Başlamak için, modifiye edilmiş Tyrode'un tamponunda uygun kaplama çözeltisini hazırlayın ve sekiz oyuklu bir mikro slaytı 37 santigrat derecede iki saat inkübe ederek kaplayın. Ardından, kaplanmış mikro slaytı modifiye edilmiş Tyrode tamponu ile iki kez yıkayın. Spesifik olmayan yapışmayı gidermek için mikroslaytı mililitre BSA başına beş miligram içeren modifiye Tyrode tamponunda en az 30 dakika inkübe edin.
Yıkanmış trombositleri hazırlamak için, trombositten zengin plazma elde etmek için sitrat antikoagüle edilmiş tam kanı 200 G'de 20 dakika santrifüjleyin. Daha sonra trombositten zengin plazmaya indometasin ve PGE1 ekleyin ve 500 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Elde edilen trombosit peletini, mililitre başına yedi trombosit gücüne göre dört kez 10'luk bir yoğunluk elde etmek için modifiye edilmiş Tyrode'un HEPES tamponunda 37 santigrat derecede yeniden süspanse edin.
İzole edilmiş trombositlerin 37 santigrat derecede 30 dakika dinlenmesine izin verin. Daha sonra, 10 mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için trombosit süspansiyonuna DHE çözeltisi ekleyin ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, blokaj solüsyonunu mikro slayttan çıkarın ve görüntüleme için mikroskop tablasına yerleştirin.
Ardından trombositleri nazikçe dağıtın. DHE'nin 2-hidroksietidyuma dönüşümünü izlemek için ters çevrilmiş konfokal mikroskopta 40X yağa daldırma lensi kullanın. 10 dakika boyunca görüntü, her 10 saniyede bir görüntü toplama.
Bir agoniste yanıt olarak süperoksit anyon oluşumunu izlemek için, trombositleri dağıttıktan 10 dakika sonra çözünür bir agonist ekleyin ve 10 dakika daha floresan görüntüleri toplayın. Bu protokol kullanılarak, trombositlerin kollajen veya fibrinojene yapışması sırasında ve trombin ile uyarılan PLL'ye yapışan trombositlerden süperoksit radikallerinin oluşumu incelenmiştir.
