Imaging dei segnali Ca2+ in piccole vene polmonari a pressioni intraluminali fisiologiche

Riepilogo

In questo protocollo, presentiamo una nuova tecnica per la registrazione e l'analisi dei segnali di Ca²⁺ nelle vene intrapolmonari (piccole vene polmonari o PV) a pressioni intraluminali fisiologiche. La tecnica prevede l'isolamento di piccoli PV, l'incubazione con un indicatore di Ca²⁺ , l'incannulamento e la pressurizzazione, l'imaging confocale dei segnali di Ca²⁺ e l'analisi dei dati.

Abstract

Le vene polmonari (PV) trasportano il sangue ricco di ossigeno dai polmoni al cuore sinistro, svolgendo così un'importante funzione nella consegna di sangue ricco di ossigeno agli organi vitali. Tuttavia, la maggior parte degli studi sulla vascolarizzazione polmonare si è concentrata sulle arterie polmonari e sui capillari in condizioni normali e di malattia. I segnali del Ca²⁺ sono regolatori critici della funzione vascolare. Nonostante i ruoli fisiologici critici dei PV, i segnali di Ca²⁺ nei piccoli PV intrapolmonari non sono stati registrati in condizioni fisiologiche. Qui, descriviamo una tecnica per registrare l'attività del segnale Ca²⁺ in PV di topo isolati, cannulati e pressurizzati a 5 mmHg. Incorporando un indicatore di Ca²⁺ , possiamo studiare i segnali di Ca²⁺ nello strato miocitario di piccoli PV utilizzando l'imaging confocale a disco rotante ad alta velocità in condizioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi indicano che i segnali del Ca²⁺ nei piccoli miociti PV sono mediati dalle aperture dei canali ionici del recettore della rianodina. Questo metodo sarà di notevole interesse per i ricercatori nel campo della fisiologia e dei disturbi vascolari polmonari.

Introduzione

Il sistema vascolare polmonare svolge un ruolo importante nello scambio di gas, nell'aggiunta di ossigeno e nella rimozione dell'anidride carbonica dal sangue ^1,2. Le arterie polmonari (PA) ricevono sangue povero di ossigeno dal cuore destro. Lo scambio gassoso avviene a livello dei capillari (capillari alveolari) e il sangue ricco di ossigeno viene consegnato al cuore sinistro dalle vene polmonari (PV). A differenza di altre vene che trasportano sangue povero di ossigeno, i PV svolgono un'importante funzione di fornire sangue ricco di ossigeno al cuore sinistro e, di conseguenza, agli organi vitali del corpo. Tuttavia, i meccanismi di segnalazione che regolano la funzione PV in condizioni normali e di malattia sono scarsamente compresi.

Gli studi sulla vascolarizzazione polmonare si sono concentrati principalmente sui PA e sui capillari polmonari. Studi recenti dimostrano che i segnali del Ca²⁺ negli strati endoteliali e nelle cellule muscolari lisce sono cruciali nella regolazione della funzione dei PA ^3,4,5. Inoltre, meccanismi di segnalazione anomali del Ca²⁺ sono responsabili della compromissione della funzione dei PA e dei capillari polmonari in condizioni di malattia 6,7,8,9,10. Tuttavia, gli studi sulle vene intrapolmonari (piccole PV) rimangono scarsi. L'attività ectopica in grandi PV adiacenti al cuore sinistro (PV cardiaci) è stata proposta come fonte di fibrillazione atriale nell'uomo^11,12, e la pulsazione spontanea¹³ e i segnali Ca²⁺ 12,14,15 sono stati dimostrati anche in PV di grandi dimensioni. I PV piccoli forniscono sangue ricco di ossigeno ai PV di grandi dimensioni. Tuttavia, i meccanismi di segnalazione del Ca²⁺ in piccoli PV non sono stati studiati sotto pressioni intraluminali fisiologiche.

