Fizyolojik intraluminal basınçlarda küçük pulmoner venlerde Ca2+ sinyallerinin görüntülenmesi

Özet

Bu protokolde, intrapulmoner venlerde (küçük pulmoner venler veya PV'ler) fizyolojik intraluminal basınçlarda Ca²⁺ sinyallerinin kaydedilmesi ve analiz edilmesi için yeni bir teknik sunuyoruz. Teknik, küçük PV'lerin izole edilmesini, bunların bir Ca²⁺ göstergesi ile inkübe edilmesini, kanüle edilmesini ve basınçlandırılmasını, Ca^{2 +} sinyallerinin konfokal görüntülemesini ve veri analizini içerir.

Özet

Pulmoner venler (PV'ler) oksijen açısından zengin kanı akciğerlerden sol kalbe geri taşır ve böylece oksijen açısından zengin kanın hayati organlara iletilmesinde önemli bir işlev görür. Bununla birlikte, pulmoner vasküler sistem ile ilgili çoğu çalışma, normal ve hastalık koşulları altında pulmoner arterler ve kılcal damarlar üzerine odaklanmıştır. Ca²⁺ sinyalleri vasküler fonksiyonun kritik düzenleyicileridir. PV'lerin kritik fizyolojik rollerine rağmen, küçük intrapulmoner PV'lerdeki Ca²⁺ sinyalleri fizyolojik koşullar altında kaydedilmemiştir. Burada, 5 mmHg'de izole edilmiş, kanüle edilmiş ve basınçlı fare PV'lerinde Ca²⁺ sinyal aktivitesini kaydetmek için bir teknik açıklıyoruz. Bir Ca^{2 +} göstergesi ekleyerek, fizyolojik koşullar altında yüksek hızlı, dönen disk konfokal görüntüleme kullanarak küçük PV'lerin miyosit tabakasındaki Ca^{2 +} sinyallerini inceleyebiliriz. Temsili verilerimiz, küçük PV miyositlerindeki Ca^{2 +} sinyallerine riyanodin reseptör iyon kanallarının açıklıklarının aracılık ettiğini göstermektedir. Bu yöntem, pulmoner vasküler fizyoloji ve bozukluklar alanındaki araştırmacılar için büyük ilgi görecektir.

Giriş

Pulmoner vaskülatür, gaz alışverişinde, oksijen eklenmesinde ve kandaki karbondioksitin uzaklaştırılmasında önemli bir rol oynar ^1,2. Pulmoner arterler (PA'lar) sağ kalpten oksijenden fakir kan alır. Gaz değişimi kılcal damarlar (alveolar kılcal damarlar) seviyesinde gerçekleşir ve oksijen açısından zengin kan, pulmoner venler (PV'ler) tarafından sol kalbe iletilir. Oksijen bakımından fakir kan taşıyan diğer damarların aksine, PV'ler oksijen açısından zengin kanı sol kalbe ve dolayısıyla vücuttaki hayati organlara iletmek için önemli bir işleve sahiptir. Bununla birlikte, normal ve hastalık koşulları altında PV fonksiyonunu düzenleyen sinyal mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır.

Pulmoner vasküler sistem ile ilgili çalışmalar ağırlıklı olarak PA'lar ve pulmoner kapillerler üzerine yoğunlaşmıştır. Son çalışmalar, endotel ve düz kas hücre katmanlarındaki Ca²⁺ sinyallerinin PA'ların ^3,4,5 fonksiyonunu düzenlemede çok önemli olduğunu göstermektedir. Ayrıca, anormal Ca²⁺ sinyal mekanizmaları, ^6,7,8,9,10 hastalık koşullarında PA'ların ve pulmoner kılcal damarların bozulmuş fonksiyonundan sorumludur. Bununla birlikte, intrapulmoner venler (küçük PV'ler) ile ilgili çalışmalar azdır. Sol kalbe bitişik büyük PV'lerde (kardiyak PV'ler) ektopik aktivite, insanlarda atriyal fibrilasyon kaynağı olarak önerilmiştir^11,12 ve spontan nabız¹³ ve Ca²⁺ sinyalleri 12,14,15 de büyük PV'lerde gösterilmiştir. Küçük PV'ler, büyük PV'lere oksijen açısından zengin kan sağlar. Bununla birlikte, küçük PV'lerdeki Ca^{2 +} sinyal mekanizmaları fizyolojik intraluminal basınçlar altında incelenmemiştir.

