Başlamak için, 10 santimetrelik bir tabakta kültürlenmiş 293FT hücrelerini alın ve ortamı aspire edin. Hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra bir mililitre tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri tabaktan ayırmak için 37 santigrat derecede 3-5 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, tripsini nötralize etmek için hücrelere dokuz mililitre tam DMEM ekleyin. Homojen bir tek hücre süspansiyonu oluşturmak için tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hemen 20 mikrolitre hücreyi 1.7 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 20 mikrolitre tripan mavisi lekesi ile karıştırın.
Otomatik bir hücre sayacı veya bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Uygun hücre hacmini 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tam DMEM'de seyreltin. Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 10 karbondioksitte inkübe edin. Transfeksiyondan önce, nanolusiferaz CRAF ve 1433 zeta halo plazmitlerini, TE tamponunda bir pCDNA3 boş vektörü ile birlikte seyreltin. Bir dizi steril 1.7 mililitrelik tüpü etiketleyin.
İfade yapılarıyla birlikte her tüpe 100 mikrolitre transfeksiyon ortamı ekleyin. Şimdi iki mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe girdaplayın. Tüpleri bir mikrosantrifüjde kısa bir süre döndürün ve daha sonra transfeksiyon komplekslerinin oluşmasına izin vermek için tüpleri yaklaşık 25 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.
Daha sonra, hücrelere damla damla transfeksiyon kompleksleri ekleyin ve halo ve nano etiketli proteinleri eksprese etmek için 37 santigrat derecede 16-20 saat inkübe edin.