In questo manoscritto, introduciamo un nuovo metodo per isolare, incannulare e pressurizzare piccoli PV e imaging di segnali Ca²⁺ nei miociti PV utilizzando la microscopia confocale a disco rotante ad alta velocità. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare segnali Ca²⁺ spontanei e indotti in piccoli miociti PV sotto pressioni intraluminali fisiologiche. La pressione intraluminale svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dei segnali del Ca²⁺ nei miociti¹⁶. Tipicamente, i PV sono sottoposti a pressioni intraluminali fisiologiche che vanno da 4 a 10 mm Hg^17,18. Le variazioni della pressione intraluminale durante il ciclo cardiaco possono influenzare i segnali del Ca²⁺ nei miociti PV. Pertanto, è essenziale utilizzare una tecnica che ci permetta di studiare questi segnali in condizioni fisiologiche ed esaminare come le variazioni delle pressioni intraluminali li influenzano. Inoltre, la maggior parte delle ricerche precedenti sui PV si è concentrata sui PV cardiaci più grandi. La tecnica attuale si concentra su piccoli PV situati in profondità nei polmoni, che possono essere più rilevanti per comprendere la regolazione della funzione polmonare sia in salute che in malattia.

Protocollo

Tutti i protocolli per gli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia (protocolli 4100 e 4120). I topi C57BL6/J, di età compresa tra 10 e 12 settimane, vengono soppressi con pentobarbital (90 mg/kg; per via intraperitoneale), seguiti da lussazione cervicale per la raccolta di tessuto polmonare 3,4,19,20.

1. Isolamento di piccoli PV

1. Pulire gli strumenti di dissezione e le stoviglie con etanolo al 100%, quindi lavarli con acqua deionizzata.
2. Usa le forbici per aprire la cavità toracica. Usa una pinza per rimuovere con cura il cuore e i polmoni dalla cavità toracica con un tocco minimo dei polmoni.
3. Porre il tessuto su una piastra rivestita di Sylgard contenente una soluzione salina fisiologica tamponata con HEPES fredda (4-10 °C) (HEPES-PSS, in mM, 10 HEPES, 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl₂ esaidrato, 2 CaCl₂ diidrato e 7 destrosio, pH regolato a 7,4 utilizzando 1 M NaOH)^3,4,19. Utilizzare perni di dissezione per bloccare il cuore e i polmoni in modo tale che i grandi PV e PA siano chiaramente visibili e il lobo sinistro del polmone sia leggermente allungato, come mostrato nella Figura 1.
4. Utilizzando le grandi vene polmonari (PV) come punti di riferimento, rimuovere con cura il tessuto che circonda le piccole vene intrapolmonari (piccole PV, circa 50-100 μm di diametro, indicate dal rettangolo tratteggiato nella Figura 1) con forbici sottili. Assicurati di evitare il contatto diretto con i piccoli PV. Isolare delicatamente i piccoli PV dal tessuto circostante.
5. Isolare segmenti lunghi circa 1-2 mm di piccoli PV. Posizionare i piccoli PV in HEPES-PSS a 4-10 °C.

2. Caricamento di piccoli PV con un indicatore Ca²⁺

NOTA: I PV piccoli devono essere maneggiati con cura, assicurandosi che le pinze tocchino solo le punte dei PV. Questo metodo è una modifica della tecnica descritta in precedenza 3,7,20,21.

1. Preparare una concentrazione stock di 2,5 mM Fluo-4 AM con DMSO ^3,4. Utilizzando la soluzione madre di cui sopra, preparare 10 μM di fluo-4 AM e acido pluronico allo 0,04% con HEPES-PSS.
2. Posizionare piccoli PV in una provetta da 1,5 mL con la soluzione di carico (10 μM di fluo-4 AM e 0,04% di acido pluronico in HEPES-PSS)^3,4. Coprire la provetta con un foglio di alluminio e metterla a bagnomaria per l'incubazione a 37 °C per 1 ora.
3. Dopo l'incubazione, sostituire con cura la soluzione di carico con HEPES-PSS a 4-10 °C e tenere in ghiaccio per 30 minuti come fase di lavaggio.

3. Incannulamento di piccoli PV

NOTA: Questo metodo è una modifica della tecnica descritta in precedenza ^3,20,21.