Bu yazıda, yüksek hızlı eğirme diski konfokal mikroskobu kullanarak PV miyositlerinde küçük PV'leri ve Ca²⁺ sinyallerini izole etmek, kanüle etmek ve basınçlandırmak için yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemin genel amacı, fizyolojik intraluminal basınçlar altında küçük PV miyositlerinde spontan ve indüklenmiş Ca²⁺ sinyallerini kaydetmektir. İntraluminal basınç, miyositlerde¹⁶ Ca²⁺ sinyallerinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynar. Tipik olarak, PV'ler 4 ila 10 mm Hg^17,18 arasında değişen fizyolojik intraluminal basınçlara maruz kalır. Kardiyak döngü boyunca intraluminal basınçtaki değişiklikler, PV miyositlerindeki Ca²⁺ sinyallerini etkileyebilir. Bu nedenle, bu sinyalleri fizyolojik koşullar altında incelememize ve değişen intraluminal basınçların onları nasıl etkilediğini incelememize izin veren bir teknik kullanmak önemlidir. Ek olarak, PV'lerle ilgili önceki araştırmaların çoğu daha büyük kardiyak PV'lere odaklanmıştır. Mevcut teknik, akciğerlerin derinliklerinde bulunan ve hem sağlık hem de hastalıkta akciğer fonksiyonunun düzenlenmesini anlamak için daha uygun olabilecek küçük PV'lere odaklanmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri, Virginia Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokoller 4100 ve 4120). C57BL6 / J 10-12 haftalık fareler, pentobarbital (90 mg / kg; intraperitoneal olarak) ile ötenazi yapılır, ardından akciğer dokusunun^toplanması için servikal çıkık ^3,4,19,20.

1. Küçük PV'lerin izolasyonu

1. Diseksiyon aletlerini ve bulaşıkları %100 etanol ile temizleyin, ardından deiyonize su ile yıkayın.
2. Göğüs boşluğunu açmak için makas kullanın. Akciğerlere en az dokunuşla kalbi ve akciğerleri göğüs boşluğundan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.
3. Dokuyu soğuk (4-10 °C) HEPES tamponlu fizyolojik tuz çözeltisi (HEPES-PSS, mM cinsinden, 10 HEPES, 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl₂ hekzahidrat, 2 CaCl₂ dihidrat ve 7 dekstroz, pH 1 M NaOH kullanılarak 7.4'e ayarlanmış) içeren Sylgard kaplı bir plakaya yerleştirin)^3,4,19. Şekil 1'de gösterildiği gibi, kalbi ve akciğerleri, büyük PV'ler ve PA'lar açıkça görülebilecek ve akciğerin sol lobu hafifçe gerilecek şekilde sabitlemek için diseksiyon pimleri kullanın.
4. Büyük pulmoner venleri (PV'ler) referans noktaları olarak kullanarak, küçük intrapulmoner venleri çevreleyen dokuyu (Şekil 1'de kesikli dikdörtgenle gösterilen yaklaşık 50-100 μm çapında küçük PV'ler) ince makasla dikkatlice çıkarın. Küçük PV'lerle doğrudan temastan kaçındığınızdan emin olun. Küçük PV'leri çevredeki dokudan nazikçe izole edin.
5. Küçük PV'lerin yaklaşık 1-2 mm uzunluğundaki segmentlerini izole edin. Küçük PV'leri 4-10 °C HEPES-PSS'ye yerleştirin.

