Hücrelerden arındırılmış elma türevli iskelelerin hazırlanması ve hücre tohumlanması

Başlamak için, McIntosh elmalarını sekiz milimetre kalınlığında dilimler halinde kesmek için bir mandolin dilimleyici kullanın. Elma dilimlerinin hipantyum dokusunu beşe beş milimetre kareler halinde kesin. Kare numuneleri hücrelerden arındırmak için iki gün boyunca %0.1 SDS'ye yerleştirin.

İnkübasyondan sonra, numuneleri deiyonize suyla yıkayın ve gece boyunca oda sıcaklığında 100 milimolar kalsiyum klorür içinde inkübe edin. Daha sonra bu iskeleleri 30 dakika boyunca %70 etanol içinde sterilize edin. Deiyonize suyla yıkayın ve 24 oyuklu bir kültür plakasına koyun.

Hücre tohumlaması için, hücre kültürü koşullarında 10 santimetre çapında hücre kültürü ile muamele edilmiş kaplarda tutulan MC3T3-E1 alt klon 4 hücrelerini kullanın. Ayrıca% 10 fetal sığır serumu veya FBS ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş alfa MEM'den oluşan bir hücre kültürü ortamı hazırlayın. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, onları tripsinizasyon yoluyla kültür kaplarından ayırın.

Hücre süspansiyonunu 200 g'da üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve alfa MEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin. Daha sonra, iskelelerin yüzeyindeki hücre süspansiyonunun 40 mikrolitrelik alikotunun pipetlenmesi ve hücrelerin hücre kültürü koşullarında bir saat boyunca yapışmasına izin verin.

Daha sonra, her kültüre iki mililitre kültür ortamı ekleyin. Kültür ortamını 14 gün boyunca her iki ila üç günde bir yenileyin. 14 gün sonra, hücre kültürü ortamına mililitre başına 50 mikrogram askorbik asit ve dört milimolar sodyum fosfat ekleyerek farklılaşma ortamı hazırlayın.

Bu ortamı kültür plakasına ekleyin. MC3T3-E1 hücrelerinin farklılaşmasını sağlamak için iskeleleri dört hafta boyunca inkübe edin ve ortamı her üç ila dört günde bir yenileyin.