1. Preparare la camera per miografia a pressione con due cannule di vetro, una per lato. Riempire le cannule con PSS (119 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂ 160 esaidrato, 2,5 mM CaCl₂ diidrato ^3,4,21,22, 7 mM destrosio e 24 mM NaHCO₃, mantenuto a pH 7,4 facendo gorgogliare la soluzione con 21% O₂ e 5% CO₂) utilizzando una siringa da 10 mL.
2. Rimuovere un piccolo PV dalla soluzione di lavaggio e posizionarlo nella camera di miografia a pressione. Usando una pinza a punta fine, incannula con cura un'estremità del piccolo PV su una delle cannule. Quindi, utilizzando un microfilamento di filo di nylon, fare un nodo attorno all'estremità cannulata del piccolo PV e alla punta della cannula per fissarlo.
3. Spingere delicatamente il PSS attraverso la cannula per rimuovere il sangue all'interno del PV. Utilizzare un filo di nylon per legare l'altra estremità con una cannula di vetro utilizzando microfilamenti, come mostrato nella Figura 1.

4. Pressurizzazione eimaging al Ca²⁺ di piccole PV

NOTA: Questo metodo è una modifica della tecnica descritta in precedenza ^3,21.

1. Utilizzando un servoregolatore di pressione collegato a un tubo contenente PSS, pressurizzare il piccolo PV da un'estremità a 5 mm Hg. Utilizzare una pompa peristaltica collegata sia a un ingresso che a un'uscita, per sovrafondere il PSS. Mantenere la temperatura del superfusato a 37 °C.
2. Dopo il periodo di equilibrio, acquisire immagini Ca²⁺ per 1000 fotogrammi (frame rate: 30 fotogrammi al secondo) utilizzando l'obiettivo a immersione in acqua 40x (NA 0,8) e un sistema di imaging confocale a disco rotante. Eccita Fluo-4 utilizzando un laser a stato solido a 488 nm e cattura la fluorescenza emessa utilizzando un filtro passa-banda a 525/36 nm.
3. Applicare l'antagonista del recettore della rianodina (RyR) rianodina (5 μM)^21,23 al superfusato. Attendere 5 minuti. Ripeti le immagini Ca²⁺ come descritto sopra, catturando altri 1000 fotogrammi a una velocità di 30 fotogrammi/s.

5. Analisi delle immagini Ca²⁺

NOTA: Questo metodo è una modifica della tecnica descritta in precedenza 21,22,24. I cambiamenti nell'attività dei segnali del Ca²⁺ nei miociti PV possono fornire importanti informazioni sull'inibizione o sul miglioramento dell'accoppiamento eccitazione-contrazione nei PV.

1. Utilizza un software progettato su misura (sviluppato dal Dr. Adrian Bonev, https://github.com/vesselman/SparkAn) per analizzare le immagini Ca²⁺ .
2. Immagini fluide utilizzando il filtro boxcar 5 x 5 e il filtro mediano 5 x 5. Utilizzare un frame che delinea una regione piatta di PV con più celle per il rilevamento automatico degli eventi.
3. Fare clic su Visualizza e rilevamento automatico eventi. Utilizzare le seguenti impostazioni: soglia evento a un'ampiezza di 1,3 F/F₀, tolleranza del 20%, casella di scansione di 7 x 7 pixel e media corrente di 7 immagini. Genera automaticamente immagini medie ogni 10 immagini, a partire dalla prima immagine.
4. Fare clic su Avvia ricerca (l'icona a forma di occhio). Individuare la tabella degli eventi salvata come file di contrassegno nel menu File. Per calcolare gli eventi per μm², dividere il numero di segnali Ca²⁺ rilevati per l'area del frame selezionato.