2. Küçük PV'lerin Ca²⁺ göstergesi ile yüklenmesi

NOT: Küçük PV'ler, forsepslerin PV'lerin yalnızca uçlarına temas ettiğinden emin olarak dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Bu yöntem, daha önce^açıklanan tekniğin bir modifikasyonudur 3,7,20,21.

1. DMSO^2.5 ile 4 mM Fluo-3,4'lik bir stok konsantrasyonu hazırlayın. Yukarıdaki stok çözeltisini kullanarak, HEPES-PSS ile 10 μM fluo-4 ve% 0.04 pluronik asit hazırlayın.
2. Küçük PV'leri yükleme solüsyonu ile 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin (HEPES-PSS'de 10 μM fluo-4 ve %0,04 pluronik asit)^3,4. Tüpü alüminyum folyo ile örtün ve 37 ° C'de 1 saat inkübasyon için bir su banyosuna koyun.
3. İnkübasyondan sonra, yükleme solüsyonunu dikkatlice 4-10 °C HEPES-PSS ile değiştirin ve yıkama adımı olarak 30 dakika buz üzerinde tutun.

3. Küçük PV'lerin kanülasyonu

NOT: Bu yöntem, daha önce ^3,20,21'de açıklanan tekniğin bir modifikasyonudur.

1. Basınçlı miyografi odasını her iki tarafta birer tane olmak üzere iki cam kanül ile hazırlayın. Kanülleri PSS (119 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgCl₂ 160 hekzahidrat, 2.5 mM CaCl₂ dihidrat ^3,4,21,22, 7 mM dekstroz ve 24 mM NaHCO₃ ile doldurun, çözeltiyi %21 O₂ ve% 5 CO₂ ile köpürterek pH 7.4'te tutulun) 10 mL'lik bir şırınga kullanarak.
2. Yıkama solüsyonundan küçük bir PV'yi çıkarın ve basınçlı miyografi odasına yerleştirin. İnce uçlu forsepsler kullanarak, küçük PV'nin bir ucunu kanüllerden birine dikkatlice kanül edin. Ardından, naylon iplikten yapılmış bir mikrofilament kullanarak, sabitlemek için küçük PV'nin kanüllü ucuna ve kanülün ucuna bir düğüm atın.
3. PV içindeki kanı çıkarmak için PSS'yi kanülden nazikçe itin. Şekil 1'de gösterildiği gibi, diğer ucunu mikrofilamentler kullanarak bir cam kanül ile bağlamak için naylon iplik kullanın.

4. Küçük PV'nin basınçlandırılması ve Ca²⁺ görüntülenmesi

NOT: Bu yöntem, daha önce^açıklanan tekniğin bir modifikasyonudur ^3,21.

1. PSS içeren bir boruya bağlı bir servo basınç kontrolörü kullanarak, küçük PV'yi bir uçtan 5 mm Hg'de basınçlandırın. PSS'yi süper kaynaştırmak için hem girişe hem de çıkışa bağlı peristaltik bir pompa kullanın. Süperfüzyonun sıcaklığını 37 °C'de tutun.
2. Dengeleme süresinden sonra, 40x su daldırma objektifi (NA 0.8) ve dönen disk konfokal görüntüleme sistemi kullanarak 1000 kare (kare hızı: saniyede 30 kare) için Ca²⁺ görüntü elde edin. 488 nm katı hal lazeri kullanarak Fluo-4'ü uyarın ve 525/36 nm bant geçiren filtre kullanarak yayılan floresansı yakalayın.
3. Ryanodin reseptörü (RyR) antagonisti ryanodin (5 μM)^21,23 süper fuzata uygulayın. 5 dk bekleyin. Ca²⁺ görüntüleri yukarıda açıklandığı gibi yeniden çekin ve 30 kare/sn hızında 1000 kare daha yakalayın.

