Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu ile Hücresizleştirilmiş Elma Türevi İskelelerin Gözenek Boyutu Ölçümü ve Hücre Dağılımı Analizi

Başlamak için, hücrelerden arındırılmış elma iskelelerini fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Gözenek boyutu ölçümleri için, iskeleleri bir mililitre% 10 kalkoflor beyaz çözelti içinde karanlıkta oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin. İskeleleri PBS ile yıkadıktan sonra, yüksek hızlı rezonanslı konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın ve lazer emisyon filtresi konfigürasyonunu ayarlayın.

Optimum görüntü elde edilmesini sağlamak için lazer gücünü ve dedektörü manuel olarak ayarlayın. Beş mikrometre adım boyutuna sahip 20 görüntüden oluşan bir Z yığını elde edin. Daha sonra ImageJ yazılımında, bir görüntü oluşturmak için maksimum yoğunluk işlevine Z projesini kullanın ve gözeneklerin kenarını vurgulamak için kenarları bul işlevini uygulayın.

Serbest seçim aracını kullanarak gözenekleri manuel olarak izleyin. Her gözeneği bir elips olarak yerleştirin ve ana eksenin uzunluğunu ölçün. Tüm ölçümleri derleyin ve ortalama uzunluğu hesaplayın.

Hücre dağılımının analizi için, uygun ortamda kültüre edilen hücre tohumlu iskeleler PBS ile üç kez yıkandıktan sonra, 10 dakika boyunca %4'lük paraformaldehit ile sabitleyin. Daha sonra her bir iskeleyi deiyonize suyla iyice yıkayın, hücreleri beş dakika boyunca bir Triton X-100 çözeltisi ile geçirgen hale getirin ve tekrar PBS ile yıkayın. İskeleleri bir mililitre% 1 periyodik asit içinde 40 dakika inkübe edin ve deiyonize su ile durulayın.

Daha sonra iskeleleri bir mililitre boyama çözeltisine tamamen batırarak inkübe edin. İskeleleri PBS ile yıkayın ve iskeleleri karanlıkta 10 dakika boyunca mililitre başına beş miligram DAPI çözeltisinde inkübe ederek hücre çekirdeklerini boyayın. Tekrar iyice yıkayın ve iskeleleri PBS'de saklayın.

Burada gösterilen ayarları kullanarak hücre tohumlu iskeleleri 10X büyütmede yüksek hızlı rezonanslı konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüleyin. Optimum görüntü alımını sağlamak için lazer gücünü ve dedektörü manuel olarak ayarlayın ve beş mikrometre adım boyutunda 20 görüntüden oluşan bir Z yığını elde edin. Ardından, konfokal görüntüleri işlemek için ImageJ yazılımını kullanın ve görüntü analizi için z ekseninde maksimum bir projeksiyon oluşturmak için Z projesini maksimum yoğunluk işlevine kullanın.

Konfokal mikroskopi görüntülerinin nicelleştirilmesi, ortalama 154 mikrometre civarında 73 ila 288 mikrometre arasında bir gözenek boyutu dağılımı gösterdi. Gözeneklerin çoğunluğu 100 ila 200 mikrometre arasında değişiyordu. Farklılaşma ortamında kültürlendikten sonra iskelelerde mineral birikintileri gözlenmiştir.

Hücre tohumlu iskeleler, boş iskelelerde gözlenmeyen mineralizasyonu düşündüren opak beyaz bir renklenme sergiledi. Ayrıca, konfokal lazer tarama mikroskobu analizi, iskeleler içinde homojen bir hücre dağılımı ortaya çıkardı.