Risultati

La Figura 2A mostra un campo visivo da un piccolo PV a una pressione intraluminale di 5 mm Hg. I simboli + indicano i segnali Ca²⁺ rilevati automaticamente all'interno di un fotogramma selezionato (Video 1), indicato dal contorno verde. Un campo visivo è stato registrato da ogni PV e un PV è stato utilizzato da ciascun mouse. Un piccolo PV è stato considerato come n=1. Il numero di segnali Ca²⁺ per μm² al minuto è stato confrontato prima e 5 minuti dopo l'aggiunta dell'inibitore RyR rianodina (5 μM)²³ in esperimenti accoppiati. Un t-test accoppiato è stato utilizzato per confronti statistici per rilevare differenze significative. Il numero di segnali di Ca²⁺ che si verificano spontaneamente è stato di 0,73 ± 0,2 eventi al minuto per μm² (Figura 2B, C) nelle condizioni sopra descritte. Il trattamento con rianodina ha inibito quasi completamente i segnali di Ca²⁺ in piccoli PV (Figura 2C, Video 2), come indicato da una drastica riduzione degli eventi al minuto per μm². Questi dati mostrano che l'attività spontanea dei segnali di Ca²⁺ nello strato miocitario da piccoli PV pressurizzati rappresenta un'apertura di RyR. Questi risultati forniscono la prova che l'attività dei segnali di Ca²⁺ può essere studiata in piccoli PV sotto pressioni intraluminali fisiologiche. Questo metodo faciliterà studi futuri sugli effetti della pressione intraluminale e dei mediatori neuroumorali sulla segnalazione del Ca²⁺ nei piccoli miociti PV, offrendo potenzialmente preziose informazioni sulla regolazione della funzione PV. Mentre l'attuale studio si concentra sul numero di segnali RyR Ca²⁺ , è anche possibile analizzare le proprietà cinetiche di questi segnali, tra cui la durata, l'ampiezza, la diffusione spaziale e il tempo di salita. Comprendere come gli stimoli fisiologici e patologici influenzano le proprietà cinetiche dei segnali RyR Ca²⁺ può fornire importanti informazioni sulla regolazione della funzione PV sia in stati sani che malati.

Figura 1: Preparazione e imaging del Ca²⁺ dei PV. Immagini sequenziali che mostrano l'identificazione e l'isolamento di piccole PV, l'incubazione di fluo4-AM, l'incannulamento e la pressurizzazione (5 mm Hg), l'imaging confocale ad alta velocità del disco rotante e l'analisi delle immagini. Il rettangolo tratteggiato nell'immagine a sinistra rappresenta il PV utilizzato per lo studio. Abbreviazioni: PA = arteria polmonare; RA = atrio destro; PV = vena polmonare; LA = atrio sinistro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dell'imaging al Ca²⁺ . (A) Immagini di un campo visivo da un piccolo PV pressurizzato (5 mm Hg), caricato con fluo-4, in assenza (a sinistra) o in presenza di rianodina (5 μM; Inibitore di RyR, a destra). Il rettangolo verde indica l'area selezionata per il rilevamento automatico dei segnali Ca²⁺ . I segni + rappresentano gli eventi rilevati automaticamente all'interno del frame. I segnali rossi indicano segnali con un'area inferiore a 3000 μm², mentre i segnali blu indicano segnali che occupavano un'area superiore a 3000 μm². Ogni segno + indica un evento o un segnale Ca²⁺ . (B) F/F0 tracce di eventi rilevati dall'area selezionata indicata in A, che mostrano l'attività di segnali Ca²⁺ nello strato miocitario da piccoli PV pressurizzati in condizioni basali (a sinistra) e in presenza di rianodina (a destra). (C) Quantificazione di eventi al minuto per μm² di segnali Ca²⁺ in piccoli PV prima e dopo l'aggiunta di rianodina (1 PV per topo; n=6 topi; **p < 0,01 vs Basale; t-test accoppiato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Segnali di Ca²⁺ in un piccolo PV pressurizzato a 5 mm Hg prima del trattamento con rianodina. Il campo visivo rappresenta il fotogramma selezionato, mostrato in colore verde nella Figura 2. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Segnali Ca²⁺ in un piccolo PV pressurizzato a 5 mm Hg dopo il trattamento con rianodina (5 μM). Il campo visivo rappresenta il fotogramma selezionato, mostrato in colore verde nella Figura 2. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