5. Ca²⁺ görüntü analizi

NOT: Bu yöntem, daha önce ^21,22,24 açıklanan tekniğin bir modifikasyonudur. PV miyositlerindeki Ca²⁺ sinyallerinin aktivitesindeki değişiklikler, PV'lerde uyarma-kasılma eşleşmesinin inhibisyonu veya arttırılması hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

1. Ca²⁺ görüntülerini analiz etmek için özel olarak tasarlanmış yazılımı (Dr. Adrian Bonev, https://github.com/vesselman/SparkAn tarafından geliştirilmiştir) kullanın.
2. 5 x 5 boxcar filtre ve 5 x 5 medyan filtre kullanarak pürüzsüz görüntüler. Olay otomatik algılama için birden çok hücreli düz bir PV bölgesini özetleyen bir çerçeve kullanın.
3. Görüntüle ve Olay Otomatik Algılama'ya tıklayın. Şu ayarları kullanın: 1,3 F/F₀ genliğinde olay eşiği, %20 tolerans, 7 x 7 piksel tarama kutusu ve çalışma ortalaması 7 görüntü. İlk görüntüden başlayarak her 10 görüntüde bir otomatik olarak ortalama görüntüler oluşturun.
4. Aramayı Başlat'a tıklayın (göz simgesi). Dosya menüsü altında Dosya İşaretle olarak kaydedilen olaylar tablosunu bulun. μm² başına olayları hesaplamak için, algılanan Ca²⁺ sinyallerinin sayısını seçilen çerçevenin alanına bölün.

Sonuçlar

Şekil 2A, 5 mm Hg intraluminal basınçta küçük bir PV'den bir görüş alanını göstermektedir. + sembolleri, yeşil anahat ile gösterilen seçili bir çerçeve (Video 2) içinde otomatik olarak algılanan Ca¹⁺ sinyallerini gösterir. Her PV'den bir görüş alanı kaydedildi ve her fareden bir PV kullanıldı. Küçük bir PV n=1 olarak kabul edildi. Dakikada μm² başına Ca²⁺ sinyallerinin sayısı, eşleştirilmiş deneylerde RyR inhibitörü ryanodin (5 μM) ²³ ilavesinden önce ve 5 dakika sonra karşılaştırıldı. Anlamlı farklılıkları tespit etmek için istatistiksel karşılaştırmalar için eşleştirilmiş bir t-testi kullanıldı. Kendiliğinden meydana gelen Ca²⁺ sinyallerinin sayısı, yukarıda açıklanan koşullar altında μm² başına dakikada 0.73 ± 0.2 olaydı (Şekil 2B, C). Riyanodin tedavisi, μm 2 başına dakika başına olaylarda ciddi bir azalma ile gösterildiği gibi, küçük PV'lerde Ca^{2 +} sinyallerini neredeyse tamamen inhibe etti (Şekil 2C, Video 2). Bu veriler, basınçlı küçük PV'lerden gelen miyosit tabakasındaki Ca²⁺ sinyallerinin spontan aktivitesinin RyR'lerin açıklıklarını temsil ettiğini göstermektedir. Bu sonuçlar, Ca^{2 +} sinyallerinin aktivitesinin fizyolojik intraluminal basınçlar altında küçük PV'lerde incelenebileceğine dair kanıt sağlar. Bu yöntem, intraluminal basınç ve nörohumoral mediatörlerin küçük PV miyositlerinde Ca^{2 +} sinyalizasyonu üzerindeki etkileri üzerine gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracak ve potansiyel olarak PV fonksiyonunun düzenlenmesi hakkında değerli bilgiler sunacaktır. Mevcut çalışma RyR Ca²⁺ sinyallerinin sayısına odaklanırken, bu sinyallerin süre, genlik, uzamsal yayılma ve yükselme süresi dahil olmak üzere kinetik özelliklerini analiz etmek de mümkündür. Fizyolojik ve patolojik uyaranların RyR Ca²⁺ sinyallerinin kinetik özelliklerini nasıl etkilediğini anlamak, hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda PV fonksiyonunun düzenlenmesi ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir.

