EtOH çökeltme ile daha iyi saflaştırma için 1.5 mL (ve daha düşük hacimli olmayan) tüpler tercih edilir.

Reaksiyona girmemiş serbest boyalar çökeltme ve santrifüj filtrasyon ile uzaklaştırıldıktan sonra, floresan jel elektroforezi (Şekil 4A), UV-Vis spektroskopisi, analitik HPLC³ ile etiketlemeyi doğruladık. Bununla birlikte, bu yöntemlerin, her iki floroforu taşıyan bir RNA molekülü ile her biri tek bir renkle etiketlenmiş bir RNA karışımı arasında ayrım yapamayacağına dikkat etmek önemlidir. Benzer şekilde, bir RNA molekülünün aynı renkte birden fazla florofor taşıyıp taşımadığını belirlemek için kullanılamazlar. Boyut sınırlamaları nedeniyle kütle spektrometresi kullanılamaz. Topluluk³ ve tek moleküllü FRET spektroskopileri, Şekil 4B ve 5B'de gösterildiği gibi çift floresan etiketlemeyi doğrular. smFRET deneylerinde 0.5'lik stokiyometri (sCy3 ila Cy5 oranı 1:1), iki floroforun eşit konjugasyonunu doğrular. Bir endişe, önerilen siklizasyon yerine her iki aldehiti de etiketleyerek 3 'ucundaki çift etiketlemeydi. smFRET deneylerinde stokiyometrisi 0.25 (sCy3 ila Cy5 oranı 1:2) olan türlerin eksikliği, boya bağlanmasının ikinci bir boyanın bağlanmasını sterik olarak engellediğini ve önlediğini düşündürmektedir.

Bu çift floresan etiketleme ile FRET sinyal değişiklikleri, RNA katlanması ve katalizi boyunca yapısal yeniden düzenlemelere bağlanabilir. Tek moleküllü TIRF görüntüleme için kaçan alan içinde floresan etiketli RNA'yı korumak için, doğrudan yüzey bağlamaya göre kapsülleme tercih edilir. Bu yaklaşım, tek tek RNA moleküllerini veziküllerin lipid çift katmanları içinde yakalamayı ve dinamik davranışlarını gözlemlemeye elverişli kontrollü bir ortam yaratmayı içerir. Tarif edilen protokol, mono-kapsüllemeyi zenginleştirir, çünkü tek bir adımda foto ağartma^11'i gösterir. RNA katlanmasını ve işlevini anlamak için in vitro ve in vivo boşluğu köprülemek esastır²⁷. Moleküler kalabalık ajanlar, grup II intronları ^7,28 ile RNA katalizini arttırmak için hücrelerin içindeki koşulları taklit edebilir. Alternatif olarak, kapsülleme, RNA katlanmasını²⁹ teşvik eden kısıtlı mikro ortamlar yaratarak RNA yapısı ve dinamikleri hakkındaki anlayışımızı gerçekçi bir hücresel bağlama yaklaştırır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA labeling
1.5 mL DNA LoBind tubes	Eppendorf	30108035
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC-HCl or EDC)	Thermo Scientific	11844071	Pierce EDC, No-Weigh Format. Store at  -20 °C
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (titration)
Acetic acid (glacial)	Sigma-Aldrich	1.00063	100%, anhydrous for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Centrifugal filtration unit	Sartorius	VS0132	Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 μL
Cyanine5 hydrazide (Cy5-hydrazide)	Lumiprobe	23070	5 mg, CAS number 1427705-31-4
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	New England Biolabs	12611P	Molecular biology grade
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296P	Absolute ≥99,8%
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	for molecular biology, ≥99.0%
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	1.00317	fuming 37%, for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	130672	98%
Sodium acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	S8750	anhydrous, ReagentPlus, ≥99.0%
Sodium meta-periodate (NaIO4)	Thermo Fisher Scientific, Life Technologies	20504	Pierce product line
Sulfo-Cyanine3 amine (sCy3-amine)	Lumiprobe	213C0	5 mg, CAS number 2183440-43-7
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Biosolve	200923	Molecular biology grade
Chamber preparation
3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	99%
Acetone	Sigma-Aldrich	1.00014	for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Biotin-Polyethylene glycol-Succinimidyl valerate (biotin-PEG-SVA, bPEG) and Methoxy polyethylene glycol-Succinimidyl valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio, Inc.		BIO-PEG-SVA, MW 5,000 and MPEG-SVA, MW 5,000 - Combo Kit
Coverslips	Carl Roth	H876.2	24 x 24 mm, 0.13-0.16 mm thickness
Deconex 11 universal	Borer Chemie AG	17416492	Laboratory glassware cleaning solution
Diamond coated core drill bit	Crystalite corporation		1 mm thickness
Diamond driller
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296P	Absolute ≥99,8%
Glass Coplin staining jar with cover
Imaging spacer	Grace Bio-Labs	654008	SecureSeal, 8 wells,  9 mm × 0.12 mm
Oxygen plasma cleaner	Zepto One		Diener
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P9541	for molecular biology, ≥99.0%
Quartz slides	G. Finkenbeiner, Inc.		7.5 x 2.5 cm, 1 mm thickness
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297	BioXtra, 99.5-100.5%
Lipid cake preparation
16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt), C53H98N4O11PNaS)	Avanti Polar Lipids	870277P	Stable for 1 year at -20 °C
14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine or 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, C36H72NO8P)	Avanti Polar Lipids	850345P
2.0 mL microcentrifuge tubes, Safe-Lock	Eppendorf	0030120094	Autoclave to sterilize
500 mL Schlenk flask
Chloroform	Merck	1.02445	for analysis EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Parafilm
Surface immobilization via encapsulation
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox®)	Thermo Fischer	53188-07-1	97%
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (titration). Store at +4 °C in the dark.
Adhesive seal tabs	Grace Bio-Labs	629200
Catalase	Sigma-Aldrich	9001-05-2, C30	from bovine liver, aqueous suspension, 10,000-40,000 units/mg protein
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7528	≥99.5% (GC), BioXtra
Extruder polycarbonate (PC) membrane	Avanti Polar Lipids	610005-1EA	0.1 μm, 19 mm
Extruder set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	9001-37-0	from Aspergillus niger, Type VII,  lyophilized powder, ≥100,000 units/g solid (without added oxygen)
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	7786-30-3, M1028	for molecular biology, 1.00 M ± 0.01 M solution
Polyester (PE) drain disc, membrane	Whatman, Cytiva	230300	10 mm
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	60128	BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (AT)
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P9541	for molecular biology, ≥99.0%
Streptavidin	Thermo Fischer	434301