I segnali del Ca²⁺ nelle cellule muscolari lisce svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della funzione vascolare²⁵. I PV sono un letto vascolare importante ma relativamente poco studiato responsabile della fornitura di sangue ricco di ossigeno al cuore sinistro²⁶. Tuttavia, i meccanismi di segnalazione del Ca²⁺ nei piccoli PV e il loro impatto sulla funzione fisiologica sono sconosciuti. L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere un nuovo metodo per isolare, incannulare e pressurizzare piccoli PV per registrare segnali di Ca²⁺ nello strato di miociti e per analizzare questi segnali di Ca²⁺ . La capacità di visualizzare i segnali di Ca²⁺ in piccoli PV potrebbe aiutare a far progredire la nostra comprensione di come funzionano questi segnali in condizioni normali e malate. Mentre lo studio dei segnali di Ca²⁺ nelle PV all'interno del polmone intatto fornirebbe dati fisiologicamente più rilevanti, le piccole PV non sono chiaramente visibili nel polmone intatto, il che può introdurre sfide tecniche con il carico di coloranti Ca²⁺ e l'imaging confocale. L'isolamento e la pressurizzazione di piccoli PV offre un modo alternativo per osservare i segnali di Ca²⁺ sotto pressioni intraluminali fisiologiche, temperatura e soluzioni ioniche.

L'imaging del Ca²⁺ dei PV descritto in questo manoscritto si basa sulla nostra procedura consolidata per l'imaging del Ca²⁺ nelle arterie sistemiche 21,22,27. I dati indicano che la maggior parte dei segnali di Ca²⁺ nei piccoli miociti PV sono dovuti all'apertura dei canali ionici RyR. Pertanto, il protocollo delineato in questo manoscritto consentirà studi futuri sulla regolazione del RyR e sul suo impatto sulla funzione del PV in condizioni normali e nelle malattie. L'attività di RyR2 è essenziale per le contrazioni nei miociti cardiaci²⁸, mentre nelle cellule muscolari lisce arteriose è stata associata al rilassamento²⁹. L'effetto preciso dell'attività di RyR sulla contrazione di piccole PV rimane sconosciuto. La miografia pressoria è una tecnica comunemente usata per monitorare i cambiamenti nella contrazione dei piccoli vasi sanguigni. Pertanto, è probabile che la preparazione fotovoltaica pressurizzata possa essere utilizzata anche per monitorare piccole contrazioni fotovoltaiche.

La rianodina mostra effetti concentrazione-dipendenti sull'attività di RyR, aumentandola a concentrazioni submicromolari e diminuendola a concentrazioni micromolari²³. La rianodina può anche avere un effetto inibitorio indiretto su altri segnali del Ca²⁺ in piccoli PV, una possibilità che non è stata testata. Alla concentrazione utilizzata, non abbiamo osservato un aumento compensatorio dei segnali di Ca²⁺ nei PV. La regolazione dei segnali di Ca²⁺ nei PV isolati e pressurizzati può differire da quella dei PV all'interno di un polmone intatto, una possibilità che deve ancora essere esplorata. Tuttavia, la registrazione di segnali di Ca²⁺ in piccoli PV nel polmone intatto da un topo anestetizzato presenta sfide significative, derivanti dalla posizione del polmone nella cavità toracica e dalla difficoltà di caricare selettivamente un indicatore di Ca²⁺ nei PV in un topo anestetizzato.

È noto che lo stress da taglio del flusso sanguigno altera la funzione dei vasi sanguigni. Sebbene il metodo attuale consenta di isolare l'effetto della pressione intraluminale sui segnali di Ca²⁺ in piccoli PV, la mancanza di flusso o di sforzo di taglio è una potenziale limitazione. Tuttavia, lo sforzo di flusso o di taglio può essere facilmente incorporato ed eseguito in combinazione con l'imaging Ca²⁺ utilizzando le configurazioni descritte in precedenza²¹. È possibile che lo sforzo di flusso/taglio modifichi l'attività dei segnali di Ca²⁺ in piccoli PV, il che sarebbe un argomento interessante per future indagini.