Şekil 1: PV'lerin hazırlanması ve Ca²⁺ görüntülemesi. Küçük PV'lerin tanımlanması ve izolasyonu, fluo4-'nin inkübasyonu, kanülasyon ve basınçlandırma (5 mm Hg), eğirme diski yüksek hızlı konfokal görüntüleme ve görüntü analizini gösteren sıralı görüntüler. Soldaki resimde yer alan kesikli dikdörtgen, etüt için kullanılan PV'yi temsil eder. Kısaltmalar: PA = pulmoner arter; RA = sağ atriyum; PV = pulmoner ven; LA = sol atriyum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ca²⁺ görüntülemenin analizi. (A) Basınçlı (5 mm Hg), fluo-4 yüklü, ryanodin (solda) veya varlığında küçük bir PV'den (5 μM; RyR inhibitörü, sağda). Yeşil dikdörtgen, otomatik algılama Ca²⁺ sinyalleri için seçilen alanı belirtir. + işaretleri, çerçeve içinde otomatik olarak algılanan olayları temsil eder. Kırmızı işaretler 3000 μm^2'den daha az alana sahip sinyalleri gösterirken, mavi işaretler 3000 μm^2'den fazla bir alanı kaplayan sinyalleri gösterir. Her + işareti bir Ca²⁺ olayını veya sinyalini gösterir. (B) Bazal koşullar altında (solda) ve riyanodin varlığında (sağda) basınçlı küçük PV'lerden miyosit tabakasındaki Ca²⁺ sinyallerinin aktivitesini gösteren, A'da belirtilen seçili alandan tespit edilen olayların F/F0 izleri. (C) Riyanodin ilavesinden önce ve sonra küçük PV'lerde Ca²⁺ sinyallerinin μm^2'si başına dakika başına olayların ölçülmesi (fare başına 1 PV; n = 6 fare; ** p < 0.01'e karşı Bazal; eşleştirilmiş t-testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Riyanodin ile muameleden önce 5 mm Hg'de basınçlandırılan küçük bir PV'deki Ca²⁺ sinyalleri. Görüş alanı, Şekil 2'de yeşil renkle gösterilen seçili çerçeveyi temsil eder. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Ryanodin (5 μM) ile muameleden sonra 5 mm Hg'de basınçlandırılan küçük bir PV'de Ca² + sinyalleri. Görüş alanı, Şekil 2'de yeşil renkle gösterilen seçili çerçeveyi temsil eder. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Düz kas hücrelerindeki Ca²⁺ sinyalleri, vasküler fonksiyonun düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar²⁵. PV'ler, sol kalbe oksijen açısından zengin kan vermekten sorumlu önemli ancak nispeten az çalışılmış bir vasküler yataktır²⁶. Bununla birlikte, küçük PV'lerdeki Ca²⁺ sinyal mekanizmaları ve bunların fizyolojik fonksiyon üzerindeki etkileri bilinmemektedir. Bu makalenin amacı, miyosit tabakasındaki Ca²⁺ sinyallerini kaydetmek ve bu Ca²⁺ sinyallerini analiz etmek için küçük PV'leri izole etmek, kanüle etmek ve basınçlandırmak için yeni bir yöntem tanımlamaktır. Küçük PV'lerde Ca^{2 +} sinyallerini görselleştirme yeteneği, bu sinyallerin normal ve hastalıklı koşullar altında nasıl çalıştığına dair anlayışımızı geliştirmemize yardımcı olabilir. Sağlam akciğerdeki PV'lerde Ca^{2 +} sinyallerini incelemek fizyolojik olarak daha ilgili veriler sağlarken, küçük PV'ler sağlam akciğerde açıkça görülemez, bu da Ca^{2 +} boyalarının yüklenmesi ve konfokal görüntüleme ile ilgili teknik zorluklara neden olabilir. Küçük PV'leri izole etmek ve basınçlandırmak, fizyolojik intraluminal basınçlar, sıcaklık ve iyonik çözeltiler altında Ca²⁺ sinyallerini gözlemlemek için alternatif bir yol sunar.

Bu yazıda açıklanan PV'lerin Ca²⁺ görüntülemesi, sistemik arterlerde Ca²⁺ görüntüleme için iyi bilinen prosedürümüz dayanmaktadır 21,22,27. Veriler, küçük PV miyositlerindeki Ca²⁺ sinyallerinin çoğunun RyR iyon kanallarının açıklıklarından kaynaklandığını göstermektedir. Bu nedenle, bu yazıda özetlenen protokol, RyR regülasyonu ve bunun normal koşullar altında ve hastalıklarda PV işlevi üzerindeki etkisi ile ilgili gelecekteki çalışmaları mümkün kılacaktır. RyR2 aktivitesi, kardiyak miyositlerdeki⁽²⁸) kasılmalar için gereklidir, arteriyel düz kas hücrelerinde ise gevşeme²⁹ ile ilişkilendirilmiştir. RyR aktivitesinin küçük PV kasılması üzerindeki kesin etkisi bilinmemektedir. Basınç miyografisi, küçük kan damarlarının kasılmasındaki değişiklikleri izlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu nedenle, basınçlı PV hazırlığının küçük PV kasılmalarını izlemek için de kullanılması muhtemeldir.

Ryanodin, RyR aktivitesi üzerinde konsantrasyona bağlı etkiler gösterir, onu submikromolar konsantrasyonlarda arttırır ve mikromolar konsantrasyonlarda azaltır²³. Ryanodin ayrıca küçük PV'lerde diğer Ca^{2 +} sinyalleri üzerinde dolaylı bir inhibitör etkiye sahip olabilir, bu test edilmemiş bir olasılıktır. Kullanılan konsantrasyonda, PV'lerde Ca²⁺ sinyallerinde telafi edici bir artış gözlemlemedik. İzole edilmiş ve basınçlı PV'lerdeki Ca^{2 +} sinyallerinin düzenlenmesi, sağlam bir akciğer içindeki PV'lerdekilerden farklı olabilir, bu henüz araştırılmamış bir olasılıktır. Bununla birlikte, anestezi uygulanmış bir fareden alınan sağlam akciğerdeki küçük PV'lerde Ca²⁺ sinyallerinin kaydedilmesi, akciğerin göğüs boşluğundaki konumundan ve anestezi uygulanmış bir farede PV'lerde seçici olarak bir Ca²⁺ göstergesinin yüklenmesinin zorluğundan kaynaklanan önemli zorluklar sunar.

Kan akışı kesme stresinin kan damarlarının işlevini değiştirdiği bilinmektedir. Mevcut yöntem, küçük PV'lerde intraluminal basıncın Ca²⁺ sinyalleri üzerindeki etkisinin izole edilmesine izin verse de, akış veya kesme gerilimi eksikliği potansiyel bir sınırlamadır. Bununla birlikte, akış veya kesme gerilimi, daha önce açıklanan kurulumlar kullanılarak Ca²⁺ görüntüleme ile birlikte kolayca dahil edilebilir ve gerçekleştirilebilir²¹. Akış/kesme geriliminin küçük PV'lerde Ca²⁺ sinyallerinin aktivitesini değiştirmesi mümkündür, bu da gelecekteki araştırmalar için ilginç bir konu olacaktır.