Abbiamo utilizzato il fluo-4-AM come indicatore di Ca²⁺ per registrare segnali di Ca²⁺ in piccoli PV. A seconda delle esigenze sperimentali, dovrebbe essere possibile utilizzare altri indicatori di Ca²⁺ che possono essere eccitati a 488 nm (Calbryte 520 AM)⁷ o 560 nm (Calbryte 590 AM)³⁰. L'uso di un sistema di imaging confocale a disco rotante consente l'imaging di segnali di Ca²⁺ , in particolare nei miociti PV. Sebbene non sia stato studiato nel presente studio, concentrarsi sullo strato cellulare endoteliale consentirà la registrazione di segnali endoteliali di Ca²⁺ in piccoli PV. PA e PV sono funzionalmente diversi e sono esposti a microambienti distinti. Pertanto, un confronto dei segnali Ca²⁺ dei miociti e dell'endotelio tra piccoli PA e piccoli PV può fornire informazioni cruciali sulle loro differenze funzionali.

È plausibile che i segnali di Ca²⁺ in piccoli PV regolino il flusso di sangue ricco di ossigeno attraverso i PV. La pressione all'interno dell'atrio sinistro varia da 4 mmHg a 12 mmHg durante ogni ciclo cardiaco ^17,18. Poiché i PV forniscono sangue all'atrio sinistro, è probabile che anche la pressione all'interno dei PV cambi durante il ciclo cardiaco. Studi precedenti hanno dimostrato che i RyR possono essere attivati dalla pressione intraluminale nelle piccole arterie¹⁶. Pertanto, la misurazione dell'effetto della pressione intraluminale sui segnali PV Ca²⁺ può fornire nuove informazioni sulla consegna di sangue ricco di ossigeno dai PV al cuore sinistro. La stimolazione nervosa e i mediatori umorali nel flusso sanguigno possono anche attivare i segnali Ca²⁺ della muscolatura liscia. L'attuale metodo faciliterà gli studi futuri sull'impatto dei mediatori neuroumorali sui segnali PV Ca²⁺ e sulla funzione PV.

Ci sono alcuni passaggi critici all'interno del protocollo che dovrebbero essere curati. Un'attenta dissezione delle vene polmonari (PV) è estremamente importante. È fondamentale evitare di toccare l'area di imaging dei PV con strumenti di dissezione, poiché ciò può influire negativamente sulla loro salute. Devono essere toccate solo le estremità dei PV. Ridurre il tempo di dissezione può aumentare il tasso di successo. Un carico insufficiente di colorante può comportare un rapporto segnale/rumore inferiore e aumentare la probabilità di falsi positivi durante il rilevamento automatico degli eventi. Seguire il protocollo qui delineato dovrebbe garantire un adeguato carico di colorante nei miociti PV.

In sintesi, abbiamo presentato un metodo per registrare i segnali di Ca²⁺ in piccoli PV, che consente di studiare i meccanismi di segnalazione del Ca²⁺ in questo letto vascolare importante ma spesso trascurato. È importante sottolineare che la capacità di registrare i segnali di Ca²⁺ in piccoli PV in condizioni normali potrebbe fornire una preziosa comprensione dei meccanismi patologici per le malattie del polmone, tra cui l'ipertensione polmonare, il danno polmonare e l'edema polmonare indotto da insufficienza cardiaca.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom-Designed SparkAn Software	University of Vermont		https://github.com/vesselman/SparkAn
Fluo-4, AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FN1 Upright Microscope	Nikon
Heater/Temperature Controller	Warner Instruments
Imaging System	Andor
iQ 3.x acquisition Software	Andor
iXon EMCCD Cameras	Andor
Nylon Thread for Tying Blood Vessels	Living Systems Instrumentation	THR-G
Pressure Myography Chamber	Instrumentation and Model Facility, University of Vermont, Burlington, VT, USA
Revolution WD (with Borealis) High Speed Spinning Disk Confocal Imaging System	Andor
Ryanodine	Bio-Techne	1329
Servo Pressure Controller	Living Systems Instrumentation
SS Dissection Pins, 0.2mm dia	Living Systems Instrumentation	PIN-0.2mm
Tubing Pump REGLO	ISMATEC	ISM4212