Küçük PV'lerde Ca 2+ sinyallerini kaydetmek için Ca²⁺ göstergesi olarak fluo-4-kullandık. Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, 488 nm (Calbryte 520)⁷ veya 560 nm'de (Calbryte 590)³⁰ uyarılabilen diğer Ca 2⁺ göstergelerini kullanmak mümkün olmalıdır. Dönen disk konfokal görüntüleme sisteminin kullanılması, özellikle PV miyositlerinde Ca²⁺ sinyallerinin görüntülenmesine izin verir. Bu çalışmada çalışılmamış olmasına rağmen, endotel hücre tabakasına odaklanmak, küçük PV'lerde endotelyal Ca^{2 +} sinyallerinin kaydedilmesine izin verecektir. PA'lar ve PV'ler işlevsel olarak farklıdır ve farklı mikro ortamlara maruz kalırlar. Bu nedenle, küçük PA'lar ve küçük PV'ler arasındaki miyosit ve endotelyal Ca^{2 +} sinyallerinin karşılaştırılması, fonksiyonel farklılıkları hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Küçük PV'lerdeki Ca²⁺ sinyallerinin PV'ler aracılığıyla oksijen açısından zengin kan akışını düzenlemesi akla yatkındır. Sol atriyum içindeki basınç her kardiyak siklus sırasında 4 mmHg'dan 12 mmHg'ye değişir^17,18. PV'ler sol atriyuma kan sağladığından, PV'lerin içindeki basıncın da kardiyak döngü sırasında değişmesi muhtemeldir. Önceki çalışmalar, RyR'lerin küçük arterlerde intraluminal basınçla aktive edilebileceğini göstermiştir¹⁶. Bu nedenle, intraluminal basıncın PV Ca²⁺ sinyalleri üzerindeki etkisinin ölçülmesi, oksijen açısından zengin kanın PV'lerden sol kalbe iletilmesi hakkında yeni bilgiler sağlayabilir. Kan dolaşımındaki sinir stimülasyonu ve humoral aracılar da düz kas Ca²⁺ sinyallerini aktive edebilir. Mevcut yöntem, nörohumoral mediatörlerin PV Ca²⁺ sinyalleri ve PV fonksiyonu üzerindeki etkisi üzerine gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır.

Protokol içinde dikkat edilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Pulmoner venlerin (PV'ler) dikkatli bir diseksiyonu son derece önemlidir. PV'lerin görüntüleme alanına diseksiyon araçlarıyla dokunmaktan kaçınmak çok önemlidir, çünkü bu onların sağlığını olumsuz yönde etkileyebilir. PV'lerin sadece uçlarına dokunulmalıdır. Diseksiyon süresinin kısaltılması başarı oranını artırabilir. Yetersiz boya yüklemesi, daha düşük bir sinyal-gürültü oranına neden olabilir ve olay otomatik algılama sırasında yanlış pozitifler olasılığını artırabilir. Burada özetlenen protokolün izlenmesi, PV miyositlerinde yeterli boya yüklemesini sağlamalıdır.

Özetle, bu önemli ancak genellikle gözden kaçan vasküler yatakta Ca²⁺ sinyal mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanıyan küçük PV'lerde Ca²⁺ sinyallerini kaydetmek için bir yöntem sunduk. Daha da önemlisi, normal koşullar altında küçük PV'lerde Ca^{2 +} sinyallerini kaydetme yeteneği, pulmoner hipertansiyon, akciğer hasarı ve kalp yetmezliğine bağlı akciğer ödemi dahil olmak üzere akciğer hastalıkları için patolojik mekanizmaların değerli bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom-Designed SparkAn Software	University of Vermont		https://github.com/vesselman/SparkAn
Fluo-4, AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FN1 Upright Microscope	Nikon
Heater/Temperature Controller	Warner Instruments
Imaging System	Andor
iQ 3.x acquisition Software	Andor
iXon EMCCD Cameras	Andor
Nylon Thread for Tying Blood Vessels	Living Systems Instrumentation	THR-G
Pressure Myography Chamber	Instrumentation and Model Facility, University of Vermont, Burlington, VT, USA
Revolution WD (with Borealis) High Speed Spinning Disk Confocal Imaging System	Andor
Ryanodine	Bio-Techne	1329
Servo Pressure Controller	Living Systems Instrumentation
SS Dissection Pins, 0.2mm dia	Living Systems Instrumentation	PIN-0.2mm
Tubing Pump REGLO	ISMATEC	ISM4212